炭黑粒子展览规模依赖人类单核细胞毒性

文摘

水平的提高微粒空气污染与呼吸道和心血管死亡率和发病率增加。一些流行病学和毒理学研究表明超细颗粒(< 100海里)每单位质量比大颗粒更有害。在目前的研究中,颗粒大小的影响(纳米和微)炭黑(CB)粒子的生存能力,吞噬作用,细胞因子诱导,在人类单核细胞DNA损伤,THP-1细胞,进行了分析。细胞被孵化的纳米和微米(~ 50海里)(~ 500海里)CB粒子大小50 - 800的浓度范围µ克/毫升。参数和MTT试验一样,吞噬作用试验、ELISA、基因表达和DNA分析进行了研究。暴露在纳米和微米大小的CB粒子显示大小和浓度依赖的细胞生存能力和减少显著增加促炎细胞因子il - 1β肿瘤坏死因子-αil - 6和趋化因子引发释放。单核细胞的基因表达研究显示upregulation化学引诱物蛋白1基因而cyclooxygenase-2仍不受影响。纳米CB粒子改变单核细胞的吞噬能力虽然微米CB没有显著的影响。CB粒子对单核细胞的DNA没有任何明显的影响。调查表明,CB粒子在纳米尺度表现出更高的倾向的诱导细胞毒性、炎症和改变人类单核细胞吞噬作用比微米大小。

1。介绍

纳米产业近年来大幅扩大导致各种纳米材料对人类和环境的暴露。粒度中扮演一个重要的角色在决定特定的生物纳米材料的行为。由于其极端的体积小,纳米颗粒具有特定表面积大,这使得表面原子或分子的数量呈几何级数增长。因此,粒子在nanorange表现出更高的化学和生物反应性比微粒(1]。与纳米颗粒相关联的风险暴露需要调查由于证据,这些粒子可以更inflammogenic比大颗粒和有毒由相同的材料(2]。近年来,微型和纳米粒子之间的尺度依赖的毒性已经证明(3- - - - - -5]。

炭黑(CB)已经广泛的工业应用,以及用作加固剂在橡胶制品,黑色印刷油墨中颜料和光刻技术,电池电极的电导体和皮革制品的生产加工过程中。此外,碳质纳米粒子存在的环境污染物。燃烧过程的一个重要来源碳纳米颗粒。元素碳基纳米粒子的直径小于100纳米是一个柴油机尾气和环境污染的重要组成部分。在肺部沉积之后,更大的粒子是由肺泡和气道巨噬细胞吞噬6,7),但罚款和超细碳颗粒保持在肺部更长一段时间(8]。超细颗粒吞噬较小的扩展,但他们仍然可以进入巨噬细胞和上皮细胞,甚至渗透进入循环。因此,超细粒子不仅引发当地肺部炎症反应也引起系统性肺外的影响(9]。超细粒子也有能力抑制肺泡巨噬细胞吞噬作用的(10]。巨噬细胞和单核细胞祖细胞是炎症反应的主要元素。除了执行吞噬,他们可以释放炎症介质如细胞因子和趋化因子,至关重要的是参与破坏微生物和粒子的使用各种酶系统(11]。CB报告纳米颗粒导致细胞毒性损伤,增加水平的促炎趋化因子,抑制细胞生长(12]。流行病学和实验研究证实了CB纳米颗粒的作用加重肺疾病如哮喘、肺癌、肺纤维化,心血管疾病和系统性13]。

在这项研究中,CB粒子被考虑在大量生产带来高环境风险影响的健康一般人群(13,14]。因为零星的信息在体外CB粒子的尺度依赖的影响,目前的研究来确定他们的纳米和微米大小的颗粒对生存能力的影响,吞噬作用,人类单核细胞和细胞因子诱导,THP-1细胞。这些未分化的细胞表达的许多属性单核细胞和代表先天免疫系统的模型15]。这些细胞是一个至关重要的适应性和先天免疫反应之间的联系,因为他们发展成各种形式的抗原递呈细胞(巨噬细胞和树突细胞)。他们通常作为模型来研究人类的炎症反应,这允许的可能性,阐明纳米粒子与先天免疫细胞的相互作用[16,17]。

2。材料和方法

2.1。粒子的制备及表征

碳技术< 50 nm和碳粉~ 500 nm Sigma-Aldrich买来。粒子的物理化学性质进行了分析使用透射电子显微镜(TEM),动态光散射(DLS)和电动电势分析仪。在股票分散粒子的形态和大小是由TEM。干粉颗粒的悬浮在细胞培养基的浓度为1毫克/毫升,然后在室温下用近10分钟均匀悬浮。声波降解法和稳定后,透射电镜样本由下降涂层碳涂层的股票暂停铜网格。网格上的电影被允许干前测量。TEM测量进行的加速电压120 kV(1200例,JEOL有限公司,东京,日本)。ZetaPALS(纽约布鲁克海文国家实验室仪器公司,Holtsville)是用来确定水动力的大小和电动电势的粒子悬浮在细胞培养基。

