不同的溶酶体来源于巨噬细胞的表型影响腹膜炎症功能和骨骼

文摘

溶酶体发挥重要作用在细胞外和细胞内的降解材料。这些动态细胞器也有助于营养传感和细胞信号通路。巨噬细胞代表一个异质群体的吞噬细胞,有助于组织内稳态和炎症。最近,有了新的兴趣了解巨噬细胞自噬的作用和溶酶体功能在健康和疾病。Thioglycollate-elicited腹膜巨噬细胞和骨骨髓来源是常用的体外系统主要研究巨噬细胞的功能。在这项研究中,我们揭示了戏剧性的基线差异溶酶体形态和功能之间的这些巨噬细胞的数量和提供的证据表明,这些差异可以功能相关。我们的研究结果提供了重要的见解在初级巨噬细胞溶酶体的多样性和说明的重要性占这个数据解释。

1。介绍

溶酶体是一个动态的细胞器,在酸性pH值,包含大量细胞降解途径的关键酶。吸收细胞外物质到达溶酶体通过内吞作用的通路,而细胞内的货物交付通过自噬溶酶体(1]。在分泌溶酶体也可以发挥作用,膜修复、细胞间隙通过溶酶体胞外分泌的过程2,3]。最近,溶酶体在细胞信号通路的重要性和营养传感也变得明显4,5]。重要的是,溶酶体结构和功能的调控是细胞类型相关,受环境刺激。

巨噬细胞是细胞的先天免疫系统的重要器官内稳态,炎症,宿主防御和组织修复6]。最近,有兴趣重燃巨噬细胞溶酶体生物学。巨噬细胞自噬在多个临床相关疾病的重要性有助于燃料这复兴7- - - - - -10]。此外,它还暴露出来,溶酶体通路激活il - 1β通过inflammasome释放在几个重要的人类疾病包括动脉粥样硬化、痛风、阿尔茨海默病(11- - - - - -13]。此外,脂质相关的过载和肥胖也能导致“脂肪组织巨噬细胞溶酶体重组”,这可能会导致营养过剩的代谢并发症(14]。在一起,这些和其他许多研究表明,额外的细胞和分子对巨噬细胞溶酶体功能的研究对理解至关重要细胞器在炎性疾病的作用。

体外分析原发性巨噬细胞将成为机械的重要细胞生物学实验调查在吞噬细胞溶酶体的功能。最常见的原发性巨噬细胞的来源包括骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)和巯乙酸- (TG)引起腹膜巨噬细胞(pmac卡)。尽管BMDMs和pmac卡来自完全不同的环境中他们往往交替使用模型巨噬细胞生物学。pmac卡是单核细胞衍生的细胞通常是孤立于腹膜腔TG政府(后3 - 5天15]。因此,以及积极参与炎症过程的决议,其中包括死细胞的吸收和/或碎片通过efferocytosis或吞噬作用,分别。相比之下,BMDMs来源于骨髓前驱细胞功能天真和将有更少的要求endosomal系统。在此基础上,我们假设将表型和功能上不同的溶酶体在这些基本巨噬细胞亚型。

在目前的研究中,我们调查了溶酶体内容,在pmac卡和BMDMs形态和功能。我们的数据表明,pmac卡有更大的溶酶体体积,增加了组织蛋白酶活性,增强几个溶酶体基因和蛋白的表达。此外,使用的例子lipotoxic inflammasome,我们提供的证据表明,这些差异在溶酶体舱可以影响巨噬细胞炎症反应。在一起,我们的研究结果认为,解释数据涉及lysosome-dependent流程在初级巨噬细胞必须考虑细胞的来源。

2。材料和方法

2.1。试剂

CAO74-ME bafilomycin来自恩佐生命科学。Lysotracker红色和TMR-dextran (10000 MW)表达载体。组织蛋白酶B活性测定是免疫细胞化学技术。超纯大肠杆菌有限合伙人来自Invivogen。巯乙酸Difco。脂肪酸来自Nu-Chek预科。组织蛋白酶D和LAMP1抗体来自Abcam。从Sigma-Aldrich肌动蛋白抗体。CD107a (LAMP-1) PE共轭抗体来自eBiosciences(猫# 12 - 1071)。罗福斯的ATG5抗体生物制剂。从Lampire Ultrapure-bovine血清白蛋白(BSA)和测试TLR配体污染之前使用。

