文摘
有缺陷的组织修复和重塑是慢性阻塞性肺病(COPD)的主要方面病理生理学。骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)与这个方向,作为他们的功能障碍和招聘可能导致疾病的发展和进步。本研究首次描述迁移相关趋化因子受体的表达及其配体在BM-MSCs慢性阻塞性肺病患者。趋化因子受体CXCR4 / SDF1a和CCR7 / CCL19-CCL21 mRNA水平进行评估BM-MSCs获得十二个COPD患者和7个健康的捐赠者。SDF1a血清蛋白水平和BM-MSCs条件媒体也被评估。趋化因子受体CXCR4、SDF1a CCL19, CCL21 mRNA水平显著降低在慢性阻塞性肺病BM-MSCs CCR7水平是无法觉察的。值得注意的是,SDF1a蛋白质水平轻微升高患者血清和BM-MSCs的条件SDF1a媒体而增加血清水平与疾病严重程度显著相关慢性阻塞性肺病。我们的研究结果显示转录后的调控BM-MSCs SDF1a水平的COPD患者和SDF1a和趋化因子受体CXCR4差别明显对这些基因的mRNA指示SDF1a参与的信号通路在疾病病理生理学。
1。背景
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是定义为一个“共同预防和治疗的疾病,其特征是持续的气流限制,通常与一个增强的进步和相关的慢性炎症反应在气道和肺有害颗粒或气体。“加重,个别患者的并发症导致总体严重程度(1]。慢性阻塞性肺病是全球主要的死亡原因之一,与巨大的社会和经济负担2]。因此,它估计第五发病率的最常见原因,到2030年全球死亡的第三大原因(3]。吸烟,被确立为主要病因的慢性阻塞性肺病的发展,诱发的恶性循环上皮损害,受损的组织修复和重建。然而,尽管大量的研究在慢性阻塞性肺病,确切的病理生理机制尚未完全清楚。
间充质干细胞(msc)(基质)细胞是多功能基质细胞,可以从骨髓,分离骨骼肌,羊水,和脂肪组织等组织。他们是塑料贴壁细胞向脂肪细胞分化潜能,软骨细胞和成骨细胞4]。沃特曼等人最近提出,msc可极化促炎MSC1人口或免疫抑制MSC2表型,依赖他们的接触特定的刺激5]。因此,很可能msc起到至关重要的作用在维护上皮完整性和肺部疾病的发病机制。在过去的几年里,动物模型的实验数据显示,msc的贡献组织再生在某些elastase-induced肺气肿等肺部疾病,导航网站asbestos-induced肺损伤的组织重构在肺动脉高压,在哮喘慢性气道炎症,减少肺泡和肺液平衡和恢复endotoxin-induced后急性肺损伤(6- - - - - -11]。因此,在体外的治疗潜力极大的兴趣扩展MSC已经注意到许多疾病的治疗(12- - - - - -14]。骨骨髓来源msc被激活和迁移到受伤的网站通过机制尚未完全阐明。该网站的吸引力肺损伤机制是通过生产可溶性粒细胞集落刺激因子和集落刺激因子等因素,导致MSC增殖和迁移通过基质细胞衍生因子(SDF)——1-CXCR4轴(15,16]。同样,从安东尼奥由于等人之前的数据显示,超表达的趋化因子受体CXCR4在特发性肺纤维化(IPF)的患者17]。此外,CCR7及其配体CCL19和CCL21最近被认为是另一个趋药性的轴msc (18,19]。因此,由干细胞趋化因子及其受体表达的变化可以表示缺陷在这些细胞的迁移能力。
当前研究的目的是调查可能BM-MSCs参与慢性阻塞性肺病的病理生理学评估基因的表达参与扩散/迁移过程,也就是说,CCR7 / CCL19 CXCL12a / CXCR4和CCL21配体/受体二分体。
2。方法
2.1。道德和患者数据
本研究是依法进行的修改赫尔辛基宣言。克里特岛的研究大学伦理委员会批准了研究协议和书面知情同意从19个学科获得进入研究之前(412年决定,18/06/2014协议编号为14724)。其中,12个参与者被诊断为慢性阻塞性肺病,根据黄金准则,是当前或人至少曾20-pack-year吸烟历史和FEV1 / FVC的比例< 70%,可逆性的吸入β2受体激动剂(< 10%或< 200毫升绝对改善20.]。六个健康吸烟个人,定义为吸烟者没有气流限制,和一个健康的烟民,FEV1预测的80%以上,是招募和匹配年龄和吸烟史,尽可能密切。
2.2。肺功能测试
