实验性椎间盘突出后脊髓WDR神经元的高兴奋性与髓核和背根神经节Fractalkine及其受体的上调有关

抽象的

介绍．椎间盘突出后的腰根性疼痛可能与髓核(NP)细胞诱导的局部炎症反应有关。方法．在Lewis大鼠麻醉后，采用大鼠背角宽动态范围(WDR)神经元胞外单单位记录和qPCR方法，探讨NP应用对背角神经根(L3-L5)的影响。结果．在NP条件下观察到C-纤维响应的明显增加。在NP组织中，白细胞介素-1的表达β(il - 1β），殖民地刺激因子1（CSF1），裂缝素（CX3Cl1）和裂缝碱受体CX3CR1增加。Minocycline是一种微胶质激活的抑制剂，抑制了神经元活性的增加并减弱了IL-1的增加β，CSF1，CX3L1和NP组织中的CX3CR1表达。此外，结果表明，背根神经节（DRGS）中TNF，CX3Cl1和CX3CR1表达的增加。结论．椎间盘突出后疼痛途径和局部炎症中的过度抑制性可能涉及NP和DRG中的CX3Cl1信号传导的上调。

1.介绍

早期的研究表明，在椎间盘突出症后，核心浆（NP）泄漏出椎间盘突出后的许多物质包括白细胞介素-1的局部释放β(il - 1β），肿瘤坏死因子（TNF）和殖民刺激因子1（CSF1）[1- - - - - -4]．在椎间盘突出症后释放的这种细胞因子可以诱导初级传入神经纤维中的神经元兴奋性和降低的传导轴颈速度，也可以促进神经损伤[1，5，6]．因此，椎间盘突出症对感觉通路有不良影响。

动物的外周炎症可能与背根神经节（DRG）中的卫星胶质细胞的激活相关[7]．神经损伤和炎症物质的释放也可能激活脊髓中的小胶质细胞[8- - - - - -10]．例如，先前的数据显示，可溶性fractalkine (CX3CL1)通过其受体CX3CR1激活胶质细胞和白细胞[11，12]．此外，脊柱CX3CL1的上调可能与机械性异位痛和热痛觉过敏有关[13]．因此，可能影响感觉途径的一个重要炎症分子可以是CX3Cl1。

有证据表明，与椎间盘突出和小胶质细胞活化相关的局部炎症依赖于MAPK p38的磷酸化[14，15]．因此，针对这种激酶的药物可以减轻炎症性疼痛[10，16，17]．在此，我们通过模拟临床椎间盘突出的动物模型，研究了NP对脊髓神经元活动的影响，并检测了局部基因表达。我们假设NP细胞和神经元组织之间的相互作用可能诱导CX3CL1信号的局部上调和疼痛通路中伤害性感受活动的增加。

2.材料和方法

2．1.动物和手术

本研究共使用87只成年自交系雌性Lewis大鼠(170 ~ 215 g)。雌性老鼠更受青睐，因为雄性老鼠体内的过敏原更强。在使用前，所有大鼠先用异氟烷气体(百特国际公司，美国)进行镇静，然后腹腔注射250 mg/mL~2.1 g/kg体重的聚氨酯(Sigma-Aldrich公司，德国)。后爪没有缩回，耳朵没有扭来拧去，说明手术麻醉充分。通过反馈加热垫将大鼠的核心温度维持在36-37℃。

为了暴露坐骨神经，在骨盆带上方切开1- 2cm的切口，在坐骨神经主要分支近端放置双极银钩电极进行电刺激。如前所述[1[左侧用于施加NP的左侧的椎骨切除术，在椎骨TH13-L1上进行，对应于脊髓段L3-S1。椎骨柱刚性地通过夹具鼻孔和尾部刚性固定到暴露的脊髓段。脑膜，即硬膜和arachnoidea，被套管刺破，并经过两次镊子仔细拆除。通过过量的戊巴比妥的过量使这些动物安乐死。

２.２.体内电生理学

通过电控显微操作器(Märzhäuser Wetzlar GmbH & Co. KG，德国)将阻抗为2-4 MΩ (Frederick Haer & Co.，美国)的聚乙烯涂层钨微电极垂直下放至脊髓左背角。脊髓L3-S1节段是通过左后爪手指敲击和捏捏的神经元反应识别的。在50-700深度对宽动态范围(WDR)神经元进行细胞外单细胞记录μ.M来自脊髓表面。每只动物只有一个细胞被研究。来自顶台的记录信号被交流前置放大器放大(×5000)，带通滤波(由Digitimer Ltd, UK)的一半振幅削减500-1250赫兹(NeuroLog)，用CED Micro1401接口进行数字化，并由CED Spike 2.2软件(Cambridge Electronic Design, UK)显示在计算机屏幕上。采样频率为20千赫。

