5-Aminosalicylic酸抑制急性艰难梭状芽胞杆菌在老鼠身上毒素A-Induced结肠炎

文摘

我们测试的假设5-aminosalicylic酸(5-ASA)抑制毒素A-induced代结肠白三烯B₄(LTB₄)和毒素在大鼠结肠炎。孤立在麻醉大鼠结肠段治疗通过与毒素有或没有3小时30分钟的预处理与5-ASA或磺胺嘧啶然后结肠组织的LTB水平₄测量和炎症是评估。另外,柳氮磺胺吡啶是老鼠在他们的饮用水管理5天,孤立的结肠段然后准备,毒素管理,炎症是评估。LTB预处理与5-ASA抑制毒素A-induced增加组织₄浓度在结肠。柳氮磺胺吡啶和5-ASA但不是磺胺嘧啶显著抑制毒素结肠炎。然而,预处理5-ASA没有防止直接TRPV1-mediated结肠炎由辣椒素引起的。毒素刺激释放P物质(SP),这种效应也被柳氮磺胺吡啶和5-ASA但不是由磺胺嘧啶。因此,毒素刺激结肠LTB₄导致激活TRPV1,释放SP和结肠炎。抑制的5-LO 5-ASA扰乱了这个途径和支持LTB的概念₄激活TRPV1在毒素结肠炎中扮演了重要的角色。

1。介绍

艰难梭状芽胞杆菌产生外毒素如毒素,引起急性结肠炎症为特征的临床腹泻,痉挛和病态pseudomembranous结肠炎。毒素引起结肠炎的途径还不完全清楚。我们已经表明,口服柳氮磺胺吡啶抑制毒素的结肠炎大鼠(1]。柳氮磺胺吡啶是人类用于治疗慢性炎症性肠病(ibd),溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。柳氮磺胺吡啶分子由一个5-aminosalicylic酸偶氮键(5-ASA mesalamine)耦合的磺胺嘧啶的一个分子。两个组成化合物的偶氮键允许解偶联的腔的结肠细菌偶氮还原酶酶的作用导致局部交付的化合物2]。已经表明,5-ASA一半的柳氮磺胺吡啶治疗活性成分在加州大学和CD [3,4)和磺胺嘧啶基的活性,导致大多数的过敏和柳氮磺胺吡啶(不能容忍的影响5,6]。

的机理5-ASA在肠道炎症的治疗效果尚不清楚。提出了几种可能的机制包括抑制5-lipoxygenase (5-LO),病原反应酶生物合成的白三烯B₄(LTB₄)[5,7]。抑制5-LO是一种很有前途的候选人,因为展示了LTB之间的关系₄和人类的加州大学(5),因为其它5-LO抑制剂的功效在加州大学(8]。LTB₄还发现在更高浓度IBD患者比健康对照组(5]。此外,LTB₄已被证明是在动物模型中增加结肠炎(9- - - - - -12)和抑制5-LO减少组织LTB引起的₄水平和抑制结肠炎在这些模型11,13]。

我们展示了LTB之前₄激活瞬时受体电位vanilloid-1 (TRPV1)初级感觉神经元离子通道表达的回肠导致神经源性炎症,抑制TRPV1减少LTB₄和毒素A-induced回肠炎(14,15]。这一事实LTB₄是一种内源性TRPV1受体激动剂(16加上我们的演示,抑制5-LO抑制毒素A-induced回肠LTB₄水平和毒素——但不是LTB₄全身的回肠炎导致我们建议梭状芽孢杆菌通过刺激粘膜LTB毒素引起回肠炎₄生产TRPV1随后发起神经源性炎症介导的。

我们这里显示模拟结肠LTB 5-ASA减少毒素₄水平和SP释放5-ASA但不是磺胺嘧啶抑制毒素A-induced结肠炎。然而,5-ASA并不抑制直接TRPV1-mediated结肠炎引起的管腔内的辣椒素。总的来说,这些结果说明5-ASA抑制5-LO和柳氮磺胺吡啶的保护作用占毒素结肠炎。

