CFA-Induced模型炎症性皮肤病的迷你猪

文摘

相似性猪和人类皮肤使猪的临床前研究的理想模型皮肤炎症和伤口愈合。完全弗氏佐剂(CFA)已经被用于诱导炎症和炎性疼痛研究几种动物模型。这里,我们评估了炎症引起的CFA注入不同层的皮肤和皮下组织(SC)的大型动物模型。在早期和晚期炎症的程度是评价时间点通过目视检查和病理分析。此外,CFA的副作用注射评估基于临床发现,行为变化,生理状态和组织病理损伤。头猪被注射了CFA的颈部的皮肤在不同的深度。所有的动物在注射部位显示组织学炎症的迹象。动物注射SC没有任何疼痛或痛苦的迹象(食欲不振、异常行为),不需要止痛药。炎症之后通过测量皮下硬结的面积。动物注入表皮真皮和/或表现出严重的炎症反应在皮肤表面大量的肿胀,发红的12小时内CFA注入,在一周内严重皮肤坏死,防止硬化准确度量。 In contrast to animals injected SC, animals receiving intradermal and/or intraepidermal injection of CFA showed signs of distress requiring pain medication.结论。SC注入CFA的猪诱发炎症反应,可以准确测量通过硬化而不造成不必要的不适,提供一个有用的临床前的大型动物模型炎症性皮肤病。

1。介绍

炎症性皮肤疾病是最常见的皮肤问题,影响了超过3500万的美国人,他们每年花费超过20亿美元来治疗症状(https://www.aad.org/media/news-releases/burden-of-skin-disease)。皮肤炎症的过程是复杂的,还不完全清楚。皮肤是最大的器官,占地面积1.5 - 2.0米²,占体重的15%左右(1]。虽然小型哺乳动物如大鼠、小鼠和兔已经使用在皮肤炎症的研究中,这些模型的相关性问题是由于人类的场景主要解剖和生理差异他们的皮肤和人类。相比之下,人类之间有着惊人的相似之处和猪皮让猪非常适合皮肤炎症条件的模型2,3]。这两个物种的毛囊和血管模式相似;都有一个相对厚的表皮,不同的网脊,真皮乳头,密集的在真皮弹性纤维(4,5]。事实上,人类和猪的皮肤几乎难以分辨组织学检查。

组织损伤和炎症动物模型可以分为那些产生炎症的皮肤和皮下组织(SC)。完全弗氏佐剂(CFA)已经被用于诱导炎症和炎性疼痛在几个动物模型研究[6]。这些模型试图模仿人类条件持续或慢性炎性疼痛。

CFA由矿物油、包含一个暂停全部或粉heat-killed分枝杆菌(7]。辅助活动业绩的持续释放的抗原油性存款和刺激当地的先天免疫反应,引起延迟性超敏性反应强烈的炎症反应和痛觉过敏在注射部位出现的(8]。在报告的反应在注射部位出现的都是本地的急性和慢性炎症,肉芽肿反应,皮肤溃疡,局部脓肿,和/或组织脱落。系统性反应也被报道,如分散系统性肉芽肿继发于油乳剂的迁移,adjuvant-related关节炎,和很少,慢性消耗性疾病9]。虽然这些副作用导致严重限制其使用的动物使用委员会,他们让CFA一个优秀的模型来研究不同的炎症过程不同的皮肤层。如果剂量是有限的,担心造成的不良反应注射可以最小化在某种程度上,它被认为是可接受的在动物福利方面,10]。虽然可能存在替代CFA,那些不一样的CFA仍然是黄金标准的再现性和易于管理11]。

炎症性皮肤病是长期的条件和可能需要持续的照顾,经常在一个病人的生命。通过理解细胞事件,参与皮肤炎症的临床前动物模型如猪,我们可能开发治疗性干预措施来治疗这些疾病。

这里我们有测试注入CFA的可行性通过不同的路线在微型猪皮肤炎症模型的大型动物模型。本研究的目的是评估的深度之间的关系注入和皮肤炎症的严重程度由CFA和关联这炎症与动物造成的痛苦。这项研究的结果表明,它是可行的使用CFA在猪以人道的方式不会导致改变动物的幸福如果CFA是远低于皮肤层和注入SC空间。