使用Spike 2.2软件控制钩电极对坐骨神经的电刺激频率，同时连接刺激隔离装置(NeuroLog System, Digitimer Ltd, UK)的脉冲缓冲器控制刺激强度。通过检测spike的形状和振幅确保单细胞记录。刺激后50-300 ms的峰值被定义为c纤维反应。C-fiber阈值在每个实验开始时被定义为能够在定义的C-fiber时间框架内引发单个可见尖峰的最低刺激强度。每隔4分钟对坐骨神经进行一次单一的测试刺激(2ms矩形脉冲，1.5x c纤维阈值)。6个稳定的记录变化小于20%，作为后续实验的基线。只有基线反应为5-20个峰值的细胞被纳入研究。

为了研究NP调节对神经元活性的影响，我们从基因相同的供体大鼠的3至4个尾椎间盘中提取NP，并将其尾端应用于记录电极，覆盖传入的左侧背神经根。选用米诺环素(MC, M9511, Sigma-Aldrich Co.， Germany)靶向神经胶质细胞中的MAPKp38。MC溶于0.9% NaCl中，稀释至5μ.克/μ.L，局部施予神经根(25μ.L前和25μ.L后NP应用)。进行了四组电生理实验:(I) NP调节(），（ii）与MC一起调节（），（iii）mc（）和（iv）NaCl控制（）.在调理后遵循C-纤维响应180分钟。此外，14只动物用作供体老鼠。

２.３.平行NP基因表达实验

为了研究我们在NP组织中候选基因表达的变化，进行了四种实验并定义为（i）np，（ii）np + mc，（iii），和（iv）．NP组的组织()与背神经根接触180min, NP+MC组(）与米诺霉素一起。在上述电生理学实验之后，直接收获这两组的组织样品。这团体 （)，作为对照组，研究NP组中是否有可能的基因表达变化是由神经根或周围组织的组织特异性特性引起的。组织()，从供体大鼠尾椎间盘分离后直接冷冻，作为对照。此外，另有9只动物作为脂肪对照组。

２.４.对侧背根神经节基因表达

我们还想调查DRG后试验椎间盘突出的基因表达变化。因此，将输入到Th13和L1通过其背神经根部的腰部DRG L3-L5被解剖除去并冷冻在液氮上。DRG隔离协议已描述为其他地方[18]．进行了两组DRG实验:NP ()及本地(）.在两组中，在分离DRG之前，在三小时内进行露出背神经根的椎骨切除术。在NP组中，从椎板切除术后立即将来自供体大鼠的尾部椎间盘的NP组织施加到左侧神经根部。总共，7种供体大鼠用于DRG基因表达实验。左侧和右背根神经节都被隔离。在基因表达分析之前单独合并左L3，L4和L5和右L3，L4和L5。

2．5．qPCR

如前所述[19]，通过Trizol Reagent（Life Technologies，Inc.，Rockville，Macaryland，USA），氯仿（Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo，Mo，Mo，USA）中从冷冻（-80℃）NP和DRG组织中提取总RNA和DRG组织。和异丙醇（Merck，Darmstadt，德国）。通过借助于逆转录酶聚合酶链反应（RTCHE诊断，德国曼海姆）的第一链CDNA合成试剂盒可逆地转录RNA。然后在步骤Plus QPCR机器（Applied Biosciences，USA）上以两种平价进行QPCR分析。使用Primer Express 2.0（应用生物系统，加利福尼亚州，美国）设计并通过执行爆炸搜索检查特异性的引物。在没有非特异性结合的情况下努力设计底漆（熔化曲线表明没有双份制）。有关引物的更多详细信息（Risskov，Denmark），请参阅表1．靶基因归一化为β肌动蛋白(内部参考)。

2.6。统计数据

脊髓伤害活性，即C-纤维反应，呈现为基线的百分比。将6个基线记录转换为2个基线值（平均3个连续响应），将45个延期线记录转换为9个值（平均连续5个响应）。为了检查四种干预类型的效果，NP，NP + MC，MC和对照，对脊柱伤害反应，进行了方差分析，重复测量设计（RMANOVA）。由于不满足球形度的假设，因此使用温室 - 揭示校正纠正了自由度。使用单向ANOVA和Tukey的诚实显着差异（HSD）后HOC比较比较调节后60至180分钟的平均C-纤维反应。关于基因表达，通过向参考基因的表达表达靶向靶基因来定义每个样品的折叠变化值β-肌动蛋白和相应的天然组织水平。使用单因素方差分析和Tukey的HSD后比较来比较NP表达值的组均值，而DRG表达值与未配对的Student的表达值进行比较t以及。使用spss21 (IBM SPSS inc.， USA)进行统计分析。一个值< 0.05为具有统计学意义的水平。数据作为典型例子和平均值±SEM给出。

