文摘

恶性贫血(PA)是一种自身免疫性疾病抗体目标内在因素和壁细胞,减少病人的维生素b12吸收能力促进萎缩性胃炎。羟钴胺素的治疗指南是基于排泄数据从健康人50年前获得的。这手稿描述了使用佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)在上皮炎症刺激低品位大肠癌细胞系methylcobalamin和羟钴胺素的疗效进行评估。一氧化氮显著增加细胞暴露于高剂量的PMA (100 ng / ml, 150 ng / ml,和200 ng / ml)伴随着失去鹅卵石形态学特点没有负面影响细胞活动和生存能力。显著减少一氧化氮产量与200 pg / ml羟钴胺素,与回归鹅卵石形态学特征。这项研究强调了PMA的使用促进人类细胞系的低级炎症模型胃自身免疫疾病相关的炎症;而且它提高钴胺素的浓度问题管理临床恢复细胞功能,真正地使病人获得更有规律地减少数量的维生素,为病人提供类似于饮食摄入量的水平。

1。介绍

炎症性肠条件往往患有维生素b12缺乏症患者(1]。它也可以导致恶性贫血(PA)自身免疫状况与萎缩性胃炎导致进一步胃炎症。在萎缩性胃炎壁细胞(2对H)毁于自身抗体⁺K⁺atp酶表面的细胞(3]。这种破坏会导致分泌的减少内在因素(如果)糖蛋白(4)所必需的维生素b12的吸收(5]。口服维生素B12试点;然而只有8%的英国病人调查在口腔或舌下药物(6]。肌内注射是治疗最常见的管理形式。未经处理的维生素b12缺乏症导致心理症状,如抑郁,焦虑,阿尔茨海默氏症。亚急性脑变性是一个严重的但常见症状表现为全身无力、感觉异常、步态异常,僵硬,四肢无力(7]。

氰钴胺素是一个重要的水溶性维生素(8需要作为蛋氨酸合成酶的辅酶和methylmalonyl-CoA变位酶(4),在DNA的甲基化和三羧酸循环,分别。氰钴胺素是一种有机金属化合物周围带有科林环形结构钴分子(9]。身体不能合成的,必须从饮食。氰钴胺素存在于四种形式:羟钴胺素,methylcobalamin,维生素b12, adenosylcobalamin。Methylcobalamin和adenosylcobalamin生物活性形式的维生素b12 (10而羟钴胺素和维生素b12是不活跃的。在先前的研究活动形式的维生素b12是预防细胞死亡引起同型半胱氨酸(增加11]。同型半胱氨酸水平升高之前与心肌梗死的风险增加和阿尔茨海默氏症。与蛋氨酸合成酶Methylcobalamin,作为辅酶,将同型半胱氨酸和蛋氨酸。因此,并不奇怪,98%的患者维生素b12缺乏会增加总同型半胱氨酸水平(12]。

推荐的治疗注射维生素b12维生素b12缺乏症。在英国病人接受皮下注射羟钴胺素每12周(6];然而64%的参与者的调查PA社会(英国)不满意他们的治疗(6下注射)由于症状复发前。至关重要的是,病人得到有效和适当的治疗自己余下的生命,以确保一个良好的生活质量。在英国当前的BNF治疗方案是根据1968年的一篇论文(7]研究了氰钴胺素排泄。他们发现不活跃的羟钴胺素在体内保留更长时间比活性维生素b12。然而,群体很小,总共13,和所有的参与者被诊断为PA, B12不足,或相关的运输问题。据我们所知,没有进一步的研究在学科与PA或相关胃炎理解疾病的影响在钴胺素排泄或更重要的是其直接的细胞效应。

一氧化氮(NO)与胃发炎,还有没有合酶(NOS)。这些已经被证明有助于炎症的病理导致细胞细胞毒性(13]。氰钴胺素的生物活性已被证明会降低不,因为没有将绑定到科林环形结构的钴胺素(14]。2009年的一项研究发现,羟钴胺素是抑制NOS的最有效形式的维生素b12 (14]。

Caco-2细胞是人类结肠恶性腺瘤细胞系,用来模拟胃上皮细胞近30年15]。利用Caco-2细胞体外模型模拟胃炎症(16]在腹腔疾病发现十四烷酸结合佛波醇酯(PMA)和干扰素-γ是最好的诱导物的生产,因此炎症。另一项研究发现PMA就足以导致Caco-2炎症细胞干扰素-相比虽然下级γ(15]。在这个实验模型炎症将单独使用PMA诱导模拟低水平的急性胃炎症。