2。方法

2.1。动物

七MGH迷你猪的,重达35 - 50公斤用于实验。动物们被安置在环境控制条件和随意喂猪的食物和水。所有的实验都是批准和执行符合机构的动物保健和使用委员会。动物被安置移植科学中心按照指南的护理和使用实验动物。所有动物实验机构批准,动物保健和使用委员会(IACUC)的马萨诸塞州综合医院。

2.2。在微型猪注射完全弗氏佐剂

完全弗氏佐剂(1毫克/毫升的分枝杆菌组件)是使用。注入之前,动物进行了镇静和10毫克/公斤的IM氯胺酮,异氟烷维护紧随其后。所有注射完成剃的地区。聚维酮碘的皮肤清洁擦洗和70%酒精。两种注入测试路线:表皮内的/真皮(n = 2)和SC (n = 5)。一个动物(猪# 3)接受了8种不同的注射使用不同针大小来测试不同的CFA注入到SC空间深处。

诱导的炎症反应是通过注入resuspended完成弗洛伊德佐剂(CFA)事先乳化在4种不同的地区在颈部左派和右派的一面。注入的模式如图3。注射部位被命名为1到4。在每个注射部位0.5毫升的CFA注入,总共2毫升/左右。左边是用于每周的活检,而右边是完好无损的,仅用于测量温度和硬结。注射使用不同的针的大小取决于执行被测试的路线从25 g-27g, 15.8毫米和12.7毫米,分别有和没有添加一块7毫米来实现一个更肤浅的注入(图3 (b))。所有的动物注射同一CFA,除了猪# 6被注射了两个不同的大量的CFA评估差异是否硬化或反应可能与不同的CFA大量使用。

2.3。临床评估

CFA注入后,我们使用了初始体重参考价值,评估损失或增加的体重随着时间的推移,这是减肥的百分比来表示。此外,体温、食欲和行为参数用于动物的临床评估。痛苦和悲伤评估所有注射部位触诊时主观确定操纵病变引起不适的猪。

2.4。宏观和病理评价

之前所有的动物进行皮肤活检和白天9 CFA注射后监控水平的炎症。两个(3 - 6毫米)穿孔周围皮肤活检来自CFA喷射在上面提到的天。样本存储在福尔马林、加工和染色)。皮肤炎症斑块组织病理学特征被病理学家盲目地评估。此外,在活组织检查之前,拍摄照片,红肿、硬结,温度进行评估。

3所示。结果

3.1。CFA注入对临床的影响行为

没有一个CFA注入动物研究中患急病的出现。动物注射了SC CFA出现健康并没有出现疼痛或痛苦如食欲不振。无论注射途径,本研究动物的体重在一个时间依赖方式除了SC注射猪# 5只失去了他最初的体重的0.7%(表1)。疼痛评估的发声和回避反应的病变。SC注入动物没有反应触碰自己的病变时,似乎并没有遇险或需要任何疼痛管理。然而,两头猪注射CFA表皮内的和皮内注射(猪# 1和2,分别)出现在疼痛评判他们的发声和回避反应时触碰自己的注射部位。芬太尼贴片是疼痛管理这些动物提供保险而不影响炎症反应(表1)。

3.2。注入CFA的深度决定了皮肤损伤和炎症的程度

宏观上,炎症的红肿和硬化一直出现在接种的网站,但严重依赖的路线和深度注入以目视检查(图1在早期的时间点。皮肤炎症出现CFA注射后12小时内(图1)。面积划分硬化的严重发红和一个大比例的动物进行皮内注射(图1(一));与此形成鲜明对比的是,只有一个小疙瘩是可见的,觉得当动物被注射了SC(图1 (b))。

