文摘
中耳炎(OM),特点是粘液过度生产和过度的存在在中耳炎症,童年是最常见的感染。Nontypeable流感嗜血杆菌(NTHi)病原体负责大约三分之一的差异OM。目前治疗细菌性OM依靠全身使用抗生素,这常常会耐多药耐药菌株的出现。因此,迫切需要开发替代疗法的策略控制OM粘液生产过剩。MUC5AC粘蛋白已被证明OM的发病机制中发挥重要作用。在这里,我们表明,姜黄素是从姜黄植物是一个强有力的抑制剂NTHi-induced MUC5AC在中耳上皮细胞粘蛋白的表达。姜黄素抑制MUC5AC表达通过抑制激活p38 MAPK的移植MAPK磷酸酶MKP-1。因此,我们的研究发现姜黄素作为一个潜在的治疗抑制粘蛋白生产过剩在OM上调MKP-1,已知的炎症的负面调节器。
1。介绍
粘蛋白粘液糖蛋白是一个主要组成部分在中耳分泌物,气管,消化和生殖。粘液生产代表一个保护性的先天防御机制保护和润滑的上皮和陷阱入侵病原体清除由黏膜纤毛的清除系统(1]。然而,在慢性感染,多余的粘蛋白损害黏膜纤毛的清除系统,导致粘液积累和贫穷mucus-lined上皮大片的函数。~ 24粘蛋白基因的确定至今MUC5AC粘蛋白可以扮演关键角色在上呼吸道感染的发病机制包括中耳炎(OM)。OM的特点是粘液的存在生产过剩和过度炎症在中耳2,3]。患者的OM,增加粘液渗出到耳朵的鼓室损害的运动鼓膜、中耳骨、导致听力问题。更高浓度的中耳积液中粘蛋白已被证明与听力障碍的程度(4,5]。而粘蛋白upregulation是一个重要的先天防御反应的主机在中耳感染,多余的粘蛋白可以导致受损的黏膜纤毛的清除和传导性听力损失(2]。因此,必须严格控制粘蛋白的表达。
Nontypeable流感嗜血杆菌(NTHi)代表大约三分之一的剧集的OM的原因。目前治疗细菌性OM依靠全身使用抗生素,这常常会多药物耐药性菌株的出现(6,7]。NTHi疫苗的发展仍然是一个挑战由于高NTHi菌株的遗传多样性和高抗原变异性surface-exposed抗原(8,9]。因此,迫切需要开发替代治疗NTHi感染的治疗策略。以前的研究已经表明NTHi上调MUC5AC通过toll样受体转录- (TLR)依赖p38 MAPK和转录因子的激活AP-1 [10]。由于p38 MAPK参与多种细胞过程,治疗抑制它可以在长期的不利影响。因此识别小说以最小的副作用强烈期望的治疗策略。
姜黄素,一个黄色色素的粉末姜黄,据报道,具有广泛的药理作用,包括抗氧化,抗肿瘤,抗炎,抗菌,抗糖尿病的属性11]。姜黄素不存在dose-limiting毒性,从而更容易长期使用以最小的副作用(12]。姜黄素被列为通常被认为是安全的”(GRAS)”由美国食品和药物管理局。尽管其对多种疾病的多效性的影响,生物利用度差了姜黄素的主要限制使用(12]。我们最近报道了姜黄素的抑制作用NTHi-induced中性粒细胞招募OM的小鼠模型(13]。然而,姜黄素的作用在调节MUC5AC黏液,OM病理学的主要因素,仍有待评估。
在这项研究中,我们表明,姜黄素抑制NTHi-induced MUC5AC表达在体外和体内中耳上皮细胞。姜黄素抑制MUC5AC表达通过抑制p38 MAPK通过诱导负监管机构,MKP-1。因此,我们的研究提供了证据表明姜黄素的抗炎作用在治疗NTHi-induced OM通过抑制MUC5AC粘蛋白生产过剩。
2。材料和方法
2.1。试剂和抗体
姜黄素和放线菌素D从σ购买。从恩佐SB203580购买生命科学。MUC5AC抗体(sc - 21701)和MKP-1 (sc - 370)购买的圣克鲁斯生物技术。Anti-mouse HRP-linked抗体(# 7076)购买从细胞信号技术。Anti-mouse Alexa 488 -共轭抗体(A11029)和anti-rabbit Alexa 488 -共轭抗体(A21206)从生活购买技术。
2.2。细胞培养
人类中耳上皮细胞在DMEM (HMEECs)种植和维护(Cellgro)补充BEGM SingleQuots (Lonza), 10%胎牛血清和100 U /毫升青霉素和100年μg / ml链霉素(Gibco)在湿润5%二氧化碳气氛在37°C。
2.3。菌株和文化条件
NTHi临床分离菌株12日,2627年和9274年被用于这项研究[14,15]。NTHi是如前所述[准备13]。体外实验NTHi resuspended在DMEM和使用在感染复数(MOI) 50。体内实验,NTHi resuspended在等渗盐水和使用浓度CFU /鼠标。细胞被抑制研究使用姜黄素1 h NTHi刺激之前。后处理研究细胞用姜黄素治疗后1 h NTHi刺激。
2.4。质粒,转染和荧光素酶检测
