文摘

背景。过敏的患病率是全球稳步增加;然而,发病机制尚不清楚。我们假设鸟型分支杆菌无性系种群。副结核(MAP)可能导致过敏的发展。这种生物可以存在于乳制品,可以引出一个免疫调节开关从Th1 Th2反应,它一直在猜测与几位人类的自身免疫性疾病。确定贡献,从99人血清和各种过敏性疾病和45健康nonallergic控制评估总IgE水平,先后为映射为特定IgE ELISA。结果。平均血清总IgE水平过敏患者国际单位/毫升,健康对照组国际单位/毫升(AUC = 0.88;)。在病人组,50 99受试者增加IgE总水平≥150国际单位/毫升,而49受试者IgE≤150国际单位/毫升(平均水平:国际单位/毫升与国际单位/毫升;)。此外,6与IgE 50名受试者(12%)≥150国际单位/毫升和没有与IgE≤150国际单位/毫升(0%)是积极的为特定的地图IgE (AUC = 0.63;)。结论。目前的研究显示,地图能够诱导特定的IgE和可能导致过敏性炎症诱导的基因倾向的个体。

1。背景

由于免疫失调疾病的发病率也增加在发达国家(包括自身免疫性疾病、过敏1,2]。人们一直认为,只有环境因素的改变可以调节人体免疫系统,但尚未澄清的触发因素。过敏性疾病常见的病因和诱导因素,包括环境,遗传素质(3,4),粘膜屏障功能障碍(5共生微生物群(),变更,6,7]。过敏是免疫耐受的障碍。在实验动物模型的过敏,几个佐剂等完全弗氏佐剂,氢氧化铝(8),霍乱毒素(9),酵母聚糖(10),以及粒子的过敏佐剂效应(11),已被认为是至关重要的因素过敏的感应。众所周知,分枝杆菌及其组件已被众多的佐剂和免疫疗法的基础;尤其是完全弗氏佐剂用于引起强烈的体液和细胞免疫反应在与动物实验12]。因为没有研究到目前为止分枝杆菌的作用在人类过敏的发病机理,我们评估的变应原性鸟型分支杆菌亚种副结核(地图)及其可能对这些疾病的发病机制的贡献。

地图是一种胞内病原体导致副结核在反刍动物(慢性细菌性肠炎),慢性肉芽肿性肠炎导致全球乳制品行业的重大经济损失(13]。

由于病理相似之处副结核和人类克罗恩病(CD),胃肠道的一种慢性炎症性肠病,地图一直怀疑病因代理人CD由于频繁的映射为特定DNA的检测及其罕见的隔绝病变(14]。实验CD型结肠炎抗原诱导的版图也表明地图引导CD[的效力4]。地图也与其他自身免疫性疾病,如1型糖尿病、多发性硬化症,桥本甲状腺炎(15- - - - - -18]。

映射到牛奶的脱落是众所周知的在受感染的牛,和有很多的证据映射污染牛奶、奶酪、婴儿奶粉、牛肉肉(19,20.]。细菌也可以在巴氏灭菌过程(21]。因此food-born路线的地图的存在从动物对人类很可能暴露20.]。seroprevalence最近的一项研究证明了存在的免疫球蛋白G(免疫球蛋白)子类模式对地图亲脂性的抗原(20.在健康的日本人。特别感兴趣的,检测IgG4提供长期的抗原刺激的证据(22]。

此外,口腔接触诱导肠道结核分枝杆菌是重要的在人类和牛副结核。最近的疫苗研究为野生动物结核病的控制显示,口服的heat-killed分枝杆菌刺激宿主免疫(23,24]。

在此基础上的证据,我们假设口腔接触抗原可以依次映射到调节宿主免疫的发展使过敏。在目前的研究中,我们研究了过敏的个人和健康对照组的血清(高碳钢)映射为特定的上下文中IgE的IgE水平。据我们所知,这是第一个报告显示更大的存在映射为特定的血清IgE过敏individualswith总IgE nonallergic相比更高水平的人。