2.2。细胞培养

腹膜巨噬细胞(pmac卡)隔绝C57BL / 6小鼠腹腔内注射后4天镀3.85%巯乙酸和密度细胞在DMEM /毫升含有10%胎儿血清灭活(IFS), 50 U /毫升青霉素G钠、硫酸链霉素和50 U /毫升(pen-strep), 2毫米谷酰胺、丙酮酸钠。刺激后的第二天进行收割。骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)是由收获的股骨和胫骨骨髓8-12-week-old C57BL / 6小鼠。细胞被播种在10厘米的菜肴和分化DMEM媒体6天以上与上层的10%来自CMG14.12细胞补充的csf (16]。6天,BMDMs镀浮在表面的细胞/毫升媒体包含5% CMG14.12细胞。刺激后的第二天进行收获包含5% CMG1.12媒体在媒体。流式细胞仪实验,巨噬细胞培养在低依从性板块(他一一Bio-One)促进细胞收获。细胞被删除从板洗涤与PBS其次是10分钟细胞脱衣舞娘(GIBCO)然后用EDTA 10分钟/胰蛋白酶(σ)。生长介质与棕榈酸酯和BSA补充2:1摩尔比率如前所述[17)和BSA-supplemented媒体被用作控制。对细胞的刺激,PBS或有限合伙人(50 ng / mL)被添加到包含媒体BSA或游离脂肪酸。流式细胞术进行了BD生物科学FACSCalibur机器上使用Flowjo软件和数据进行了分析。

2.3。老鼠

野生型(WT) C57BL / 6小鼠获得东方生物科学和维护我们的鼠标的殖民地。ATG5flox X LysM-Cre对C57BL / 6背景提供的请跳过处女(华盛顿大学)。老鼠在一个无菌设施维护标准的食物饮食随意(6%的脂肪)。所有动物实验严格按照国家卫生研究院的指导方针,综述了人道对待动物和动物研究委员会华盛顿大学医学院的。

2.4。RNA分离和定量rt - pcr

细胞总RNA分离使用试剂盒RNeasy列和使用高容量相对地转录cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司)。实时执行中存在使用SYBR绿色试剂(应用生物系统公司)thermocycler ABI 7500快。相对基因表达决心使用δCT方法规范化36 b4表达式。老鼠引物序列如下(所有5′3′):36 b4甘氨胆酸(forward-ATC有条件现金援助广汽20 20 TGA, reverse-TGC ATC TGC TTG GAG CCC ACG TT);ctsB(forward-GAT CAA GGA CCA CCA猫CC, reverse-CTT gg AGT GCA CGG GAG AG);ctsD太极拳在20 (forward-GAC AGC TGG标签助教,reverse-CAA CAG亚美大陆煤层气有限公司CTG GTG广汽AA);ctsK(forward-TGC资本GGC GTT ATA猫交流,reverse-CGG CTA答广汽CAC TGC CT);LAMP1(forward-TCT柠檬酸GTG TGC gg AG移行细胞癌,reverse-ATG gg ACG ATG gg ACCAG);LAMP2A(forward-CCA AAT TGG手枪有条件现金援助AAC CTA, reverse-TGG柠檬酸AGC AGT GTT答TAA TTC C);LAMP2B(forward-GGT GCT GGT CTT柠檬酸GGC TTG ATT, reverse-ACC ACC CAA TCT亚美大陆煤层气有限公司AGC gg ACT):ATP6V1H甘氨胆酸(forward-AGA CAG CCA ACA CAC TG,逆柠檬酸CAG AAA CTT CGT GGC AG);p62(forward-GCT GCC CTA TAC CCA猫CT, reverse-CGC CTT猫20 AGA AAC);LC3(forward-CGT有条件现金援助GGA CAA广汽CAA GT, reverse-ATT GCT GTC 20 AAT GTCTC)。

2.5。西方墨点法

细胞总蛋白被隔离在150毫米生理盐水溶解细胞,10毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8)液,特里同x - 100 1%, 1 x蛋白酶完成。蛋白质分离TGX梯度凝胶(4 - 20%;Biorad)和转移到硝酸纤维素。组织蛋白酶D和肌动蛋白免疫印迹是执行使用40μg细胞总蛋白。

2.6。LAMP1流式细胞术

表示刺激后,pmac卡被从板如上所述,固定在4% PFA在室温下15分钟在黑暗中。固定后,细胞permeabilized (PBS + 0.1% Triton X) 15分钟在黑暗中,用流式细胞仪缓冲+ 0.1% Triton X细胞治疗与Fc受体块冰(BD Pharmigen) 5分钟后通过孵化CD107a (LAMP1) PE抗体在黑暗中30分钟在冰上。细胞被洗的流式细胞仪缓冲流仪结果紧随其后。