表达质粒,为既定的活动(CA)形式的MKK3 (MKK3b (E)和MKK6 (MKK6b (E)和显性负突变形式的人们α(fp38α(AF))和p38β(fp38β2 (AF)),一直在前面描述的(16]。MUC5AC-Luc荧光素酶记者向量和AP-1 MUC5AC-Luc荧光素酶的突变体记者描述了向量之前(17]。Myc-MKP-1超表达质粒被描述之前(13]。瞬时转染都使用交通- lt - 2020执行转染试剂(Mirus)根据制造商的协议。转染后细胞化验48 h。空载体转染是控制。pRL -Renilla荧光素酶向量是从Promega。荧光素酶活性测定使用Dual-Luciferase记者分析系统(Promega)。MUC5AC荧光素酶活动正常化Renilla活动。
2.5。rna介导的干扰
人类pSUPER-shMKP-1击倒的构造(如前所述18使用交通- lt - 2020)转染转染试剂(Mirus)根据制造商的协议。转染后细胞化验48 h。
2.6。实时定量PCR (Q-PCR)分析
总RNA提取试剂盒试剂,根据制造商的协议(技术)。TaqMan逆转录试剂被用来执行反转录反应(应用生物系统公司)。实时定量PCR反应是使用快速执行SYBR绿色大师(应用生物系统公司)和混合放大和量化StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司)。mrna的相对数量计算使用比较Ct方法,规范化的控制,还有人类或鼠标glyceraldehyde-3-phosphate (GAPDH)。人类(h)和鼠标(m)引物序列hMUC5AC, hMKP-1, hCyclophilin, mMUC5AC, mGAPDH引物序列[描述以前18]。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)
HMEECs刺激了NTHi 12 h。细胞培养基是收获和离心机在12000 g×10分钟沉淀细胞碎片。上层清液被直接ELISA法化验如前所述[19]。OD用基准+微型板块分光光度计测量。MUC5AC蛋白质浓度在上层清液由正常化的对照组。
2.8。免疫荧光染色
细胞生长在18毫米圆形玻璃盖玻片(VWR)。NTHi刺激后,细胞用4%多聚甲醛固定,其次是孵化与初级抗体1:100 - 1:400稀释。Alexa-conjugated二级抗体被用来检测主要抗体。盖玻片被安装到玻璃幻灯片使用VECTASHIELD HardSet不变色安装介质与DAPI(向量)。与荧光显微镜图像记录系统(BZ-X710显微镜和BZ-X观众,BZ-X分析仪成像系统,日本基恩士)。
2.9。老鼠和动物实验
C57BL / 6小鼠(杰克逊实验室)。麻醉小鼠接种NTHi通过transtympanic路线。抑制研究小鼠腹腔内注射(i.p)与姜黄素(50毫克/公斤)前1小时或1 h NTHi后接种。总RNA提取的中耳解剖老鼠。所有动物实验进行了以下指导方针批准的乔治亚州立大学动物保健和使用委员会制度。
2.10。体内免疫荧光试验
免疫荧光测定,formalin-fixed石蜡包埋鼠标中耳组织切片在4μ米厚度和挂载玻片上。MUC5AC蛋白质检测使用鼠标anti-MUC5AC小学和Alexa 488 -共轭山羊anti-mouse二级抗体如前所述[18,19]。盖玻片被安装到玻璃幻灯片使用VECTASHIELD HardSet不变色安装介质与DAPI(向量)。与荧光显微镜图像记录系统(BZ-X710显微镜和BZ-X观众,BZ-X分析仪成像系统,日本基恩士)。
2.11。统计分析
所有的实验都重复至少三个独立的时期。数据被表示为平均值的标准偏差(其中)。统计学意义与未配对学生的评估以及对数据有两个条件()和方差分析(图基的事后)紧随其后的数据超过两个条件(22),使用SPSS统计软件(IBM)。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果与讨论
3.1。姜黄素抑制NTHi-Induced MUC5AC表达中耳上皮细胞在体外和体内