2。材料和方法

2.1。材料

柳氮磺胺吡啶、5-aminosalicylic酸(5-ASA mesalamine)、磺胺嘧啶,辣椒素是购自σ(圣路易斯,密苏里州)。5′-Iodoresiniferatoxin (I-RTX)购买Tocris Cookson (Ellisville、钼)。艰难梭状芽胞杆菌毒素从TechLab购买,Inc .(弗吉尼亚州布莱克斯堡)。

2.2。手术

孤立的结肠段构造在男性Sprague-Dawley麻醉大鼠(150 - 175 g)如前所述施工回肠段(17,18]。孤立的结肠段5厘米长了远的盲肠结扎丝缝合。

2.3。药品监督管理局

毒素被管理在一个剂量的5μg在400年μL(或200μL后,给予其他药物)的PBS的腔隔离结肠段。5-ASA是溶解在磷酸缓冲盐(PBS)和注射通过200年卷μL毒素注射前30分钟。磺胺嘧啶最初溶解在二甲亚砜(DMSO),然后在PBS稀释到10% DMSO溶液。辣椒素是400年注射一剂4毫克μL(或200μL后,给予其他药物)盐水的25%的乙醇。管腔内的所有使用27 ga注射器针头注射了。控制老鼠准备相同,他们的孤立的结肠段注入适当的汽车解决方案。柳氮磺胺吡啶最初是在0.1 N氢氧化钠溶解在30倍所需的最终浓度和pH值调整到8.5与盐酸1 N的解决方案是用蒸馏水稀释30倍。柳氮磺胺吡啶是管理长期在此解决方案中作为5天的饮用水。柳氮磺胺吡啶的最终浓度使用从初步数据计算获得的动物每天喝的水。控制动物的饮用水是准备相同与柳氮磺胺吡啶的遗漏。动物喝了相同数量的柳氮磺胺吡啶车辆为自来水。这些研究是杜克大学和杜伦VA机构批准的动物保健和使用委员会。

2.4。腔的流体积累

腔的流体测量重量分析地积累。经过3个小时的治疗,孤立的结肠段被移除,体重,和他们的长度测量。腔的流体积累表示为毫克每厘米长度湿重。

2.5。髓过氧化物酶活性

髓过氧化酶(MPO)活动是测量如前所述19]。短暂的控制和治疗结肠段均质在50 mM KH hexadecyltrimethylammonium溴铵0.5%₂阿宝₄(pH值6)、三次冻融和离心机在4°C 2分钟,然后每一个上层清液的吸光度是阅读在0 460海里,30和60秒后的2.9毫升o邻联茴香胺盐酸盐到0.1毫升上层清液。每分钟的最大吸光度变化是用来计算的单位MPO活性氧化的基于摩尔吸光率指数o邻联茴香胺1.13×10⁴米⁻¹厘米⁻¹。结果表示为MPO活性单位每克组织湿重。