图2表明,即使在稍后的时间点(9天),炎症和皮肤损伤的程度取决于注射的深度。表皮内的注射造成严重的硬结,发红,皮肤温度和海拔;宏观上、组织坏死、溃疡和吓唬很容易观察到4注射部位白天9篇CFA注入(图2(一个));组织学分析显示表皮层的脱落和大量炎性浸润不仅在表皮,皮层中。此外,小肉芽肿的形成(图就已经存在2(一个))。皮内注射进行猪# 2也导致组织坏死,上皮细胞层的剥蚀宏观和微观,存在严重的炎性浸润的上皮和真皮层(图2 (b))。注射执行SC时,宏观破坏的程度取决于注射的深度。例如,网站# 4是最肤浅的注入在5.7毫米深度导致严重的硬结,发红,一个小溃疡,和温度的变化(图2 (c))。组织学证据表明炎症浸润在表皮和真皮层被发现。当注入了SC的深度约15.8毫米,皮肤炎症的宏观表象是不太严重,触诊,只觉得小硬结节(图2 (d))。组织学炎症浸润在SC层主要是观察肉芽肿的存在开始形成在注射后9天;存在小的浸润灶有时出现在皮肤层(图2 (d))。最后一种动物是肌肉层由于无意中注入不同厚度的SC层。宏观的皮肤炎症几乎不可见,触诊,只觉得小气泡的硬化。疫源地的炎性浸润在SC组织,观察组织学与肉芽肿性炎症是更广泛的涉及骨骼肌肉层。巨细胞肉芽肿中也观察到,除了大片的中央坏死(图2 (e))。

确定皮肤炎症的程度与注入深度,而不是动物个体的反应不同,CFA注入,4种不同的SC深度测试在同一动物在复制(图3(一个))。(图2不同针仪表使用3 (b))。站点1被注射一个25克(15.8毫米),基于SC的针的长度最终组织为15.8毫米。网站2被注射针相同,但随着添加一块7毫米,导致注射深度8.8毫米到SC空间(15.8 7毫米= 8.8毫米)。网站使用27-gauge 3注射针长度为12.7毫米,指示一个注射部位在12.7毫米深入SC组织。最后,注射部位4 # 3是在类似的方式进行,但随着添加一块7毫米,指示执行注射在5.7毫米深,因此皮肤空间。这是最肤浅的注入导致更严重的炎症反应,当观察到宏观上(数据3(一个)和3 (b))。

3.3。组织学的变化在不同的注入深度

如图3并证实了解剖图所示4(一)包含所有三层,皮肤厚度范围1.5到4厘米。CFA在注射部位在猪# 3 # 1在15.8毫米深度进入主要深SC空间的局部炎症浸润。组织松散的上皮样肉芽肿的存在也观察到在这个级别注射后9天,其中一些包含中央坏死和巨细胞。有一定程度的炎症细胞浸润在真皮(图4 (b))。在注射部位# 2 8.8毫米深度,有相当程度的细胞在皮肤层渗透和SC组织,一些肉芽肿形成也存在(图4 (c))。在注射部位# 3 12.7毫米深度,渗透主要是出现在SC空间和肉芽肿形成发生组织坏死。此外,渗透也是真皮(图中4 (d))。最后,注射部位# 4在5.7毫米深度接近皮肤的表皮层出现的损失由于严重坏死和血管周围炎性浸润浅和深真皮(图4 (e))。

3.4。宏观肉芽肿形成后CFA注入SC组织和肌肉

CFA使用25 g针注射后,长15.8毫米,CFA造成大量肉芽肿形成的SC空间猪的皮肤厚度范围之间(图3和图4厘米5(一个));这样大规模的肉芽肿占领整个SC空间的长度(3-4cm)(图5(一个))。我们确认在SC肉芽肿组织基质的存在,与参与的深入真皮和局部表面的真皮。然而,当皮肤的厚度小于3厘米,如猪的# 7,CFA是注入到肌肉层尽管使用相同的针的长度。肌肉注射引起的CFA大量肉芽肿大约5厘米(图5 (b))。组织学检查我们观察到某种程度的炎症浸润到深SC炎症组织,但是大多数是在肌肉,在大量的观察与巨细胞肉芽肿和中央坏死(图5 (b))。

4所示。讨论

与啮齿动物的皮肤、狗、或非人灵长类动物,猪皮肤类似于人类皮肤的表皮结构网脊,毛囊结构和密度,汗腺和皮下脂肪(12]。由于这些和其他原因,猪被认为是一个优秀的平移动物模型在许多领域的生物医学研究(3,13]包括炎症的研究[14,15和皮肤移植物抗宿主病16]。完全弗氏佐剂是一种含有死亡,水在油乳剂干分枝杆菌已被用作一种佐剂增强抗原性和增强免疫反应(8,17,18]。CFA被用于几种炎症模型由于其能够引起强烈的炎症反应在注射部位出现的(19]。