2。材料和方法

2.1。参与者和样品

共有99名受试者报告过敏(F / M = 74/25;平均年龄:),45岁,sex-matched高碳钢不过敏(F / M = 31/14;平均年龄:从Sangenjaya医院的医疗人员)登记,东京,从3月到2014年4月。所有受试者使用调查问卷和采访给了他们的书面知情同意。他们中的许多人有敏感过敏食物和/或共同的高空过敏症。人口统计学和临床特征的病人报告在表1。所有参与者招募在目前的研究中被种族日本至少三代,没有使用任何类型的抽样前免疫抑制药物。5毫升的肝素化血液样本来自每个参与者。通过离心分离后,血清储存在−20°C,直到测试通过ELISA。

研究协议,知情同意的文件,和调查问卷表被人类Sangenjaya医院伦理委员会批准(批准文号:2014.3.7)和Tohto健康科学学院(批准文号:H2511)。

2.2。抗原

(写明ATCC 19698株)和准备的地图卡介苗(BCG)(172年东京应变)亲脂性的抗原进行正如前面发表(20.]。地图亲脂性的抗原是一种乙醇(原油)提取的地图和其抗原性是由于脂质(氯仿可榨出的)而不是蛋白质(水)分数25]。脂质部分的分析进行了薄层色谱法显示,它包含映射为特定脂质,和其中一个是主要的细胞wall-associated映射为特定lipopeptide Para-LP-01 [26]。后者,也称为lipopentapeptide (L5P),能够诱导宿主体液反应和区别地图鸟型分支杆菌无性系种群。hominissuis和鸟型分支杆菌无性系种群。鸟结核(27]。

2.3。测量总和映射为特定血清IgE ELISA

商用的IgE ELISA定量设置工具(美国TX Bethyl实验室Inc .,蒙哥马利)是用于检测人类IgE血清根据制造商的协议。检测组件提供了一个亲和纯化山羊反IgE抗体(Ab),标准,和辣根过氧化物酶(合)共轭山羊反IgE检测Ab(用于稀释1:40000)。样品和标准在重复运行。

血清具体IgE地图亲脂性的抗原通过间接ELISA测定(25]。人类血清的吸收分枝杆菌phlei之前测试的价值在消除错误的积极反应的ELISA检测Abs对地图(28]。事实上这一步部分删除打Abs,它提供了高特异性[28]。

Sumilon ELISA 96 -孔板(ms - 8496 f,住友电木有限公司,有限公司,东京,日本)被涂上一层50μ信用证的稀释亲脂性的抗原在室温下过夜。第二天,阻止了300μ信用证的阻塞一个解决方案(Nacalai Tesque,京都,日本)在室温下与孵化一小时。与300年的盘子洗了三次μL / PBST(10毫米磷酸盐,pH值7.0,0.5%渐变20)。重复了每个样本的96孔板。100μ信用证的preabsorbed血清样本在1:100稀释,稀释缓冲(PBST)然后添加和孵化在室温下了两个小时,紧随其后的是一个额外的清洗步骤。HRP-labeled山羊反IgE多克隆Ab(美国马里兰州盖瑟斯堡SeraCare生命科学,,)(1:1000稀释)添加和孵化在室温下了两个小时,随后清洗步骤。绑定合共轭于100年被添加μ信用证的确定蓝色储备三甲Microwell过氧化物酶底物(美国SeraCare生命科学,马里兰州)和吸光度测量的波长450 nm通过使用Bio-Rad iMark标(Bio-Rad、东京、日本)。数据归一化到一个积极控制血清中包含所有化验,Ab的反应被设定为10000任意单元(AU) /毫升。消极的控制(抗原和二级Ab)也包括和平均值减去所有的样品。

2.4。抑制试验

评估地图的特异性抗原刺激腹肌响应,验证是否cross-recognition地图和其他分枝杆菌之间发生时,一个使用BCG抗原的ELISA抑制。波士顿咨询公司属于结核分枝杆菌复杂,远离鸟型分支杆菌复杂,担心其他航线的博览会。在任何情况下,所有的受试者参与研究总量作为分母和地图这股票不同与BCG抗原(29日];这可能会导致假阳性反应。

一个抑制试验进行了使用两种血清池(测试在两个独立的实验中,每个池是由三种血清anti-MAP IgE + /免疫球蛋白−科目)如前所报道(8]。简而言之,盘子被涂上一层地图亲脂性的抗原和孵化在室温下过夜。抑制化验一夜之间由preincubating血清池在4°C的饱和浓度地图BCG抗原和抗原(添加积极的控制)。第二天,血清池受到ELISA板涂有地图上亲脂性的抗原。后续步骤完全相同的间接ELISA检测Abs如上所述。