2.2。细胞培养

人类单核细胞的细胞系,THP-1来自国立细胞科学中心,印度浦那。他们保持RPMI 1640中补充10%热灭活胎牛血清(的边后卫)、谷酰胺(2毫米),链霉素(100μg / mL)和青霉素(100 U /毫升)。细胞培养在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。THP-1,细胞被播种到24-well板1×10⁶细胞/毫升和暴露于粒子在50到800的浓度范围μg / mL 24 h。基于筛选研究的结果(数据未显示)用不同浓度的粒子和先前的报道18,19),选择一个浓度范围。细胞暴露在纳米和micro-CB停赛10分钟的准备。通过控制包括为了评估与每个测定粒子的干扰。

2.3。细胞毒性的评估

THP-1细胞孵化与CB粒子(纳米和微)的浓度范围50,100,200,400,800μg / mL 24 h。这个潜伏期后,粒子的细胞毒性评估使用MTT测定[20.]。简单地说,MTT (20μL / 5毫克/毫升的股票)添加和孵化4 h。上层清液被离心,然后300年μL DMSO的补充道。彻底混合后,光密度在570海里被标仪(美国BioTek)。控制值(不刺激)设定在100%可行的和所有的值被表示为一个百分比的控制和各自TC-50(粒子浓度诱导细胞死亡率50%)浓度计算使用GraphPad棱镜软件。

2.4。吞噬作用分析

的吞噬能力4 h后THP-1细胞暴露于不同浓度的CB粒子(即1/2TC、50,我和2我)是通过测量他们的吞噬能力评估1μ(1 m乳胶珠子μm乳胶珠子、羧酸盐改性聚苯乙烯和荧光黄绿色)。施罗德的方法是修改方法和Kinden21]。曝光后,细胞与PBS洗两次,去除多余的粒子。培养基含有乳胶珠子的bead-to-cell比10:1井被转移到文化。单核细胞和珠悬浮液培养1 h允许吞噬作用。珠子不吞噬被移除在225 g离心5分钟;细胞颗粒resuspended在磷酸缓冲盐。过程重复三次,最后细胞涡10年代和荧光的细胞激发和发射波长的确定设定在440和485海里,分别。在吞噬细胞生存能力分析被台盼蓝排斥监控。整个试验可行性是95±5%。显微图像的吞噬乳胶珠子,只有在一个浓度,即TC-50浓度测试粒子,。 After washing, the cells were seen under microscope. DIC images or paired DIC and fluorescence images of phagocytosed beads by monocytes were acquired using fluorescent microscope (Zeiss, Germany) with 40x dry and 100x (oil immersion) objectives.

2.5。细胞因子分析

探讨CB粒子对细胞因子的影响生产,酶联免疫吸附测定(ELISA)。测定il - 1β、il - 6、TNF -α引发,单核细胞在培养1×10⁶细胞/毫升和暴露在TC-50 CB粒子(纳米碳:591.4的浓度μ687.1 g / mL和微碳μ18 g / mL) 6日,24日,48 h。粒子暴露后,浮在表面的游离通过连续收获10分钟离心(2000 rpm, 7000 rpm, 13000 rpm)和存储在−80°C到分析。ELISA进行根据制造商的协议(Abcam酶联免疫试剂盒)和吸光度值测量使用标仪(美国BioTek仪器)。至少三个独立实验和浓度计算的线性回归方程来自一组标准的吸光度值。

2.6。基因表达分析

基因表达分析cox - 2和MCP-1被暴露评估细胞TC-50 CB粒子(纳米碳:591.4的浓度μ687.1 g / mL和微碳μg / mL) 24 h。总RNA分离使用RNeasy迷你包(美国试剂盒)。核糖核酸的浓度和完整性是用多模标仪(美国BioTek)之前的实验。增强的禽流感HS rt - pcr试剂盒(美国σ)是用于cox - 2的放大,MCP-1,和18 sRNA基因,根据制造商的指示。放大的互补产品在1.2%琼脂糖凝胶电泳分离。放大基因的引物序列见表1。

