尼古丁抑制Clostridium艰难术毒素a诱导大鼠结肠炎而非回肠炎

抽象的

尼古丁是溃疡性结肠炎的保护性，但不是克罗恩病的小肠病，但对尼古丁的影响很少Clostridium艰难术毒素A诱导的肠炎。在腔内注射毒素A中的尼古丁比特酸盐或其他药理剂中预处理了麻醉大鼠的分离的eLEAL或结肠段。3小时后，除去处理的区段，评估炎症。尼古丁双色抑制毒素毒素，但不炎。用烟碱受体拮抗剂，六淀粉预处理阻断了尼古丁的影响。在毒素毒素前用六淀粉预处理结肠段导致单独用毒素的毒素产生更多炎症，表明结肠中存在滋补烟碱的抗炎病症。尼古丁还抑制TRPV1（短暂受体潜在香草亚型1）激动剂，白酮B的毒素A诱导的毒素A诱导的结肠浓度增加₄（LTB.₄尼古丁预处理对trpv1介导的腔内辣椒素引起的结肠炎没有保护作用。烟碱胆碱能受体能强化剂保护结肠免受炎症，尼古丁抑制毒素A型结肠炎，但不抑制毒素A型回肠炎，部分原因是通过内源性TRPV1激动剂(如LTB)抑制毒素A型诱导的TRPV1激活₄．

1.介绍

Clostridium艰难术毒素A引起人们的结肠炎和小肠和研究动物结肠的严重急性炎症。关于吸烟和尼古丁的影响很少C.艰难岩结肠炎。相比之下，众所周知，吸烟是在人炎症肠疾病，溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）中具有差异影响。已经表明，目前的吸烟可以防止UC [1，2而非乳糜泻，且在UC发病后有益。此外，戒烟会恶化UC的病程。溃疡性结肠炎吸烟者比非吸烟者在发病、住院率、口服类固醇需求和结肠切除术率方面的病程更为良性[1］．吸烟对不确定性结肠炎和UC也有保护作用[1］．在另一方面，吸烟是CD的危险因素，并已被证明是这种病的中性或加重因素[3.］．有趣的是，吸烟可能决定乳糜泻的发病位置，因为大多数研究报告，乳糜泻吸烟者的回肠疾病患病率较高，而结肠疾病患病率较低[1］．这一概念得到了一项前瞻性研究的支持，该研究发现，吸烟的乳糜泻患者结肠感染的可能性较小，表明吸烟可以保护结肠免受乳糜泻炎症的影响，就像UC一样[4］．这些结果和其他结果导致猜测吸烟在肠道中的保护作用不是疾病特异性，而是可能是结肠特异性[5］．

尼古丁已被证明是烟草烟雾中的活性保护组分，因为尼古丁透皮贴剂或尼古丁灌肠保护UC中的结肠[6，7］．据报道，吸烟者患肺癌的比率较高C.艰难岩在50岁以上的美国人中，吸烟者比不吸烟者的感染率高[8]但尼古丁对毒素A诱导的肠炎急性炎症的影响几乎没有机械研究。目前研究的目标是确定尼古丁的影响C.艰难岩a毒素诱导大鼠的回肠炎和结肠炎。

2.材料和方法

2.1。材料

（ - ） - 从西格玛（圣路易斯，MO）购买尼古丁氢气，六甲基和辣椒素。Clostridium艰难术毒素A是从TeckLab公司(Blacksburg, VA)购买的。LTB₄酶免疫测定（EIA）试剂盒购自Cayman Chemical（Ann Arbor，MI）。

2.2。外科手术

分离的结肠段在麻醉的雄性Sprague-Dawley大鼠（150-175g）中构建，如前所述，用于构建ilap段[9，10.］．Isolated colonic segments 5 cm in length were constructed distal to the caecum by ligation with silk sutures.