2.5。统计分析

GraphPad Prism 6.0统计软件(La Jolla、钙、美国)被用于分析的数据。耶茨确切概率法与修正是用来比较平均血清总IgE水平主题之间总IgE≥150国际单位/毫升(考虑病理)和≤150国际单位/毫升(正常或临界范围)和比较IgE水平之间的过敏患者和高碳钢。

关于特定的地图IgE效价,比较Mann-Whitney使用的组测试。所有统计测试是双面的显著性水平为0.05,所有结果报告为中位数±四分位范围。最优截止值的计算是通过一个接受者操作特征(ROC)曲线分析,设置特异性为95%,与相应的灵敏度相应选择。优势比(或)以95%可信区间(CI)也计算。

3所示。结果

3.1。总IgE Ab血清水平

平均血清总IgE水平过敏患者国际单位/毫升,而在高碳钢国际单位/毫升(AUC = 0.88;)(图1(一))。50 99名患者(F / M = 40/10;平均年龄:)研究增加IgE总水平≥150国际单位/毫升,而49个科目(F / M = 34/15;平均年龄:40.5±10.8)的IgE≤150国际单位/毫升。患者平均血清总IgE水平高IgE水平是407±256国际单位/毫升,而在较低的受试者IgE水平是106±16个国际单位/毫升()。

血清总IgE水平负与年龄和性别有关。相比之下,血清总IgE水平与敏感性不同的过敏原。50个高总IgE水平≥150国际单位/毫升,21例(42%)敏感的至少一个过敏食物(鲭鱼、咸食物,鸡蛋白、牛奶、芒果、虾、蟹、和小麦)(OR = 1.2;95%置信区间:0.5—-2.8)。25对高空过敏症受试者(50%)敏感,15对柳杉花粉(OR = 1.2;95%置信区间:0.5—-2.8)和10个日本柏树(OR = 0.97;95%置信区间:0.4—-2.6),4例(8%)有过敏食物和吸入过敏原(OR = 1.3;95%置信区间:0.3—-6.3)。此外,40个科目(80%)习惯性消费进口产品(或= 3;95%置信区间:1.2—-7.3)。

3.2。检测对象映射为特定IgE的高总IgE水平

关于对映射为特定抗原的体液反应,我们测试所有过敏对象考虑的血清总IgE水平。如图1 (b)6的50例(12%)受试者的IgE≥150国际单位/毫升和0的49(0%)的IgE≤150国际单位/毫升为特定的anti-MAP IgE是积极的。两组之间的关系被认为是统计学意义(AUC = 0.63;)。这六个病人的平均血清总IgE水平是472±237国际单位/毫升。映射为特定IgE Abs没有发现(图1 (b))在高碳钢组;过敏之间的关联对象与IgE≥150国际单位/毫升和高碳钢是统计学意义(AUC = 0.65;)。

在六个积极的主题,五个是女性,另一个是男性(OR = 1.3;95%置信区间:-12 - 0.1)。四是对柳杉过敏(日本柳杉粳稻)和两个日本柏树(Chamaecyparis obtusa)(OR = 1.3;95%置信区间:-10 - 0.2)。注意所有的积极主题首选消费进口奶酪和牛奶,和他们两个也对牛奶过敏。

关于anti-MAP免疫球蛋白效价(之前报道)8)、双积极性(anti-MAP IgE和anti-MAP免疫球蛋白)被发现在一个六anti-MAP IgE阳性患者;因此我们不能否认这种可能性的竞争或免疫球蛋白免疫球蛋白g自身抗体的存在在这个主题(IgE30.]。

interassay变异系数(CV)(相同的血清测试在三个独立的实验中)的间接elisa范围从5.4%到8.5%,而intra-assay简历(相同的血清测试20复制wells)从1.9%到3.3%不等。