本研究的目的是开发一个体外模型能够模拟低品位胃炎症和使用该模型来研究临床相关的活动水平的维生素b12所定义的早期研究,最终提高我们当前活跃的和不活跃的外源因素的影响之间的理解在发达胃炎症模型。

2。材料和方法

2.1。胃炎症研究

Caco-2细胞亚文化的subcultivation比1:5在DMEM 10%的边后卫(37°C, 95%啊₂,5%的公司₂);1×10⁵细胞被播种在24-well盘子和允许坚持24小时。细胞被掺入了佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA)(0、50、100、150和200 ng / ml)孵化24和48小时。孵化后媒体被移除和离心机,格里斯化验和MTT检测处理,分别。

2.1.1。没有生产

格里斯化验(英国Promega):磺胺的解决方案是添加到50μl在黑暗中每个样本和孵化前的N - (1-naphthyl)乙二胺盐酸盐(NED)。孵化后吸光度是阅读在520海里。检测极限是2.5μ米(125 pmol)亚硝酸盐。

2.1.2。细胞活性

MTT(英国Sigma-Aldrich)添加到剩下的水井,孵化;甲瓒晶体在井使用MTT溶解溶液溶解和吸光度测量在570海里。

2.1.3。细胞生存能力和形态

二乙酸5-Chloromethylfluorescein在DMSO (10μ米)(σ)添加到井和孵化与媒体(的边后卫DMEM + 10%)之前在福尔马林固定(3.7%)和共焦显微镜下观察(英国徕卡)。

2.2。活性氰钴胺素毒性研究

在1×10 Caco-2细胞被播种⁵并允许坚持24小时。细胞被掺入了methylcobalamin临床相关的浓度(表1)和孵化24小时。上层清液和细胞是没有生产(部分处理如上所述2.1。1使用MTT(部分)和细胞生存能力2.1。2)。

2.3。体外模型研究

Caco-2细胞被播种(1×10⁵)24-well盘子和允许在DMEM坚持24小时10%的边后卫(37°C, 95%啊₂,5%的公司₂)。细胞被掺入了150 ng / ml phorbol-12-myristate 13-acetate和methylcobalamin(0、200、500、750和1000 pg / ml)或羟钴胺素(0、200、500、750和1000 pg / ml)和孵化24小时37°C, 5%的公司₂。上层清液和细胞加工生产使用格里斯试验(部分2.1。1通过MTT试验(部分)和细胞生存能力2.1。2)。使用phalloidin和罗丹明染色观察细胞形态;这些细胞被固定在3.7%福尔马林在无菌PBS和孵化前洗phalloidin若丹明;孵化后染料被除去,样本在共聚焦显微镜下观察。

2.4。统计数据

所有统计信息确定使用单向方差分析和图基的方法使用Minitab统计软件和95%置信区间。

3所示。结果

3.1。胃炎症研究

3.1.1。一氧化氮产量

Caco-2细胞孵化PMA显示积极的显著增加细胞一氧化氮的生产与100年,150年和200年相比ng / ml细胞孵化50 0和ng / ml PMA ()(图1)。

3.1.2。细胞活性

细胞孵化PMA 24和48小时显示细胞活性的增加。细胞孵化24小时表现出显著增加细胞活性从100 ng / ml 150岁到达顶峰,200 ng / ml,在细胞活动的吸光度明显大于0,50和100 ng / ml ()。细胞在48小时内展示了最伟大的活动;确实有一个显著增加细胞活性的细胞培养48小时();然而活动趋于稳定并增加PMA的浓度没有影响细胞活动(图2)。

3.1.3。细胞生存能力和形态

观察形态学变化控制细胞之间没有PMA和孵化的孵化150 ng / ml的PMA和超过24小时以上。控制Caco-2细胞表现出典型的鹅卵石形态(图3(一个)),细胞相似规模的胚珠的形核。相比之下,与150 ng / ml PMA显示细胞形态学的改变外观;细胞聚集,但已经失去了典型的鹅卵石形态和常规核,而细胞表现出更多的非典型细胞核(图3 (b)白色箭头)与可识别的丝状伪足和铝型材(数据没有显示)。