2.3。药物管理

毒素A以剂量为5施用 μg在400中 μL（或200 μL在其他药物后给予时)将PBS注入离体肠段管腔。

（ - ） - 尼古丁氢气（“尼古丁”）溶解于200 μL（或100 μl当经过其他药物后给出的PBS并以2ng-20的剂量给药 μ在毒素A或辣椒素注射之前30分钟G进入分离的肠道内腔。六淀粉溶解于200 μL（或100 μL当PBS的烟碱之前给出）和剂量为5施用 μg into the lumen of isolated intestinal segments 30 min prior to other drugs. Capsaicin was administered at a dose of 4 mg in 400 μL（或200 μL其他药物后给药时)25%乙醇，盐水。所有腔内注射均使用27ga注射器针头。对照组大鼠制备相同的结肠段，注射相应的载体溶液。这些研究得到了杜克大学和杜伦退伍军人协会动物护理和使用委员会的批准。

２.４.腔的流体积累

重量分析腔流体积聚。处理3小时后，除去分离的髂骨区段并称重，并测量它们的长度。腔液累积表示为每厘米长度的Mg湿重。

2.5。myeloceroxidaseastue

如前所述测量myelocoxidase（MPO）活性[11.］．简而言之，将控制和处理的髂骨段在0.5％十六烷基三甲基溴化铵中均化50mm KH₂宝₄(pH 6)，冷冻/解冻3次，4℃离心2分钟，分别在0、30、60秒下，在460 nm处读取各上清液的吸光度o-二苯胺盐酸盐至0.1 mL上清。以摩尔氧化吸收指数为基础，利用每分钟吸光度的最大变化量计算MPO活性单位o-dianisidine的1.13×10⁴ M⁻¹ cm⁻¹．结果表示为每克组织湿重的活性的MPO单元。

2.6。LTB₄测量

肠道LTB₄通过LTB测量水平₄从Cayman Chemical（Ann Arbor，MI）购买的酶免疫测定（EIA）套件如前所述[12.］．简而言之，在含有1mM EDTA和10的含有1mM的5体积的冰冷0.1M磷酸盐缓冲液，pH7.4中，在各种处理后收集回肠和髂骨腔流体样品。 μm在domethacin and homogenized for 15 sec on ice using a Tekmar Tissumizer (Tekmar, Cincinnati, OH) at a 50% power setting. Before homogenization, 10,000 cpm of^3.H-LTB₄（120-240 CI / MMOL，Perkin-Elmer Life Sciences，Boston，MA）被添加到缓冲区中，以便在LTB进行后期评估₄恢复。均化后，将2体积的冰冷乙醇加入每种萃取物中，然后将萃取液在冰上温育5分钟以沉淀蛋白质。在3000×以3000×离心后为去除沉淀蛋白，采用真空离心去除上清液中的乙醇。通过添加1 M乙酸钠(pH 4.0)将提取物的pH调至~4.0。由此产生的沉淀是被离心分离,上层是装上C-18固相萃取墨盒(开曼化工、安阿伯、MI)之前用甲醇和蒸馏水洗净,用蒸馏水洗净之后,己烷,然后在单位筛选了引力与5毫升的99%乙酸乙酯:1%甲醇。样品经真空离心蒸发干燥，在LTB中重组₄环评缓冲液，并根据试剂盒制造商的说明进行分析。由于A毒素导致部分回肠黏膜脱落进入肠腔，我们用注射器从A毒素处理过的回肠段收集肠腔内容物，并检测LTB₄内容只是作为回肠组织和LTB₄将髂骨组织和相应的腔内容物的内容物加入这些样品中。因为它似乎不适当地将结果作为LTB表示₄每单位湿重量浓度，因此，结果表示为LTB₄每厘米荷兰长度的浓度。