3.3。Anti-MAP和Anti-BCG针对亲脂性的抗原的抗体交叉反应

接下来,我们的存在与否决定cross-recognition地图和BCG之间通过抑制ELISA酶标法使用两个血清池。关于地图亲脂性的抗原的特异性,我们通过抑制实验证实anti-MAP和anti-BCG Abs目标表面亲脂性的抗原可交叉反应的。事实上,对血清池测试,BCG抗原不能够显著阻碍Ab-binding指向地图抗原,导致信号只略有下降(11 - 15%),而地图抗原(积极控制)抑制血清池的信号测试(79 - 82%)(图2)。

4所示。讨论

目前的研究显示,日本人anti-MAP-specific IgE,积极的人总IgE水平较高的呼吸道过敏。我们发现统计上显著的高水平的特定anti-MAP IgE六个受试者的血清总IgE≥150国际单位/毫升,在所有的科目的IgE≤150国际单位/毫升。这个令人惊讶的结果显示地图首次抗原可以引起人类特定的IgE反应。这些证据可能的发病机制提供了一个新的视图过敏增加全球(2]。考虑到牛副结核病的发病率和污染水平的地图抗原在乳制品在逐年增加31日),还有一种可能性,口腔接触抗原可以增加地图。自牛副结核病的发病率很低在日本,日本的人口可能会接触到地图通过受污染的奶制品从西方国家进口,副结核的患病率很高(20.]。

在我们的研究中,所有的IgE积极受试者受过敏引起的高空过敏症,经常食用奶制品进口。因此,它是可能的,这些人经常暴露于过敏原到相同的程度,他们暴露于抗原口头地图。

过敏性疾病的发病率是全球稳步增加(2)包括在日本(32]。这可能是由于削弱了免疫耐受性或增强的反应环境抗原(33]。环境影响过敏的作用仍然是一个开放的话题,目前还不清楚哪一种免疫调节机制可以通过致病性抗原刺激和环境之间的相互作用发生免疫系统(33]。

据报道,地图有一个更强大的能力导致宿主巨噬细胞il - 10与其他分枝杆菌(34- - - - - -37]。地图多态PPE蛋白质有更强的能力诱导宿主体内il - 10的表达,从而抑制生产Th1-related干扰素等细胞因子(21)和增强Th2反应(il - 4)的表达。这些地图抗原被认为是武器损害最强大的宿主细胞免疫防御系统,实现慢性感染在牛35]。现象,刺激宿主Th1、Th2在感染的不同阶段18)非常类似于人类麻风(38,39]。

另一个可能的地图和过敏之间的联系是基于分子模拟机制。事实上,Blast-p分析显示,主要的抗原肽的柳杉花粉过敏原哭j 1 (KVTVAFNQF) [40)股票与几个地图羟化酶蛋白质序列同源性。这些蛋白质存在6个保守氨基酸残基(TVALNQF)相同的哭j 1序列的86%。一个假设的解释是,地图组件可能和自己或与外国抗原交叉反应抗原,主机将在几乎永久接触,这可能会改变宿主的监管状态没有地图的感染。的确,在免疫反应在此专性胞内病原体,会扩大autoreactive监管细胞,如FoxP3 +或FoxP3−Treg细胞(41],它可以不断地激活自身抗原,即使细菌清除的自然免疫反应(42]。我们注意到几个大地图的例子与人类自身抗原已报告(16- - - - - -18]。

总之,尽管分枝杆菌抗原通常被认为表达下调的IgE反应正常化的Th1、Th2平衡(43),我们的数据表明,地图抗原能诱导特定的IgE生产。地图可以扮演一个角色在ige过敏炎症由于(1)分枝杆菌抗原的辅助功能(3),(2)il - 10诱导自然,和(3)连续抗原与免疫刺激的食物。MAP-contaminated产品的消费可能是地图的接触抗原的载体。

5。结论

目前的研究显示,地图能够诱导特定的IgE和可能导致过敏的感应基因倾向的个体。

信息披露

当前的雇主d . Cossu博士是美国神经学、顺天堂大学医学院113 - 8421年,日本东京。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者欣然承认Drs。y Mori、k . Nishimori和y下地的国家动物卫生研究所(NIAH)提供heat-killed分枝杆菌抗原。这项工作是支持的日本促进社会科学(jsp) KAKENHI批准号23240061。作者也承认国家数学研究所的支持和生物合成(NIMBioS)。