3.结果

我们在这里报告了IL-1β（红色），TNF（绿色），CSF1（蓝色），但也在天然NP组织中表达CX3Cl1（棕色）和CX3CR1（黄色）（图1(一)）.此外，将NP应用于背神经根诱导c纤维反应迅速增加(图)1 (b)），但是在大多数情况下由minocycline阻断（图1 (c)）.在NP管理后，观察到的C-纤维反应的增加已经是10-20分钟（图2(一个))，而NP与二甲胺四环素联合应用后，c纤维反应没有明显增加(图)2 (b)）.单独应用二甲胺四环素可导致c纤维反应的短期持续下降(图)2 (c)）.在车辆控制实验中，c纤维响应没有明显变化(图)2 (d)）.

NP条件60-180分钟的平均C-纤维响应为基线136.1％±13.9，但在NP调节后，含有米诺霉素仅为99.9％±6.5的基线。此外，单独米诺环素后的平均C-纤维反应是基线的92.0％±8.6，并且在相应的车辆控制线上的基线91.7％±7.4（图2 (e)）.单独用NP调节后的C-纤维响应明显高于NP加米诺环素，单独或在相应的车辆控制中的含有NP加上的C-纤维响应。

此外，我们观察到IL1表达的明显增加β在NP样品中，但TNF的表达没有变化，并且在施用到神经根部后180分钟的巨噬细胞群刺激因子CSF1表达的微小增加（折叠表达：IL-1β；，TNF.，CSF1;）.值得注意的是，CX3CL1及其同源受体CX3CR1的基因表达也在NP组织中显著增加(折叠表达:CX3CL1;，CX3CR1;）.

有趣的是，当NP与胶质细胞和巨噬细胞激活抑制剂二甲胺四环素一起使用时，NP诱导的表达变化几乎完全被阻断(折叠表达:IL1)β；肿瘤坏死因子;，CSF1;，cx3cl1;，CX3CR1;）.在相应的脂肪对照实验中未观察到表达的明显变化，其中将NP施加到鼻内脏脂肪组织（折叠表达：IL1）上β；肿瘤坏死因子;，CSF1;，cx3cl1;，CX3CR1;）.因此，依赖于米诺环素衰减的表达的增加，这取决于NP组织和背神经根部之间的接触（图3(一个)- - - - - -3（e））.

3小时后，将NP应用于左侧背神经根，可诱导同侧drg中TNF、CX3CL1和CX3CR1的表达增加(同侧drg中折叠表达:TNF;，cx3cl1;，CX3CR1;；对侧DRGs: TNF折叠表达;，cx3cl1;，CX3CR1;） （数字4（a）- - - - - -4 (e)）.虽然NP被应用于DRG近端5 - 15mm处，但这似乎对DRG细胞有明显的影响。IL1-的折叠表达β然而，CSF1没有增加（Ipsilateral DRG：IL-1β；，CSF1;；侧drg: il - 1β；，CSF1;）.

4。讨论

我们的结果表明，在背神经根上应用NP在几分钟内增加了背角的c纤维反应。DRG基因表达的变化提示原发性传入神经纤维可能受到NP的影响。此外，在背神经根附近释放的促炎细胞因子可扩散到背角，影响突触后细胞和脊髓小胶质细胞。因此，脊髓水平兴奋性的增加可能是由于NP对原神经纤维的直接影响，但也可能是突触后WDR神经元中NP分子引起的继发性改变。以往研究表明，NP的快速效应是由IL-1诱导的β和TNF作用于背角板II离子通道和抑制脊髓GABA和甘氨酸诱导电流[20.，21]．行为研究也证实了NP对伤害性信号的影响[22]．

先前的观察结果表明，NP在背神经根上的应用可能会影响细胞因子等IL-1的表达β在NP组织中的TNF [1]．根据这些早期发现，目前的数据显示IL-1显著上调β将NP应用于NP组织的背神经根。然而，与我们之前的报道相比，这次在NP组织中未观察到TNF明显上调。另一方面，目前的数据显示，TNF在DRG中显著上调。