2.7。检测DNA损伤

THP-1细胞暴露于纳米和微粒子的CB(0, 100, 200, 400,和800年μg / mL) 24小时收集与PBS管和清洗。3 h的细胞被孵化裂解缓冲(20毫米Tris-HCl, pH值8.0,5毫米EDTA, 0.1 M氯化钠,0.5% SDS,和100年μg / mL核糖核酸酶)在37°C。孵化后,苯酚:氯仿(1:1)混合物被用来提取DNA。通过添加同等体积的冰冷的绝对的异丙醇,DNA是沉淀。DNA是溶解在50μL 1 x的TE(10毫米三、1毫米EDTA和pH值8.0)缓冲区。20μg的DNA被加载到1.2%琼脂糖凝胶电泳进行了60 V 2 h与此种运行缓冲。DNA凝胶的可视化紫外线照射下(22]。

2.8。统计分析

统计分析进行了GraphPad棱镜4统计软件(美国CA GraphPad软件Inc .)。单向方差分析(方差分析)与图基的多重比较的方法用于评估各种不同浓度的颗粒引起的反应和统计对比粒子大小与双向方差分析进行,其次是Bonferroni期末测验。时被认为是具有统计学意义的差异值小于0.05。

3所示。结果

3.1。粒子表征

TEM分析来确定粒子的形态和大小和显微图如图1。这些粒子被发现近球形,立方体的形状。粒子的主要尺寸估计从TEM图像(图1)提出了在桌子上2。在一个解决方案,因为纳米颗粒通常形成团聚体水动力分散粒子的大小和他们团聚体在细胞培养基使用ZetaPALS估计。这些值大于被发现本身通过TEM(表粒度测量2)。

3.2。细胞生存能力

THP-1细胞后24小时接触不同剂量(100,200,400,和800年μg / mL)纳米micro-CB颗粒,细胞代谢活动被MTT试验检测。细胞浓度和尺度依赖的方式生存能力下降后暴露在CB粒子(图2)和观测到了明显降低浓度从100年到800年μg / mL为纳米碳颗粒在400年和800年μ微碳颗粒的g / mL。纳米碳颗粒减少细胞生存能力的百分比从82%到41%,而微碳颗粒从69%下降到56%。大规模的选择性差异()纳米-微型碳被发现只有在800年浓度最高μ克/毫升。TC-50值(粒子浓度导致细胞死亡率50%)计算出纳米和微碳被发现是591.4μ和687.1克/毫升μ分别为g / mL(表3)。

3.3。THP-1细胞的吞噬能力

单核细胞的吞噬能力测试粒子的吸收后测量。进行了分析通过3种不同浓度的测试粒子,即1/2 TC-50, TC-50, 2 TC-50为每个粒子。显著减少指标乳胶珠子的吞噬作用发生在暴露于所有nano-CB粒子的浓度(),而没有观察到显著减少与他们的microsize(图3)。荧光图像代表单核细胞吞噬乳胶珠子(图4)。定性控制细胞被发现吞噬更多的珠子相比nano-CB粒子暴露单核细胞,而单核细胞的吞噬能力没有受到micro-CB粒子(图的存在5)。

3.4。促炎细胞因子

单核细胞分泌炎症介质和细胞因子刺激后通过各种代理。细胞释放促炎细胞因子(il - 1β肿瘤坏死因子-α和il - 6)和趋化因子(引发)的培养基测定当单核细胞暴露在TC-50 CB粒子浓度在不同的时间点(6、18、24和48 h)(图6)。碳颗粒表现出明显的大小和时间释放il - 1β、il - 6、TNF -α,从THP-1引发细胞(数字6(一),6 (b),6 (c),6 (d))。nano-CB粒子,有时间释放的细胞因子24 h拒绝之后虽然一直增加到48 h micro-CB粒子。纳米粒子比更大的粒子更有效诱导释放细胞因子()。

3.5。MCP-1和cox - 2 mRNA的表达

基因表达的一个重要upregulation MCP-1观察与CB粒子的大小(图7(一))。微米大小的CB粒子表现出比纳米(图MCP-1基因的表达7 (c))。然而,没有明显的变化是观察cox - 2基因表达的CB粒子(数据的大小7(一)和7 (b))与控制。

3.6。THP-1细胞的DNA分析

DNA损伤研究通过观察模糊模式在琼脂糖凝胶紫外线。暴露THP-1细胞CB粒子的大小为24小时没有表现出任何涂抹在琼脂糖凝胶(图模式8)。

4所示。讨论

不一致的影响不同的CB样本与致癌性和毒性报告(23,24]。这些不一致可能会与不同样本之间的粒子大小的变化。相比,因此,目前的体外研究纳米的潜在能力的差异,micro-CB颗粒接触人类单核细胞产生毒性,THP-1。纳米和微米大小的物理化学特征的CB粒子广泛的特点。粒子的平均尺寸是一致的大小由供应商提供。DLS分析发现培养介质中的水动力分散粒子的大小表明聚集在水媒体由电动电势测量进一步证实。不必惊讶,粒子的平均粒径大小和粒径分布(DLS)被发现增强当以水媒体相比,测量在干燥阶段(TEM)来衡量。减少粒子聚集和沉降的影响,悬浮粒子总是刚做好,每次实验前用。