肺功能测试,包括与bronchodilation测试和DLCO测量肺量测定法,是由所有参与者与计算机系统(MasterLab;2.12、Jaeger维尔茨堡,德国)根据标准化的指导方针。
2.3。血液样本集合
外周血血清样本,从所有参与者获得和储存在−80°C,经过适当的准备,根据标准程序。
2.4。BM-MSCs收集和文化
BM-MSCs取自髂嵴后吸入物和培养体外如前所述17,21]。总之,BM单核细胞(BMMCs)孤立histopaque - 1077(σ,圣路易斯密苏里州)培养杜尔贝科的修改鹰中低葡萄糖(DMEM-LG;Gibco表达载体,佩斯利苏格兰)/ 10%胎牛血清(FCS);美国犹他州洛根Hyclone) / 100国际单位/毫升penicillin-streptomycin (PS, Gibco)介质(MSC)的浓度为2×105细胞/厘米2在25厘米2培养瓶在37°C大气湿温度/ 5%的二氧化碳。播种一至三天后,漂浮细胞被移除和媒介被新鲜的MSC介质所取代。细胞通过70 - 90%融合达到时,使用0.25% EDTA trypsin-1毫米(Gibco)。msc被确定形态学和immunophenotypic特征及其潜在的区分三种不同的途径,即脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞。
2.5。Immunophenotypic msc的特点
BM-MSCs从第二通道(P2) immunophenotypically以流式细胞术对anti-CD73使用反人类单克隆抗体(AD2;圣地亚哥正欲Dickinson-Pharmingen CA), anti-CDw90 (F15.42;Immunotech / Coulter) anti-CD105 (SN6;伯林盖姆Caltag, CA)、anti-CD45 (IMMU19.2;Immunotech / Coulter) anti-CD14 (IM2580U;beckman coulter)和antiCD34 (QBend10;beckman coulter)。数据处理在一个史诗精英流式细胞分析仪(库尔特、迈阿密、FL)。
2.6。实时反向Transcriptase-Polymerase连锁反应试验
BM-MSCs在P2在试剂盒均相试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA),总RNA提取,互补脱氧核糖核酸合成的逆转录(RT) Thermoscript RT工具包(表达载体)。mRNA表达测量使用实时rt - pcr检测和SYBR-Green i Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为内部控制,为了SDF-1a正常化,趋化因子受体CXCR4, CCR7, CCL19, CCL21表达水平。计算每个样本的相对表达水平。表中列出使用的mRNA-specific引物1。
2.7。趋化因子血清中蛋白质含量和媒体BM-MSCs条件
MSC SDF-1a水平条件媒体P2和血清进行评估通过ELISA (Quantikine;研发系统,明尼苏达州。、锰)。
2.8。统计分析
使用IBM SPSS统计v21.0的结果进行了分析。使用非参数Mann-Whitney统计检验和值被表示为中位数(四分位范围)。斯皮尔曼等级系数(ρ)是用来评估疾病严重程度之间的相关性(FEV1% pred)和趋化因子表达。的值 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。人口结构和肺功能
表2显示患者的数据。慢性阻塞性肺病之间没有明显差异,对照组在年龄、性别、吸烟情况、历史和身体质量指数(BMI)。肺功能测试结果如表所示3。正如预期的那样,有统计上显著的差异COPD患者和控制在1秒用力呼气量(FEV1%, 49%和107%,分别地。 )、用力肺活量(FVC %, 64%和103%,分别地。 )和FEV1 / FVC的比例(分别为60%和79%, )。
3.2。BM-MSCs识别和Immunophenotypic特征