2.7。物质P释放

如前所述，通过NK-1R内吞作用分析评估P物质释放[13.，14.]有修改。简而言之，从对照，毒素治疗和辣椒预处理/毒素A处理的大鼠取出的髂骨段碎片在新鲜的4％多聚体醛中固定在4℃下。然后洗涤组织并嵌入组织TEK O.C.T中。复合（樱花，托兰斯，加利福尼亚），冷冻，分段为20 μm，并安装在Superfrost/Plus玻璃滑道上(Fisher, Pittsburgh, PA)。冲洗后，用针对大鼠NK-1R c端15个氨基酸的兔抗血清(#11886-5)对载玻片进行染色，稀释倍数为1:3000 [15.］．This was followed by incubation in a cyanine 3-conjugated donkey anti-rabbit IgG secondary antibody (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) at a dilution of 1 : 600. The stained sections were analyzed using a Zeiss LSM-510 META inverted krypton-argon confocal laser scanning system coupled to a Zeiss Axiovert 200 MOT microscope. Images of 512 × 512 pixels were obtained and processed using Adobe Photoshop. Quantification of NK-1R endocytosis was achieved by analyzing 20 NK-1R-immunoreactive (NK-1R-ir) myenteric plexus neuronal cell bodies per rat and determining the number of these cells containing more than 10 NK-1R-ir endosomes. Cytoplasmic NK-1R-ir endosomes were distinguished from NK-1R-ir plasma membranes or plasma membrane-associated endosomes by ensuring that the nucleus of the neurons was in the same optical section as the NK-1R-ir endosomes.

2.8。统计分析

结果表示为平均值±SEM（= 5-7）。组间平均差异通过单因素方差分析和杜克 - 克莱默多重比较评估后测用GraphPad的Wi​​ndows（格拉夫派得软件，圣地亚哥，CA）。在某些情况下，当巴特利特的测试显示，各组的标准差之间的差异显著，该数据是由秩和检验非参数ANOVA随后邓恩的多重比较检验。值< 0.05被认为是显著的。每组的老鼠数量见图例。

3.结果

大鼠结肠腔内注射毒素A 3小时可引起严重的炎症反应，包括腔内液体积聚、组织MPO含量增加和组织病理学改变(图)1)．组织学效应包括粘膜折叠，表面溃疡，正常隐窝结构的破坏和炎症细胞最显着地包括中性粒细胞广泛浸润的平坦化。预处理用于与纳克范围腔内尼古丁30分钟导致毒素A诱导的管腔液积聚，MPO活性，和组织病理学的剂量依赖性抑制。然而，在肠道炎症的这些指数尼古丁的影响是双相的，因为20的高剂量的尼古丁 μg没有效果。

有趣的是，用对结肠最具保护作用的尼古丁对回肠进行预处理，并没有抑制毒素a在小肠这一段引起的炎症(图)2)．在回肠（数据未显示）中，尼古丁的较高和较低剂量也是无效的。

为了确定结肠中尼古丁的保护作用是由胆碱能尼古丁受体介导的，而不是由其他非特异性作用介导的，结肠前使用了特异性尼古丁受体拮抗剂六甲铵。六甲铵剂量为5μ克取消针对毒素A诱导的管腔液积累和MPO含量尼古丁的保护作用（图3.)．

接下来，检查了对毒素进行结肠炎的六淀粉（在没有尼古丁处理的情况下）对结肠癌进行预处理的效果。先前已被证明六淀粉在大鼠中恶化了DNBS诱导的结肠炎[16.]，表明还存在滋补尼古丁受体介导的结肠对炎症的保护。单独的六甲基氨基对炎症的结肠索引没有影响，但显着加剧了毒素A诱导的结肠MPO含量（对毒素A引起的腔液液体积累没有显着影响，图4)．

如在测试尼古丁作用通过抑制在结肠中的促炎TRPV1激动剂的产生，以防止结肠炎的假设第一步骤中，施用辣椒素之前预处理与尼古丁结肠的作用，直接TRPV1激动剂先前已经显示出是在大鼠回肠高度炎症[13.),进行了测试。腔内辣椒素在大鼠结肠中也有高度炎性反应(图)5)．与使用毒素A作为炎症剂的结果不同，尼古丁预处理对辣椒素诱导的结肠炎没有保护作用。由于辣椒素是一种直接的TRPV1激动剂，这一结果表明，如果毒素a导致内源性TRPV1激动剂的增加，进而介导炎症，那么尼古丁可能通过抑制结肠中这种激动剂的生成而起作用。