在这项研究中,细胞毒性结果表明,CB比其更强大的微米大小的纳米粒子在导致毒性THP-1细胞MTT测定所揭示。这两个尺寸的粒子跟随在单核细胞毒性浓度。CB粒子在单核细胞吞噬能力的影响也证明。只有nano-CB粒子单核细胞的吞噬能力受损。我们的发现的不良nano-CB粒子暴露的细胞吞噬作用支持Renwick等人的研究结果表明,超细(CB和TiO₂)粒子受损的巨噬细胞吞噬作用在更大程度上比微粒相比,在质量的基础上(25]。

THP-1细胞的炎症反应的研究暴露在纳米和微粒子的CB显示诱导的促炎细胞因子il - 1β、il - 6和TNF -α。许多细胞因子包括il - 1、il - 6和TNF -α在急性炎症反应激活炎症细胞的功能。这些细胞因子增加血管通透性,从而引起肿胀和发红与炎症有关。il - 1和il - 6负责发热反应,而TNF -α刺激内皮细胞,负责低血压(26]。CB粒子的nanoform显示增加释放il - 1β和il - 6与增加曝光时间24 h,然后从其微米形式之后明显下降。肿瘤坏死因子-α分泌诱导在早期的时间点,也就是说,6小时,后来随着时间的减少。这是观察到il - 1的分泌β、il - 6和TNF -α细胞因子与微米与纳米尺度更深刻的大小。这表明粒子释放促炎细胞因子的响应大小的依赖。趋化因子是次要的促炎介质;也就是说,他们通常是由主要的促炎介质如il - 1、TNF。MCP-1在目前的研究中,基因表达,CC趋化因子,引发和释放,科学家趋化因子亚科的一员,进行了研究。MCP-1刺激单核细胞趋化性和几个细胞事件与趋化作用有关。本研究的结果显示趋化性的刺激了upregulation MCP-1基因和增加释放引发接触CB粒子。丹羽宇一郎et al。27)也表明il - 6的upregulation和MCP-1后在大鼠吸入暴露的CB和证实这个结果。引发是趋化因子起着关键作用的中性粒细胞的激活和炎症的招聘网站28]。结果表明增加曝光后引发的释放时间对CB粒子的大小。金等。29日]报道引发mRNA和蛋白表达增加的超细碳颗粒接触正常的人类支气管上皮细胞和支持的结果。明显,MCP-1基因表达调节微米大小的CB比计算。与另一个类似的结果观察趋化因子,引发,微米大小的CB能够引发更多的分泌以后引发的风险。另一个炎症标记,cox - 2,也进行了研究。cox - 2,环氧酶的诱导同种型,由几个促有丝分裂的诱导,炎性刺激包括有限合伙人(il - 1α和il - 1β)和肿瘤坏死因子-α(30.,31日]。在目前的研究中,CB粒子没有任何cox - 2表达的变化。总的来说,依照Ferin等的结果。32和李et al。33),发现nano-CB诱导毒性更大,比micro-CB人类单核细胞炎症反应。

在目前的研究中,CB粒子对人类单核细胞的DNA损伤的影响也进行了研究。在评估毒性,巨噬细胞DNA损伤是一个重要的结果,因为这些细胞(i)删除吸入NPs (34)和(2)DNA损伤被认为是一个重要的初始事件在各种疾病包括致癌作用[35]。结果表明,没有污点模式观察琼脂糖凝胶表明CB粒子的大小都没有造成DNA损伤。

总之,比较毒性研究纳米- micro-CB粒子导致尺度依赖的细胞毒性和提高人类单核细胞炎症反应,THP-1细胞。Nano-CB粒子改变单核细胞的吞噬能力虽然micro-CB对单核细胞吞噬能力没有显著影响。然而,这两个尺寸的CB粒子没有任何影响THP-1细胞的DNA。进一步的研究需要阐明的具体途径免疫细胞CB粒子引起的炎症反应。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢国防研究与发展组织主管瓜廖尔,印度为提供设施。他们承认先进仪器研究设施(AIRF),贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学(JNU),新德里,印度为纳米颗粒通过TEM表征。水动力的大小和电动电势测量粒子进行使用设施用香熏,由信息技术部,政府,印度和印度科学研究所的班加罗尔,印度。

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