3.2。活性氰钴胺素毒性研究

3.2.1之上。没有生产

细胞孵化methylcobalamin证明相比没有显著变化没有释放控制,和活性维生素b12水平达到5倍超额的临床标准显示,生产水平无显著差异()(图4(一))。

3.2.2。细胞活性

没有明显统计学差异Caco-2细胞活性与不同浓度的methylcobalamin(24小时孵化后)(图4 (b))()。

3.3。体外模型研究

3.3.1。Methylcobalamin

有一个显著增加细胞活性与750 pg / ml methylcobalamin PMA methylcobalamin相比其他浓度()(图5(一个))。没有显著的统计学差异没有生产细胞之间有和没有在同一浓度的PMA methylcobalamin(图5 (b))()。细胞的形态(图6)显示不同的变化与添加methylcobalamin细胞孵化。当临床价值最低的孵化methylcobalamin 200 pg / ml(图6 (c))细胞细长而不是鹅卵石;他们有一个减少细胞质和细胞表面粗糙,他们似乎已经失去了他们的能力形成单层相比控制Caco-2细胞(图6(一))。事实上,他们的整体外观看起来类似于细胞PMA控制(图6 (b))相关的细胞表面粗糙也改变原子核的形状和倾向更飙升细胞形态。细胞孵化剂量最高的methylcobalamin 1000 pg / ml显示一个混合的细胞群,组织培养的塑料展示一个更加圆润的形态,有一个很大的圆形的细胞核和细胞质比类似于细胞的控制(图6(一)),但这些与细胞控制满是许多细胞更具代表性的PMA控制更不规则的细胞核和细胞质的减少(图6 (b))。

3.3.2。羟钴胺素

没有观察到显著差异在细胞活动和PMA ()(图7(一))。然而,没有显著降低生产的200 pg / ml羟钴胺素(图7 (b))()。成像的细胞形态突出显示一个明确的形态变化Caco-2细胞孵化PMA和羟钴胺素(图8)。所述细胞孵化PMA演示一个不规则的核和缺乏典型的鹅卵石形态(图8 (b))中,其中显示丝状伪足扩展。细胞孵化150 ng / ml羟钴胺素开始演示数量与细胞的特性展示常规核和更少的预测(图8 (c))。细胞进一步类似于控制细胞暴露在1000 pg / ml羟钴胺素(图8 (d)),细胞形状和大小有成为常规;然而细胞尚未形成明确的集群在控制细胞(图8(一个))。

4所示。讨论

在这项研究中,使用PMA诱导的炎症如陈和基茨所述15]。PMA激活蛋白激酶C (PKC)在上皮细胞(17通过模仿甘油二酯,PKC的天然配体。它被用来促进炎症体外(15,16,18和体内19]。200毫克/毫升PMA显示最大的增加没有生产(图1)以及最大的增加细胞活性(图2)。然而,明显提高细胞活性和没有生产从浓度低至100 ng / ml的PMA。细胞形态显示清晰的改变从细胞集群的形成光滑的鹅卵石外观粗糙表面形态的单个细胞核较大,细胞不均匀的PMA(图3)。类似的形态变化被观察到在其他的研究中,在细胞孵化PMA和干扰素-γ显示变化时使用相差显微镜(查看16]。由于炎性疾病中激活的阴险的性质集中PMA 150 ng / ml的被选为模型生成这个剂量显著增加细胞活性与适度增加生产可与低品位炎症有关。

在毒性研究中,我们使用了生物活性形式的维生素,methylcobalamin,因为它可以作为辅酶的细胞没有转换。临床相关的剂量使用在本研究中,以反映当前的治疗方法。methylcobalamin没有任何明显的增加细胞活性(图4(一)(图)或在任何生产4 (b))。这些数据证实缺乏胃上皮细胞毒性的methylcobalamin消耗值大于5倍的上限氰钴胺素(5000 pg / ml)。支持这么高的浓度和缺乏毒性的临床试验在日本,在周围神经病变患者治疗25毫克/天IV methylcobalamin [20.五个月)超过10天。这是2.5×10¹⁰倍的推荐剂量PA患者给出1毫克/毫升每8 - 12周。这些高剂量对病人没有副作用,这是由我们的体外模型。同样,高浓度的活性氰钴胺素在临床上用于治疗氰化物中毒在非常高剂量的连续重复4 - 5 g /天(11]。报道的副作用只有短暂的荨麻疹的皮疹;因此与极高的毒性很小剂量在短期内。

体外模型开发了观察的影响萎缩性胃炎的胃上皮细胞,为细胞的作用可以与疾病的进展和发展有关。在这个模型中炎症是通过添加150 ng / ml PMA。这个浓度被认定为没有生成增加生产的细胞与细胞形态学变化,提出了这两个反映的变化与低品位炎症相关的细胞功能,确定临床患有自身免疫状况。观察不同外源因素的影响,临床相关的剂量与模型被孵化。