之前已被证明是白酮B₄（LTB.₄）回气中的水平响应腔内毒素A [12.)和LTB₄是良好表征的内源性激动剂TRPV1 [17.］．因此，内源性结肠LTB₄浓度在结肠中测量响应于毒素A具有和不具有尼古丁预处理。毒素刺激结肠组织LTB一个显著上升₄内容（图6)．尼古丁预处理抑制毒素A对组织LTB的影响₄的水平。

尼古丁通过抑制毒素A刺激结肠黏膜内源性TRPV1激动剂产生的能力提供了更多的证据，证明尼古丁抑制毒素A刺激的物质P (SP)在结肠的释放(图)7)．腔内毒素A导致P物质神经激肽1受体(NK-1R)内吞显著增加，NK-1R是内源性SP释放的指标[18.- - - - - -25.］．

4.讨论

本研究中的主要发现是烟碱胆碱能受体保护结肠C.艰难岩此外，用尼古丁预处理结肠进一步抑制毒素a诱导的结肠炎。相反，尼古丁对毒素A诱导的回肠炎没有保护作用，尽管结肠和回肠对毒素A的炎症反应相似。这种模式与之前在各种结肠炎动物模型和人类炎症性肠病(UC和CD)中观察到的模式非常相似。这些观察表明，结肠对急性和慢性炎症的反应可能有相似之处。

给药的特异性尼古丁受体拮抗剂，六甲铵，本身没有影响结肠炎症指标，但明显加剧毒素a诱导的MPO活性增加。根据Sörensson等人的研究结果，尼古丁保护结肠而不是回肠是有趣的，他们报道六甲铵减轻了毒素A对大鼠空肠-回肠段几个炎症指标的影响[26.[还在进一步支持烟碱胆碱能受体在结肠与小肠中的差异效应。

吸烟和尼古丁对肠道炎症的影响也在其他几种肠道炎症动物模型中进行了研究。在二硝基苯磺酸(DNBS)大鼠结肠炎模型中，尼古丁具有双相作用，低剂量时改善炎症，高剂量时增强炎症[16.］．另一种表现出类似的结果，另外还有类似的结果。被动卷烟烟雾抑制DNBS刺激的结肠白酮二酮B.₄（LTB.₄）和TNFα水平[27.］．在大鼠结肠炎的三硝基苯磺酸（TNBS）模型，尼古丁也产生了剂量依赖性双相作用，显著减少在低尼古丁剂量损害和具有高尼古丁剂量几乎没有影响[28.］．在另一项对大鼠的TNBS研究中也发现了类似的结果，该研究也观察到低剂量的尼古丁抑制炎症也降低了结肠组织LTB水平₄和肿瘤坏死因子α（TNF.α）[29.］．尼古丁抑制结肠TNF的结论α对小鼠结肠的研究得到了支持水平[30.］．相比之下，有两组研究报告称，吸烟会加重老鼠的DNBS或TNBS结肠炎[31.，32.[但是，这可能是通过尼古丁观察到的双相剂量 - 响应效应来解释，其中低剂量是保护性，高剂量不是。

在大鼠肠炎的碘乙酰胺模型，尼古丁被认为是对碘乙酰胺诱导的结肠炎的保护，但不是空肠炎[33.］．判断碘乙酰胺以引起一种形式的肠炎更像是人类CD的肠炎多于UC，这表明尼古丁对肠道的影响可能会对人类UC与CD中吸烟的差异效应提供可能的解释。在另一种动物模型中报道了类似的发现也判断比UC更紧密地相似，白细胞介素-10（IL-10）敲除小鼠模型。IL-10的遗传烧蚀导致这些动物的结肠炎和Jejunitis。尼古丁治疗导致对结肠的显着保护，但Jejunum更严重受损[34.］．尼古丁对小肠和结肠产生不同影响的概念，表明尼古丁对小肠和结肠粘膜细胞因子水平不同的区域作用进行了不同的区域作用[35.］．