2.7。溶酶体成像

表示刺激后,细胞从板中删除如上所述,然后沾500海里lysotracker红色组织培养媒体15分钟37°C。染色后,细胞与PBS洗了三次,收获如上所述,通过流式细胞术和分析。对荧光右旋糖酐实验中,巨噬细胞与500年孵化μ(g / mL tetramethylrhodamine) -咯-右旋糖酐2 h在常规媒体。免疫荧光显微镜,巨噬细胞被镀在无菌玻璃盖玻片染色紧随其后。Lysotracker红色或TMR-dextran染色细胞在4%多聚甲醛固定10分钟与赫斯特33342年的核染色染料紧随其后。封面都安装在使用蔡司共焦显微镜玻片和成像。

2.8。组织蛋白酶B活动流式细胞术

表示刺激后,pmac卡被从低依从性盘子如上所述。荧光标记的组织蛋白酶B衬底是按照制造商的说明重组和稀释IFS在DMEM + 10%。巨噬细胞在150年被孵化μL染色溶液为45分钟37°C下5%的股份有限公司₂与温和的混合每10分钟。在孵化后,细胞被洗2次1毫升的PBS和分析通过流式细胞术(FL2)。

2.9。il - 1βELISA

后上层清液从巨噬细胞收获文化暗示刺激。il - 1β是量化使用DuoSet酶联免疫试剂盒(研发系统)根据制造商的指示。

2.10。统计数据

使用GraphPad棱镜软件执行统计分析。所有结果都表示为±SE。组织被成对的学生相比以及。的值被认为是显著的。

3所示。结果/讨论

3.1。溶酶体内容和活动中增强比BMDMs pmac卡

调查溶酶体间的差异以及BMDMs相比,我们量化溶酶体体积在初选这两组巨噬细胞使用lysosomotropic染料lysotracker红色加上流仪分析。使用这种方法,溶酶体内容在pmac卡相对于BMDMs显著增加(数据1(一)和1 (b))。也符合这一发现,pmac卡的水平明显高于有溶酶体膜蛋白LAMP1 BMDM相比(数字1 (c)和1 (d))。这些发现支持扩大溶酶体舱在pmac卡的存在。溶酶体蛋白酶评估函数,我们分析了活动组织蛋白酶B使用fluorogenic衬底神奇的红色。如数据所示1 (e)和1 (f)组织蛋白酶B活动增加以及BMDMs相比。

3.2。不同的溶酶体大小和形态在pmac卡BMDMs相比

溶酶体有不同的形态出现,可以随细胞类型和激活状态包括球体,卵圆形,或管状。此外,溶酶体的大小可能显著不同(18]。可视化溶酶体在pmac卡和BMDMs,我们利用两个互补immunofluorescent方法:(1)lysotracker红染色和(2)tetramethylrhodamine——(咯)葡聚糖染色。Lysotracker红色自由穿过细胞膜和集中在酸性细胞器而TMR-dextran都是通过内吞作用和达到溶酶体~ 30分钟。溶酶体的大小和形态相似(图使用染色技术2)。引人注目的是,pmac卡比BMDMs更大的溶酶体。此外,形态更经常卵圆形和管状pmac卡和球形BMDMs(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。值得注意的是,以及溶酶体形态类似于描述从脂肪组织巨噬细胞在高脂肪喂养14]。刺激BMDMs或pmac卡有限合伙人不导致溶酶体形态的重大变化(数据没有显示)。

3.3。溶酶体基因和蛋白表达明显比BMDMs pmac卡

新兴的数据表明,溶酶体生物起源和功能是在转录水平的监管部分(19]。因此,我们比较几个溶酶体,自噬相关基因的表达在BMDMs和pmac卡。与流式细胞术和成像数据一致,基因的表达编码组织蛋白酶蛋白酶、溶酶体膜蛋白,空泡的atp酶增加pmac卡相对于BMDMs(图3(一个))。此外,自噬相关基因LC3在更高的级别上和p62也表达了在pmac卡(图3(一个))。因此,溶酶体,自噬相关基因的mRNA表达在pmac卡增加,这可能是导致扩大在这些主要巨噬细胞溶酶体室观察。在蛋白质水平,pro-cathepsin D蛋白质含量增加以及相对于BMDMs(数字3 (b)和3 (c))。流式细胞仪数据相似,LAMP1倾向于增加蛋白质含量以及相对于BMDMs(数字3 (d)和3 (e))。有趣的是,LAMP1明显更大的分子量BMDMs提出更高层次的糖基化,这一发现可能会进一步影响溶酶体功能与稳定这两种主要的巨噬细胞(图3 (d))。