姜黄素抑制中性粒细胞迁移,报道早期炎症反应(OM NTHi感染模型13]。进一步评估治疗OM姜黄素的抗炎作用,我们确定姜黄素的影响在MUC5AC粘蛋白表达,OM的发病机制的主要因素。姜黄素预处理抑制NTHi-induced MUC5AC mRNA表达方式存在剂量依赖的相关性HMEECs(图1(一))。姜黄素会抑制MUC5AC mRNA表达HMEECs刺激与其他常见OM-causing NTHi菌株2627和9274(图1 (b)),这表明姜黄素的抑制效应的普遍性MUC5AC粘蛋白。我们下一个决定如果姜黄素抑制MUC5AC转录通过确定的活动MUC5AC promoter-driven荧光素酶向量。姜黄素抑制NTHi-induced MUC5AC转录(图1 (c))。姜黄素的抑制作用MUC5AC蛋白质含量也证实了ELISA(图1 (d)通过免疫荧光染色(图)1 (e))。符合体外研究发现,姜黄素预处理抑制MUC5AC中耳的mRNA表达小鼠接种NTHi(图1 (f))。姜黄素抑制蛋白MUC5AC表达在鼠标中耳组织(图1 (g))。因此,这些数据表明,姜黄素抑制NTHi-induced MUC5AC粘蛋白表达在中耳上皮细胞在体外和体内。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.2。姜黄素抑制NTHi-Induced通过抑制p38 MAPK MUC5AC的表达
接下来,我们试图确定姜黄素抑制MUC5AC表达的机制。p38 MAPK信号通路已被证明是中介NTHi-induced炎症反应的关键。我们以前报道,NTHi上调MUC5AC表达通过激活p38 MAPK [10]。在最近的一项研究中,我们表明,姜黄素抑制NTHi-induced p38磷酸化(13]。因此,我们决定如果姜黄素通过抑制p38还能抑制MUC5AC表达激活。MAPK激酶MKK3和MKK6上游p38 MAPK的活化剂。MKK3激活p38α只有,而MKK6 p38激活α和人们β亚型。超表达持续活跃的(CA)形式的MKK3 (MKK3-CA)或MKK6 (MKK6-CA)显著诱导MUC5AC表达,而姜黄素抑制MKK3-CA或MKK6-CA-induced MUC5AC表达(图2(一个))。以确定姜黄素通过抑制p38抑制MUC5AC表达,我们使用多种方法。预处理与姜黄素或SB203580 (p38激活的特定抑制剂)单独明显抑制NTHi-induced HMEECs MUC5AC的表达。然而,cotreatment姜黄素随着SB203580没有进一步抑制MUC5AC表达(图2 (b))。与p38抑制剂数据一致,姜黄素未能进一步抑制NTHi-induced MUC5AC表达HMEECs转染与显性负(DN)突变形式的p38: p38αdn和p38βdn(图2 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
AP-1是p38 MAPK的主要下游转录因子。序列分析MUC5AC的启动子区域显示的存在两个AP-1碱基对之间的转录因子结合位点位于3576 / 3570年和3535−−−−3529。选择性诱变的这些网站显示远端AP-1网站(3570−3576 /−)是必要upregulation MUC5AC转录,而近端AP-1网站(3535 / 3529−)是参与MUC5AC的负调控转录(17]。因此,为了进一步确定其中哪些AP-1网站参与curcumin-mediated MUC5AC转录抑制,我们使用野生型MUC5AC启动子,远端AP-1突变MUC5AC的推广者,近端AP-1突变MUC5AC含有荧光素酶启动子向量。姜黄素预处理抑制NTHi-induced转录野生型和近端AP-1突变MUC5AC子构造,虽然姜黄素没有进一步抑制转录的远端AP-1突变MUC5AC启动子(图2 (d))。这些发现表明,姜黄素通过抑制转录抑制MUC5AC阳性AP-1(远端站点)通路。这些数据表明,姜黄素抑制NTHi-induced MUC5AC表达通过抑制MKK3/6-dependent p38 MAPK的激活。
3.3。姜黄素抑制NTHi-Induced MUC5AC表达通过Upregulation MKP-1磷酸酶
MAP激酶Phosphatase-1 (MKP-1)已被证明是一个关键的负面调节器通过脱磷酸作用MAPKs炎症。我们之前报道,MKP-1负监管机构的NTHi-induced MUC5AC表达通过抑制p38 MAPK [20.]。我们先前表明,姜黄素明显增强NTHi-induced MKP-1 mRNA和蛋白表达水平。同样的研究表明,姜黄素抑制p38 MAPK磷酸化通过upregulation MKP-1表达式(13]。因此,很可能姜黄素抑制NTHi-induced MUC5AC表达通过一个类似的机制。我们第一次证实姜黄素增加NTHi-induced MKP-1表达式通过免疫荧光染色(图3(一个))。评估如果提高姜黄素的存在的MKP-1蛋白质水平是增加MKP-1转录的结果,我们采用放线菌素D (ACT-D)转录抑制剂。预处理与ACT-D大大减少NTHi-induced MKP-1 mRNA的表达。在ACT-D面前,姜黄素不能提高MKP-1 mRNA表达NTHi刺激(图3 (b))。