2.6。组织病理学

经过3个小时的治疗,一夜之间,相当于部分孤立的结肠段被固定在10%福尔马林,脱水,石蜡和嵌入式,然后5部分μ米厚度减少,安装在玻璃幻灯片,和与苏木精和伊红染色。

2.7。LTB₄测量

结肠LTB₄LTB水平测定₄酶免疫测定(EIA)试剂盒购自开曼化学(安阿伯市MI)如前所述15]。简而言之,结肠癌和结肠细胞腔的流体样品收集各种治疗后5卷的冰冷的0.1磷酸盐缓冲剂,pH值7.4,包含1毫米EDTA和10μ吲哚美辛和均质15秒在冰上使用Tekmar Tissumizer (Tekmar,辛辛那提,哦)50%的功率设定。均化之前,10000 cpm的³H-LTB₄(120 - 240 Ci /更易;优秀的生命科学,波士顿,MA)被添加到缓冲LTB的后评估₄复苏。均质化后,2卷的冰冷的乙醇添加到每个提取,提取被孵化冰上5分钟沉淀蛋白质。离心后3000×去除沉淀蛋白,乙醇在上层清液被真空离心去除。提取的pH值调整到1 ~ 4.0 M乙酸钠(pH值4.0)。由此产生的沉淀是被离心分离,上层是装上C-18固相萃取墨盒(开曼化工、安阿伯、MI)之前用甲醇和蒸馏水洗净,用蒸馏水洗净之后,己烷,然后在单位筛选了引力与5毫升的99%乙酸乙酯:1%甲醇。样品被蒸发真空离心干燥,在LTB重组₄EIA缓冲区,和化验设备制造商的指示。因为毒素引起的部分结肠粘膜抛弃到肠道内腔,腔的内容收集的注射器毒素经处理的结肠段和LTB化验₄内容就像结肠组织,和LTB₄结肠组织的内容和相应的为这些样品腔的内容都加在一起。因为它似乎不恰当表达LTB结果₄浓度单位湿重,因此,结果表示为LTB₄浓度每厘米结肠长度。

2.8。P物质释放

P物质(SP)释放被分析评估NK-1R内吞作用如前所述[14,20.与修改)。短暂、块结肠段取自控制毒素经处理,capsazepine预处理/毒素经处理的老鼠在一夜之间刚解聚4%多聚甲醛固定4°C。组织然后洗和嵌入在组织Tek O.C.T.化合物(樱花,托兰斯,CA),冻结,切割20岁μ米,安装在Superfrost / +玻璃幻灯片(费舍尔,匹兹堡,PA)。洗后,幻灯片被染色用兔抗血清(11886 - 5)特定c端15氨基酸鼠NK-1R的稀释1:300021]。其次是孵化的青蓝3-conjugated驴anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)的稀释1:600。分析了彩色部分使用蔡司lsm - 510元倒氪氩共焦激光扫描系统耦合的蔡司Axiovert 200非常贴切的显微镜。512×512像素的图像得到并使用Adobe Photoshop处理。量化NK-1R的内吞作用是通过分析20 NK-1R-immunoreactive (NK-1R-ir)每鼠肌间神经丛神经细胞体和确定这些细胞的数量超过10 NK-1R-ir核内体。肌间神经丛神经细胞体被确定大尺寸,位置之间的内部和外部层平滑肌肌外,神经束膜封装,和他们的形态。细胞质NK-1R-ir核内体是有别于NK-1R-ir等离子体膜或等离子体膜相关核内体通过确保核的神经元在相同的光学部分NK-1R-ir核内体。

2.9。统计分析

结果表示为均值±SEM (= 5 - 15)。指的是两组之间的差异被学生检查以及,几组间差异的意思是通过单向方差分析Dunnett或Tukey-Kramer后续测试,使用GraphPad InStat 3.05版本Windows (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

我们先前证明TRPV1激活有助于毒素A-induced炎症大鼠回肠(14,15,20.]但TRPV1的角色没有检查毒素A-induced结肠炎。因此,我们开始寻求确定药理TRPV1拮抗作用抑制毒素结肠炎是毒素老鼠回肠炎。管腔内的毒素管理引起一场激烈的大鼠结肠炎症类似之前观察大鼠回肠。毒素刺激腔的流体积累,MPO活性增加,并造成强烈的组织病理学表现为粘膜的丧失,折叠,表面溃疡,大量中性粒细胞(图1)。为了确定TRPV1介导的一部分毒素A-induced结肠炎回肠炎,结肠段进行了30分钟的管腔内的政府TRPV1-defunctionalizing TRPV1部分激动剂的浓度,I-RTX [22),在毒素注入。I-RTX显著抑制毒素A-induced腔的流体积累,MPO活性,组织病理学在冒号(图1回肠)一样。