通过该烟碱样胆碱能刺激保护结肠针对毒素A损伤的机制是未知的，但最近的研究已证明，一个强大的胆碱能消炎反射存在，其中抗炎剂的神经检测反射地刺激乙酰胆碱的迷走神经释放周边刺激烟碱受体那抑制巨噬细胞和树突状细胞的免疫应答[36.- - - - - -38.］．这种胆碱能抗炎途径已被证明是在这种多样化的实验炎症模型中活跃，因为败血症[36.]，缺血再灌注[39.],出血[40]、术后肠梗阻[41.］．这种反射可能是尼古丁对毒素a诱导的结肠炎影响的一部分，但也可能涉及其他机制。已有研究表明，腔内毒素A通过激活瞬时受体电位香草样亚型1 (TRPV1)受体刺激肠黏膜初级感觉神经元，释放P物质(SP)，最终导致肠道炎症[13.］．然而，腔内毒素A激活TRPV1的机制尚不清楚。毒素A作用的第一步是结合顶端微绒毛上的粘膜上皮细胞[42.］．已经证明，毒素A与小肠的绒毛上皮细胞结合，而不是隐窝上皮细胞，也不与杯状细胞结合[43.］．因此，毒素A在粘膜上皮的水平上施加其效果，并且不会深入渗透到肠粘膜中。这与观察结果一致的是，当毒素与细胞结合时，它迅速内化并导致rho蛋白的葡萄糖化，蛋白质合成减少，最后细胞坏死[44.］．这些观察结果导致以下假设毒素A能刺激生产粘膜上皮这反过来又激活TRPV1表达在相邻的固有层的感觉神经元的内源性TRPV1激动剂。有证据表明，LTB₄可能是在大鼠肠中被毒素A刺激的内源性TRP1激动剂[12.］．目前的结果提供了三行证据，支持涉及TRPV1活化的神经发生机理起到结肠炎的烟草抑制作用。首先，当辣椒素诱导炎症而不是毒素A，尼古丁没有效果。辣椒素是TRPV1的直接激动剂，与毒素A不同，导致内源性TRPV1激动剂的释放[12.- - - - - -14.］．因此，尼古丁对辣椒素诱导的炎症缺乏抑制，表明在炎症级联中，尼古丁的作用先于TRPV1的刺激。第二，毒素A刺激了结肠内源性TRPV1激动剂LTB的生成₄和尼古丁的抑制这种效应。第三，毒素A也刺激了TRPV1依赖性促炎神经肽的局部释放，P物质，在结肠和尼古丁也抑制该响应于该毒素。总之，这些结果支持了由结肠烟碱受体活化抗蚀剂炎症是通过抑制内源性TRPV1的产生的作用机制之一作为LTB激动剂例如概念₄．

与在老鼠身上的研究结果相反，据报道，50岁以上的美国人吸烟的几率更高C.艰难岩感染比不吸烟者多[8］．然而，这是一个回顾性研究中，尼古丁摄入的剂量是未知的。此外，由于Clostridium.已知香烟中也含有这种物质[45.]，吸烟可以是孢子的口服源到吸烟者的胃肠道。此外，有可能是吸烟的可能性比不吸烟者接受抗生素治疗，这是强烈关联C.艰难岩感染 [42.］．鉴于这些考虑，更仔细地研究吸烟和尼古丁对人的影响可能是有用的C.艰难岩感染。

5。结论

烟碱胆碱能受体tonically防止炎症和尼古丁抑制毒素A结肠炎结肠，但通过抑制TRPV1的毒素A诱导的活化的内源性TRPV1激动剂如LTB不回肠炎大鼠部分₄．

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者感谢Douglas C. McVey的技术支持。这项工作得到了退伍军人事务绩效审查基金和国家卫生研究院基金(DK-50265)的支持。

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