形态学变化有助于改变函数;个人Caco-2细胞在炎症条件下观察到在这个模型中分离连续单层关联到一个功能齐全的胃粘膜,因此失去信息紧密连接的正常的文化。缺乏连续的单层和损失的紧密连接本身可以作为炎症引发加剧的情况,可能导致慢性炎症与胃癌等并存状况有关。相似的超微结构的改变也被卷入改变细胞增殖和细胞动力学的影响的结构、功能,完整的上皮衬里22]。

细胞在这个模型中证明的能力回到更典型的形态学postinflammatory刺激与更高水平的维生素b12孵化后,给予更多的临床急性病理条件反射模型的特点是过度生产在肠道,导致渗透率的增加细胞、炎性疾病的潜在触发(20.]。

Methylcobalamin显示没有可观察到的差异的抑制(图5);然而这可能是蒙面的增加细胞活性观察到更高浓度的炎症刺激(图5)。

这可能是由于可用性的生物活性形式纳入到正常细胞的DNA甲基化和三羧酸循环过程假设[1]。它也可能是这些过程的upregulation阻止了methylcobalamin的可用性的目的没有抑制作用。这意味着基本细胞功能的优先级对其保护作用。尽管缺乏可观察到的没有抑制,细胞形态学研究强调了返回的形态更让人想起控制细胞的生物活性氰钴胺素在炎症刺激。

相比之下不活跃的羟钴胺素没有显示出显著的增加细胞活性(图6 (b)),加上一个趋势在免费提供的数量没有减少炎症刺激。的确,细胞间有显著差异孵化PMA和羟钴胺素在200和500 pg / ml没有PMA和各自的同行。羟钴胺素的生物活性性质可能防止其直接吸收到细胞过程,因为它需要转换成methylcobalamin才能使用的细胞(17),允许它保持可用“拖”的内生没有。细胞预处理与不活跃的氰钴胺素已经在先前的研究指出防止细胞凋亡的过程(23]。

减少在任何浓度的外源因素突显了但不是重要的在这些研究中;提出,这是由于低品位的模仿炎症状态。桦树et al。24)进一步证明氰钴胺素的抗氧化潜力赋予它能够减少浓度。同样,研究也表明增加转运蛋白运钴胺素蛋白在急性和慢性炎症状态(11]。

Methylcobalamin服务降低同型半胱氨酸通过蛋氨酸合成酶蛋氨酸,与ATP保证了RNA的甲基化,DNA和蛋白质的形成与内皮细胞功能障碍和活性氧(ROS)包括号(11]。因此,维生素b12缺乏症患者具有抑制能力降低和增加不生产,促进永远与系统性炎症状态的临床影响。事实上,同型半胱氨酸水平的增加与细胞凋亡的诱导人类骨髓基质细胞,人类脐静脉内皮细胞,内皮祖细胞;所示的细胞凋亡是由预处理与活性氰钴胺素预防新陈代谢(21]。

临床可接受的血浆维生素b12的浓度范围在各国各不相同。在英国,病人被认为是边缘异常时,钴胺素水平在120年和180年之间pg / ml和低于120 pg / ml是异常的结果12]。在亚洲国家,下限是500 pg / ml [21]。这种差异意味着患者被认为是正常的在欧洲国家会被认为是有一个低氰钴胺素在其他地方,所以维生素b12缺乏症患者将会错过治疗,导致病情进一步恶化之前诊断对病人造成极大的痛苦。在这项研究中,低浓度的维生素b12 (200 pg / ml)受益胃上皮细胞在炎症环境中通过恢复正常胃细胞形态学的一些特性;然而,细胞仍然相当典型的形状和大小。可以说,患者症状和氰钴胺素水平低于500 pg / ml应该接受维生素b12治疗体内的水平可能不足以减少过度的炎症。这将英国的正常下限线与亚洲。

氰钴胺素缺乏的推荐治疗是不够的对大量患者(8];其症状是系统性的维生素b12在DNA复制和呼吸的重要性。本研究表明,PMA是低品位的合适的诱导物胃炎症;它强调不同形式的维生素b12可能更适合治疗由于其能力与细胞过程。这项工作已强调水平低于目前管理促进有益细胞效果;整体还需要进行更多的调查研究来定义基于细胞活动与健康的最佳治疗方法,定义的不系统性健康个体的宽容。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

由于恶性贫血是由于社会提供外源因素在这个项目中使用。