我们之前提供了LTB的证据₄介导的炎症影响毒素大鼠回肠(15]。因此,我们研究了毒素的影响,5-ASA,毒素5-ASA预处理后的LTB水平₄在结肠。毒素刺激结肠组织的LTB浓度显著增加₄(图2)。对组织LTB 5-ASA独自没有显著影响₄浓度。管腔内的预处理的结肠段与100年30分钟μ克5-ASA抑制毒素结肠LTB A-induced增加₄水平(图2)。

当柳氮磺胺吡啶管理长期5天的老鼠在他们的饮用水,它本身没有影响但抑制毒素模拟腔的流体积累和MPO活性(图3)。我们下一个测试了柳氮磺胺吡啶的两个有效成分的影响,5-ASA和磺胺嘧啶。5-ASA就引起了一场小但是显著降低腔的流体积累但MPO活性没有影响。磺胺嘧啶给单独导致MPO活性显著增加,但不影响腔的流体积累(图3)。预处理的结肠30分钟前5-ASA毒素的管理导致高度显著抑制毒素A-induced腔的流体积累和MPO活性(图3)。预处理与磺胺嘧啶没有抑制毒素A-induced结肠炎症(图3)。组织病理学检查时,很明显,柳氮磺胺吡啶和5-ASA都高度保护的结构对毒素结肠炎症但磺胺嘧啶(图4)。

因为它曾被表明毒素刺激释放促炎的神经传递素通过激活TRPV1 [SP大鼠回肠14,17),我们认为如果5-ASA抑制毒素A-induced结肠炎通过阻断内源性的一代LTB等TRPV1受体激动剂₄,然后5-ASA和柳氮磺胺吡啶,但不是磺胺嘧啶,应该抑制毒素A-induced SP在结肠释放。因此,我们测量了SP释放在管腔内的毒素和测试在SP 5-ASA释放的影响。我们以前采用的评估NK-1R内吞作用的肌间神经丛神经细胞体的内源释放SP指数,指数发布本地SP如前所述的作用[14,17,20.,23]。管腔内的管理造成的毒素NK-1R内吞作用,反映从内部释放SP的作用,抑制了这种效应与柳氮磺胺吡啶治疗慢性和急性预处理5-ASA但不是磺胺嘧啶(图5)。当量化,毒素A-induced SP释放显著和柳氮磺胺吡啶5-ASA显著抑制毒素A-induced SP释放(图6)。磺胺嘧啶并没有显著地抑制毒素A-induced SP释放(图6)。

如果5-ASA块毒素结肠炎的一代通过抑制内源性LTB等TRPV1受体激动剂₄,我们推断5-ASA预处理不应该抑制结肠炎引起的一个代理,直接刺激TRPV1。辣椒素,辣椒的辛辣成分,是一种激活TRPV1的已被证明导致毒素引起的肠炎,非常类似于一个大鼠回肠(14]。管腔内的注射辣椒素的分离大鼠结肠段强烈的炎症引起,评估由腔的流体积累和增加组织MPO水平(图7)。段30分钟的预处理对capsaicin-induced结肠炎5-ASA没有影响,因此支持5-ASA预防结肠炎的概念通过抑制毒素A-induced LTB等代一个内生TRPV1受体激动剂₄。这些结果也表明5-ASA本身不是TRPV1拮抗剂。

4所示。讨论

我们的第一个目标是确定激活TRPV1在毒素A-induced结肠炎中发挥作用与毒素A-induced回肠炎在老鼠14,15,20.]。管腔内的毒素进入管理隔离段强烈的炎症引起的大鼠结肠相似前所述[24]。:经过30分钟defunctionalizing剂量时的具体TRPV1部分激动剂,I-RTX,毒素A-induced腔的流体和MPO活性显著抑制和正常结肠粘膜组织学是保存。TRPV1的抗炎效应抑制大鼠结肠类似的大鼠回肠先前表明激活TRPV1是重要的毒素回肠炎结肠炎以及。