BM-MSCs慢性阻塞性肺病和健康受试者的P2和随后在immunophenotypic特点和分化能力的特征。Immunophenotypic分析表明存在同质细胞群CD73阳性,CD90、CD45和CD105和消极,CD14、CD34抗原(表4)。此外,msc被发现能够区分脂肪形成的,成骨,chondrogenic血统。
3.3。SDF1a / CXCR4轴
趋化因子受体CXCR4 mRNA水平相对较低的BM-MSCs COPD患者,如图1(一)显示器。特别是,趋化因子受体CXCR4的表达差别明显对这些检测在慢性阻塞性肺病与对照组相比(0.05和0.87的相对表达水平,分别地。 、表5)。
(一)趋化因子受体CXCR4 BM-MSCs mRNA的表达
(b)由BM-MSCs SDF1a mRNA的表达
BM-MSCs SDF1a mRNA水平也显著降低COPD相对于健康受试者(0.03和0.32的相对表达水平,分别地。 ,图1 (b)、表5)。有趣的是,SDF1a BM-MSCs条件媒体蛋白质含量增加COPD组中,发现尽管增高无统计学意义(5570和2995 pg / ml, )。
此外,血清SDF1a水平更高的COPD患者与健康受试者相比;然而,我们的研究结果没有达到统计学意义(6358和3941 pg / ml, ,图2)。
值得注意的是,由BM-MSCs SDF1a mRNA表达和血清蛋白水平呈正相关疾病的严重程度(黄金阶段)(ρ= 0.59, ρ= 0.63, 、职责)。最少、SDF1a mRNA水平FEV1%预测指数呈现负相关的慢性阻塞性肺病患者(ρ=−0.57, ,图3)。
3.4。CCR7 / CCL19-CCL21轴
实时rt - pcr显示没有检测到CCR7 mRNA表达两组。然而,其配体的表达下调BM-MSCs慢性阻塞性肺病患者。具体来说,CCL19(0.001和0.02, ,图4(一))和CCL21(0.00和0.04, ,图4 (b))mRNA水平显著降低COPD BM-MSCs相比控制(表5)。
(一)由BM-MSCs CCL19 mRNA的表达
(b)由BM-MSCs CCL21 mRNA的表达
4所示。讨论
我们的研究旨在描述趋化因子和趋化因子受体的表达间充质干细胞的迁移等SDF1 CCR7 / / CXCR4和CCL19 CCL21轴,在BM-MSCs COPD患者与健康受试者相比,相似的年龄和吸烟史。有趣的是,我们的研究结果显示趋化因子受体CXCR4 mRNA表达降低了BM-MSCs从慢性阻塞性肺病患者获得暗示可能损害他们的迁徙的能力。同样,从COPD组间充质细胞表达SDF1a mRNA水平较低,CCL19, CCL21与控制;然而,在病人组SDF1a信使rna与疾病严重程度呈正相关。此外,SDF1a发现血清蛋白水平升高的患者组和疾病的严重程度呈正相关(黄金阶段)表明慢性阻塞性肺病SDF1a通路的激活。因此我们的研究表明,趋化因子受体CXCR4 / SDF1a轴在慢性阻塞性肺病的病理生理学的作用可能会导致管制的干细胞从骨髓迁移能力。
慢性炎症和缺陷修复机制被认为是慢性阻塞性肺病的开发和进展的关键机制(22,23]。最近,间充质干细胞已被用于一些动物和人类研究疾病的潜在治疗选择,由于其抗炎和修复效果(24- - - - - -27]。我们队此前调查的角色SDF1 / CXCR4轴在特发性肺纤维化BM-MSCs迁移,与通常的间质性肺炎(类风湿性关节炎17,28]。足立等人表明,骨髓移植小鼠的疗效与肺气肿而气肿小鼠移植诱导疾病在正常的,表明骨髓的主要作用在这种疾病的病理生理学29日]。
干细胞疲劳和衰老被认为是潜在的致病的机制在慢性阻塞性肺病30.]。它可以假设一个障碍BM-MSCs迁徙能力的可能在慢性阻塞性肺病患者促炎的效果。我们的结果显示减少mRNA表达CXCR4在BM-MSCs COPD患者与健康受试者相比。然而,我们没有发现一个逆相关性趋化因子受体CXCR4 mRNA表达与慢性阻塞性肺病的阶段。一些研究人员已经证明了由间充质干细胞趋化因子受体CXCR4表达的重要性的中介交易(31日- - - - - -33]。最近,杨等人表明,趋化因子受体CXCR4 msc提高自导和殖民的过度受损的肺组织,此外抑制急性肺损伤动物模型(31日]。在另一项研究中,布斯托斯等人发现,年龄BM-MSCs减少了迁徙和抗炎能力和趋化因子受体CXCR4的表达下调的基因在这些细胞(32]。mRNA表达的趋化因子受体CXCR4在BM-MSCs降低COPD患者在我们的研究中可能因此提供证据的一个缺陷在这些细胞的迁移特性,因此降低动员和发挥保护作用的能力。刘、谢已经证明降低COPD患者内皮祖细胞数量和迁移能力受损,尤其是低水平的趋化因子受体CXCR4表达(34]。我们所知,目前的研究是第一个研究提供的证据表明,慢性阻塞性肺病影响趋化因子受体CXCR4 BM-MSCs的mRNA表达。