虽然已经有许多报道关于CFA的使用在不同的物种,它们中的大多数都是报道啮齿动物和兔子等小动物(11,18),人类皮肤的皮肤形态截然不同。在这里,我们描述我们的经验使用CFA的临床相关的猪模型引起的皮肤炎症。

在这项研究中,我们表明,炎症和疼痛的程度影响动物的健康取决于注射的深度比CFA注射的剂量和体积。我们使用减肥,减少食品消费,体温,疼痛,一般情况的指标我们动物的痛苦。我们注入了大量的CFA分成4到8网站(每个尺寸收到0.5毫升的1毫克/毫升杀分枝杆菌),这是两到四次的最大浓度目前建议减少严重不良炎症反应(10,17,20.]。使用这些剂量,我们没有观察到任何妥协在动物的福利,但我们能够清楚地评估炎症的程度取决于注入的路线。

考虑到体重的增加被认为是动物福利的一个重要指标,观察到的一致的增加10到20%在所有动物的初始重量的抗研究清楚地表明,幸福不是妥协(表1),不管CFA注入路线。

疼痛是推断由于抓挠行为,减少运动活动的动物,减肥,发声时受影响的网站是感动,和减少这些行为在阿片类药物的管理。尽管大型肉芽肿的形成深度SC组织在所有SC注入动物,没有变更行为,体重下降,体温、食欲、疼痛或痛苦被观察到。然而,这并非如此当动物被注入更多的表面上(表皮或真皮浅),观察局部皮肤坏死和溃疡。这些动物表现出痛苦和悲伤,虽然没有观察到减肥,他们需要疼痛管理和伤口护理自己的皮肤损伤。

CFA是一种油性成分,当注入扩散到周围组织引起炎症反应。血管各自在本层援助循环促炎的运输代理。然而,在表皮的情况下,血液供应不足,导致CFA的监禁和无法运输促炎的药物,因此观察到的一个更严重的坏死。

之前的报告认为,SC后肉芽肿病变的发展注入CFA是痛苦和不幸的动物,即使没有临床证据支持这个理论21]。这些假设负责严格规定,目前对CFA的使用。虽然我们承认,有一个严重的炎症反应CFA注入表面上时,证明了我们(n = 2)动物表皮内的或注入表面的真皮,反应是不一样的,和动物没有显示的迹象,当注射执行更深的痛苦和悲伤。

我们发现SC厚度可能发生显著的变化在年龄相仿的猪,可能是因为身体得分。猪# 7体重低于其他猪,这可能导致异常SC薄层在这个动物和无意的肌内CFA注入引起的。

考虑到猪的皮肤厚度的变化将是非常有益的,以避免交付CFA在一个不受欢迎的地点,因此避免损害动物的福利。使用实时可视化的注射针放置足够的超声波(22)可以提高准确性和确认交付的欲望CFA的位置。仔细选择路线的注入是因此完善免疫的关键协议和避免潜在的副作用,可能阻碍动物的福祉。这是实现时,我们已经证明,动物不会感到疼痛或痛苦和幸福不是妥协。此外,我们证明了CFA是一个适当的模型来研究在大型动物皮肤的炎症。炎症反应可以充分评估不仅通过组织学,但无创,只需测量硬化的病变,可以准确地完成当动物皮下注射23];或评估病变的耗氧量我们之前的报道指出[24]。因此,这项研究提供了安全使用的证据CFA以人道的方式当妥善管理到SC空间。

缩写

CFA:

完全弗氏佐剂。

数据可用性

作者声明,所有相关数据支持本研究的发现文章中可用的信息文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

温州市Navarro-Alvarez和黄Christene a设计项目;温州市Navarro-Alvarez Beatriz m . m . Goncalves,亚历克·r·安德鲁斯进行实验;温州市Navarro-Alvarez Christene a黄,亚历克·r·安德鲁斯和大卫·h·萨克斯导致数据分析;温州市Navarro-Alvarez写的手稿;和所有作者批准了最终版本。

确认

作者要感谢支持CO6RR020135-01设施用于生产建设和维护的迷你猪。这项工作通过研究部分支持的礼物Eliaz疗法,Inc .)

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