这些结果表明,姜黄素增加MKP-1表达式通过转录激活。接下来,我们证实MKP-1 MUC5AC监管的作用。MKP-1过度抑制NTHi-induced MUC5AC表达(图3 (c))。击倒的内生MKP-1 MKP-1 shRNA增强MUC5AC表达(图3 (d))。由于姜黄素上调MKP-1表达和MKP-1 MUC5AC表达的是负的监管机构,我们试图确定的角色在curcumin-mediated MKP-1 MUC5AC抑制。损耗的MKP-1 shMKP-1呈现姜黄素治疗无效的抑制NTHi-induced MUC5AC mRNA表达(图3 (e))。在一起,这些数据表明,姜黄素抑制NTHi-induced MUC5AC表达通过MKP-1依赖机制。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。Postinfection管理姜黄素抑制MUC5AC表达中耳上皮细胞在体外和体内
接下来,我们试图评估姜黄素的抑制作用的治疗相关性中MUC5AC黏液NTHi-induced OM设置。因此,我们评估管理的影响姜黄素NTHi感染后,类似于临床相关的设置。姜黄素管理后NTHi感染显著抑制NTHi-induced MUC5AC表达在mRNA(图4(一)(图)和蛋白质水平4 (b))在体外。符合体外研究发现,姜黄素治疗后NTHi感染抑制MUC5AC mRNA(图4 (c)(图)和蛋白质表达式4 (d)OM)在小鼠模型。姜黄素抑制MUC5AC表达pre-NTHi和post-NTHi感染条件下相同的程度。因此,这些数据表明,姜黄素是一个潜在的治疗治疗NTHi-induced MUC5AC在OM粘蛋白生产过剩。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
在这里,我们表明,姜黄素通过增加MKP-1转录发挥其抗炎作用。增加MKP-1转录从而提高MKP-1蛋白水平,从而导致p38 MAPK抑制。还需要进一步的研究来确定转录因子,转录机械参与curcumin-mediated MKP-1归纳。先前已经表明,姜黄素增强MKP-1的磷酸化和激活,导致p38 MAPK抑制(21]。因此,姜黄素可能通过转录调节的活动负监管机构MKP-1,平移,转译后的机制。理解这些调节的特定角色和所涉及的特定信号分子对姜黄素可以帮助确定新的药物靶点抵消过度的免疫反应。
在当前的研究中姜黄素是通过腹腔注射(i.p)管理。系统性口服抗生素治疗OM是最常见的临床策略。我很可能系统性。p的姜黄素可能对全球对身体的影响包括中耳。我们先前的研究评价抑制剂的影响,如rolipram roflumilast,长春西汀粘蛋白表达bacteria-induced OM模型还用我。p注射给药途径(18,19]。由于姜黄素是闻名的病人安全性和耐受性,即使长时间使用,很可能的系统性影响姜黄素不会有害的。然而,设计与增加特异性疗法进一步的研究专注于评估的治疗效率ototopical姜黄素的应用在解决OM是必要的。进一步的研究针对增加的生物利用度和发展ototopical药物输送系统将OM治疗的临床意义。本研究的见解可能有更广泛的应用程序上下文中的其他慢性炎症性疾病。
4所示。结论
总之,我们的研究表明,姜黄素抑制NTHi-induced MUC5AC表达在体外和体内。姜黄素抑制NTHi-induced MUC5AC表达的抑制p38 MAPK通过upregulation MKP-1(图4 (e))。姜黄素治疗后NTHi感染也抑制MUC5AC表达OM的小鼠模型,提出我们的研究结果的临床意义。因此,我们的研究首次报道姜黄素的疗效在治疗NTHi-induced MUC5AC粘蛋白生产过剩。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突的存在。
作者的贡献
Anuhya Sharma Konduru和取松山同样导致了这项工作。Anuhya Sharma Konduru,取松山,Byung-Cheol李,李Jian-Dong构思和设计实验。Anuhya Sharma Konduru,取松山,Byung-Cheol李,Kensei小松进行了研究。Anuhya Sharma Konduru,取松山,Byung-Cheol李,李Kensei小松,Jian-Dong分析数据。Anuhya Sharma Konduru和李Jian-Dong写的手稿。
确认
这项工作是由美国国立卫生研究院的资助支持部分DC013833, DC005843, DC004562, GM107529 (Jian-Dong Li)。李Jian-Dong乔治亚研究炎症和免疫联盟著名的学者。