3.4。溶酶体的不同表型转化为不同的激活机制Lipotoxic Inflammasome

调查是否观察到溶酶体表型的差异调节巨噬细胞炎症反应,我们探讨了lipotoxic inflammasome作为一个模型系统。我们和其他人已经表明,有限合伙人和棕榈酸饱和脂肪酸(SFA)触发释放il - 1β通过一个NLRP3和半胱天冬酶1-dependent机制(20.- - - - - -22]。在先前的研究中使用这个系统,它已经表明,il - 1β从pmac卡依赖溶酶体损伤和组织蛋白酶释放蛋白酶,而溶酶体的作用在BMDMs还不太清楚21]。直接比较pmac卡和BMDMs使用这个系统,我们同时刺激细胞类型有限合伙人的棕榈酸酯和释放il - 1的浓度增加β被量化。pmac卡和BMDMs分泌il - 1β以剂量依赖的方式;然而,以及持续分泌细胞因子的5 - 10倍BMDMs尽管使用同样数量的细胞(数字4(一)和4 (b))。重要的是,英足总吸收和pmac卡之间的相似BMDMs(数据没有显示)。与之前的研究一致,il - 1β释放pmac卡几乎完全阻止了组织蛋白酶B抑制剂,CAO74,或溶酶体酸化缓蚀剂,bafilomycin (BAF)治疗的palmitate-LPS pmac卡(图4 (c))。这不是在BMDMs il - 1β释放被CAO74影响,实际上增加了BAF(图4 (d))。因此,溶酶体抑制剂不同影响lipotoxic inflammasome激活pmac卡BMDMs相比,观察之间的差异也许可以解释一些之前的出版物(20.- - - - - -22]。更重要的是,这些研究结果认为基线溶酶体内容和功能差异pmac卡和BMDMs可以改变这些细胞对炎症刺激的反应。

溶酶体自噬降解的货物也是很重要的,它还可以调节inflammasome响应(23]。使用ATG5 KO细胞,因此,我们测试了自噬缺陷的影响在激活lipotoxic inflammasome pmac卡与BMDMs。我们可以看到数据4 (e)和4 (f)表型观察到使用这些初级巨噬细胞自噬缺陷细胞是不同的系统。在pmac卡,ATG5 KO细胞il - 1的适度增加β释放有限合伙人治疗后(图4 (e)插图),但il - 1βpalmitate-LPS刺激后分泌减少而WT细胞(图4 (e))。在区别,ATG5 KO BMDMs释放il - 1β为了应对有限合伙人和palmitate-LPS治疗(图4 (f))。这不是有关ATG5蛋白质表达的差异,这是两种不同类型的巨噬细胞(图之间的相似4 (g))。相反,溶酶体功能障碍的发展以及对待palmitate-LPS遗传自噬缺陷或许可以解释为什么不进一步加强inflammasome激活(24]。相比之下,ATG5 KO BMDMs拟表型细胞BAF处理,也能抑制自噬流量。这些发现认为,基因或药物抑制自噬在BMDMs揭露这个降解过程的一个重要抑制作用lipotoxic inflammasome激活。进一步的调查将是必要的评估机制,说明这些微分表型。有趣的是,最近的证据表明,自噬可以增加溶酶体活性,这可能是对于BMDMs尤其重要,因为他们不活跃在基线(溶酶体25,26]。综上所述,这些数据表明,pmac卡和BMDMs应对lipotoxic刺激通过完全不同的机制,以及至少部分这些差异与不同的溶酶体的表型。

本文给出的结果说明几个溶酶体在pmac卡和BMDMs之间的显著差异。具体来说,pmac卡显示增强溶酶体体积、大小和组织蛋白酶活动。“激活”溶酶体舱pmac卡可能反映了他们接收到的信号的炎症性腹膜炎的设置。相比之下,BMDMs天真的巨噬细胞,没有遇到“激活”的信号。使用的例子lipotoxic inflammasome外,我们还提供证据表明,不同的溶酶体表型观察BMDMs和pmac卡可以影响巨噬细胞炎症功能。因此,当进行实验与原发性巨噬细胞溶酶体的功能,是十分关键的基线溶酶体占表型,以确保适当的解释数据。我们认为BMDM与pMAC卡的选择应根据实验的具体研究问题,和较低的阈值应该存在比较多个巨噬细胞的数量。此外,进一步比较分析pmac卡之间的溶酶体,BMDMs和其他体内孤立巨噬细胞有必要揭示溶酶体的动态调节附加这些重要的白细胞。

缩写

TG:	巯乙酸
BMDM:	骨骨髓来源的巨噬细胞
pMAC卡:	腹膜巨噬细胞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Kassandra韦伯进行了实验和论文的写作。乔尔·d·先令设计和解释实验和写论文。

承认

作者感谢Ahbinav睡椅的评论。

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