毒素也刺激了LTB增加₄水平大鼠结肠正如它在兔子25和老鼠15回肠。我们之前已经证明LTB₄原因回肠炎与后毒素的管理和LTB炎症的影响₄和毒素的强烈抑制TRPV1对立(15]。此外,药物抑制抑制两种毒素A-induced回肠LTB 5-LO活动₄生产和回肠炎(15]。这些发现再加上LTB的观察₄是人类UC,促炎的药物含有5-ASA抑制LTB吗₄生产和结肠炎症在加州大学让我们假设5-ASA也可能抑制毒素抑制5-LO结肠炎的鼠结肠。之前显示5-ASA抑制毒素A-induced LTB₄释放和黏膜渗透性的甘露糖兔回肠但不抑制液体分泌或形态学损伤(25]。在目前的研究中,然而,5-ASA显著抑制毒素A-induced腔的流体积累和形态学损伤以及大鼠结肠MPO活动。这些不同的结果可能是由于物种差异,器官差异,或其他未知因素。

为了区分抗炎的作用机制从柳氮磺胺吡啶5-ASA,其中包含5-ASA耦合的一个分子一个分子的磺胺嘧啶通过偶氮键,我们分别测试了磺胺嘧啶的毒素的急性影响大鼠结肠炎的典范。这是非常重要的,因为5-ASA的活跃的一部分已被证明是在预防人类UC(柳氮磺胺吡啶3和直肠炎4),因为柳氮磺胺吡啶但不是5-ASA已被证明是一种抑制剂的促炎核转录因子、核转录因子(NF -κBκB) (26]。我们发现磺胺嘧啶没有对毒素的结肠炎大鼠的影响,表明5-ASA柳氮磺胺吡啶在毒素的活性成分是结肠炎,如同在人类UC和直肠炎。

目前的结果表明,柳氮磺胺吡啶治疗人类可能治疗有用梭状芽孢杆菌结肠炎。例如,尽管这种疾病通常是有效的抗生素治疗(27),某些情况下复发性疾病已被证明难以治疗的28)和新的、更致命的毒株梭状芽孢杆菌出现(29日这或许将要求央行拿出新的治疗方法。

一个有趣的观察有关目前的结果是5-ASA,一种已经证明有效的治疗药物慢性肠道炎症性疾病,如加州大学和CD,也强烈抑制急性梭状芽孢杆菌毒素A-induced结肠炎。尽管加州大学和CD的原因是未知的,有强有力的证据表明,他们与肠道共生的细菌,取决于一个T细胞介导的适应性免疫反应。相比之下,毒素结肠炎发生细菌外毒素,不是梭状芽孢杆菌有机体本身,过快发生在老鼠模型中涉及适应性免疫反应,并似乎主要由中性粒细胞介导的先天免疫反应(24,30.]。虽然5-ASA可能有不同的行动机制抑制慢性和急性肠道炎症,这可能是其抗炎效果是由于抑制5-LO在这两种情况下。支持这个概念来自动物研究表明,抑制5-LO也有效的阻止慢性结肠炎导致管理三硝基苯磺酸(TNBS) [11,13,31日,32]。此外,支持TRPV1参与慢性结肠炎来自动物TNBS结肠炎的研究(33,34),右旋糖酐sulfate-induced结肠炎(35,36],结肠炎引起的CD4细胞的过继转移⁺/ CD25⁻SCID小鼠T细胞(37]。根据这些观察,这将是未来重要的研究来确定LTB的角色₄激活TRPV1的人类炎症性肠病。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢道格拉斯c .借债过度的技术支持。这项工作是由一个退伍军人事务支持绩效评审格兰特和美国国立卫生研究院的资助dk - 50265。

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