无论如何，几种证据表明IL-1β和TNF，以及Csf1，可能在NP或椎间盘突出后周围组织中上调[1，3.，4，23]．因此，椎间盘突出后疼痛通路中持续的高兴奋性似乎与包括神经根附近巨噬细胞激活在内的局部炎症过程有关。此外，以往的数据表明，IL-1β［24，25]，csf1 [26- - - - - -28]和CX3CL1 [22，29，30.]可以诱导m1 microglia活化。然而，我们首次表明，NP在背神经根部上的应用还增加了NP细胞中CX3Cl1和CX3CR1的基因表达，并在同侧DRG中增加。这些观察结果表明，IL-1的局部上调β、Csf1、CX3CL1椎间盘突出后可激活小胶质细胞并诱发疼痛[21]．有趣的是，在与肩胛内脂肪组织接触后，NP组织的基因表达没有变化，提示NP细胞与神经元组织之间存在特定的相互作用。

根据早期的观察，小胶质细胞抑制可以预防痛觉过敏[16，17，31]，米诺环素在本研究中减弱了NP诱导的伤害性信号的增加。早期体外研究的数据也表明，抑制人类NP细胞中的MAPK p38可抑制炎症[14]．因此，很容易推测二甲胺四环素的抗伤害作用可能是小胶质细胞中MAPK p38磷酸化减少的结果。

然而，米诺环素的抗炎作用也可能是由于其他机制，不仅通过抑制p38磷酸化。例如，据报道，米诺霉素是一氧化氮合酶的抑制剂[32]和5-脂加氧酶[33]减弱TNF的表达[34]，并抑制NF-kappa B的活性[35]．此外，米诺霉素可能直接影响na⁺-初级传入神经元中的通道[36，这可以解释米诺环素给药后c纤维反应短暂持续下降的原因。二甲胺四环素也能抑制IL-1基因表达的增加β、Csf1、CX3CL1和CX3CR1在NP组织中的表达。因此，在背神经根上应用壬基酚后，米诺环素对伤害性信号的缓解作用可能与壬基酚的抗炎过程有关。

与NP组织相比，DRG中基因表达的变化不那么明显。尽管如此，TNF、CX3CL1和CX3CR1的表达显著增加，支持先前的观察，即在主要传入物上局部应用NP可能会改变drg中的基因表达[37]．基因表达的变化仅在同侧观察到。这支持了一种假说，即所观察到的伤害感受效应依赖于NP组织和背神经根之间的接触。

在神经损伤后，先前在DRG中显示了CX3Cl1及其受体CX3CR1的表达增加[38]．我们观察到，应用NP后疼痛通路的高兴奋性可能与DRG中CX3CL1信号的上调有关，这支持了之前的发现。此外，有证据表明CX3CL1通过激活DRG卫星神经胶质细胞介导炎性疼痛[7]．然而，最近的发现挑战了之前CX3CL1在DRG神经元中表达的概念[39]．因此，观察到的CX3Cl1上调似乎发生在内皮细胞中，可能促进单核细胞或其他白细胞进入DRG的渗透[40]．

在我们的动物模型中，在腰椎间盘突出患者中，NP移植物到DRG的距离可能大于NP到DRG的距离。尽管如此，我们的数据显示，将NP应用于背神经根可诱导同侧DRG组织中几个基因的显著上调，强调了我们的动物模型的临床相关性。此外，以往的数据表明，外周血炎症是通过循环IL-1引起的β可能增加Cox 2在脊髓中的表达[41]．值得注意的是，外周血组织释放的循环介质也可能影响中枢继发性WDR神经元。

结论

总之，本数据表明，椎间盘突出后疼痛途径和局部炎症中的过度抑制性可能涉及在NP和DRG中上调CX3Cl1信号传导。CX3Cl1的上调的分子后果仍有待研究。

伦理批准

所有的动物实验都得到了挪威动物研究管理局的批准，并且是按照挪威控制活体动物实验和程序的法律法规进行的。

相互竞争的利益

作者声明本论文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

Daniel Pitz Jacobsen, Aurora Moen, Fred Haugen和Johannes Gjerstad设计了研究;Daniel Pitz Jacobsen, Aurora Moen, Fred Haugen和Johannes Gjerstad进行了研究;Daniel Pitz Jacobsen, Aurora Moen和Johannes Gjerstad分析了数据;奥罗拉·莫恩和弗雷德·豪根参与了手稿的起草;丹尼尔·皮茨·雅各布森(Daniel Pitz Jacobsen)和约翰内斯·杰尔斯塔德(Johannes Gjerstad)撰写了论文。

致谢

这项工作是由挪威研究理事会(NFR)资助的。

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