我们的结果也显示增加SDF1a血清水平的COPD患者,虽然没有达到统计学意义。SDF1a通路的激活可能会由于在慢性阻塞性肺病患者的肺部炎症和组织损伤,我们发现SDF1a水平升高可能指向这个方向;然而这一假设需要进一步调查。进一步支持了这种假设,SDF1a血清水平与慢性阻塞性肺病阶段的正相关,表明蛋白质含量的协会疾病的严重程度。SDF1分泌组织损伤导致网站的祖细胞和BM-MSCs迁徙率的增加18,35,36]。张等人已经证明SDF1和缺氧诱导Factor-1a (HIF-1a)是参与调控msc的肺功能和导航COPD大鼠模型(37]。我们的研究表明,SDF1a也诱导慢性阻塞性肺病。
发现培养BM-MSCs SDF1a表达的是有趣的。SDF1a mRNA表达在慢性阻塞性肺病间充质细胞相比显著降低控制但蛋白质水平条件媒体在COPD组高。我们的数据意味着存在转录后的调控在慢性阻塞性肺病BM-MSCs SDF1a生产的。众所周知,msc表示SDF1但它的作用尚未完全阐明38]。Lisignoli等人已经证明了逆相关性趋化因子受体CXCR4和msc SDF1表达式,表明抑制趋化因子受体CXCR4表达的自分泌环(39]。类似的发现是由胎儿msc的Pelekanos等人在他们的研究中,但自分泌环趋化因子受体CXCR4表达不足以完全解释他们的结果(40]。似乎有多个分子途径涉及SDF1a表达和分泌msc。有趣的是,SDF1a mRNA表达在慢性阻塞性肺病组显示正相关与疾病的严重程度与血清的SDF1a水平。这个结果被证实,正如预期的那样,通过SDF1a mRNA水平的显著负相关FEV1%预测。SDF1a mRNA表达和分泌的影响msc在COPD患者中,根据上述数据;尽管这似乎进一步表征SDF1a表达式的监管是必需的。
另一个趋药性的轴,研究了作为一个可能的监管机构间充质干细胞迁移CCR7及其配体CCL19 CCL21 [41]。CCL19和CCL21差别我们的研究结果显示,对这些基因的mRNA转录SDF1a COPD患者类似,而没有检测到表达BM-MSCs CCR7在慢性阻塞性肺病和控制。虽然不是广泛调查,CCR7 CCL19 / CCL21轴也被卷入msc趋化性和组织修复18]。围捕等人已经证明,CCR7在调节炎症反应中起着重要作用在航空公司在慢性阻塞性肺病,和吸烟调节CCR7, CCL19, CCL21 mRNA表达野生型小鼠淋巴结(42]。CCL19和CCL21 mRNA水平被发现在慢性阻塞性肺病BM-MSCs显著降低,同样的趋化因子受体CXCR4和SDF1a mRNA。减少在mRNA水平也可能与衰老相关BM-MSCs之前建议在COPD发病机理(30.]。
有限制在我们的研究中,需要提及。首先,样本容量有限的实际困难病人招聘是值得注意的。然而,这是一个飞行员/指导研究,研究体外BM-MSCs COPD患者,根据我们的结果,应该扩展到更大的患者群。此外,由于慢性阻塞性肺病是一种异质性疾病,不同疾病阶段可能反映在BM-MSCs属性,在未来的研究应该考虑。考虑到吸烟可能影响的迁移BM-MSCs即使在无慢性阻塞性肺病者,我们的研究的另一个限制是缺少一群健康的非吸烟者。未来研究比较BM-MSCs吸烟者和非吸烟者之间的迁徙能力可以提供新知识关于吸烟的影响干细胞。
总之,我们的研究趋化因子受体CXCR4 mRNA表达的差别演示了一个对这些BM-MSCs在COPD患者中,首次提供证据从人类研究趋化因子受体CXCR4 / SDF1轴是特异表达在慢性阻塞性肺病。此外,它也表明,慢性阻塞性肺病影响血清和BM-MSCs SDF1a水平。虽然还需要进一步的研究,我们建议潜在缺陷在迁徙能力BM-MSCs可能妥协他们的保护作用,导致慢性阻塞性肺病的开发和发展。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
目前的研究协议已经获得资助在2008年从胸希腊社会。