文摘
研究旨在确定活化蛋白C的影响的系统性炎症APCAP(活化蛋白C在急性胰腺炎)试验我们32严重急性胰腺炎患者随机接受重组活化蛋白C (drotrecogin阿尔法激活)()或安慰剂()为96小时。在目前的研究中,我们报告的时间进程病人的血浆或血清可溶性标记(引发、il - 6、il - 10、IL-1ra sE-selectin, PCT)和单核细胞和中性粒细胞细胞表面(CD11b, CD14、CD62L HLA-DR)标记的系统性炎症反应在第一次随机化后14天。干预和安慰剂组比较的结果表明,重组APC治疗并没有改变的系统性炎症严重的急性胰腺炎。我们发现是依照临床发现APCAP试验表明多器官功能障碍的干预并不影响演化。
1。介绍
急性胰腺炎(AP),腹部疼痛的常见原因,通常是一个温和,自限性疾病。然而25%的病人患有严重的美联社(SAP) [1),和20%的SAP患者死亡,2),主要是由于多个器官功能障碍的发展(3]。系统性炎症,典型的美联社,被认为是导致器官功能障碍的发展。它的特点是(我)循环的促炎细胞因子水平的增加(4,5),抗炎细胞因子(6- - - - - -9),而可溶性E-selectin (sE-selectin) [10- - - - - -12),激活血管内皮标记,(ii)发生激活吞噬细胞在循环13,14),(3)减少HLA-DR表情血液单核细胞(9,13,15,16),表示免疫抑制的发展。
活化蛋白C (APC)血浆丝氨酸蛋白酶,对凝固的影响,细胞凋亡和炎症(17]。APC作为内生抗凝剂,促进纤维蛋白溶解,抑制血栓形成。蛋白C,一个不活动的前兆,转化为活化蛋白C在内皮thrombin-thrombomodulin复杂(18]。这个过程是加速内皮PC受体的存在(EPCR) [19]。APC procoagulation因子灭活Va和VIIIa关闭凝血通路。APC纤溶酶原激活物抑制剂也使其失去活性,从而导致增加纤维蛋白溶解(18]。
APC也cytoprotective影响如抗炎、抗凋亡、和内皮屏障保护作用[20.]。
促炎细胞因子上调凝血酶形成和表达下调宿主的抗血栓形成的机制,尤其是蛋白C (PC)通路了(21]。缺乏个人电脑和减少代PC (APC),激活的主要内生抗凝的人,据美联社(与器官功能障碍的发展22]。在脓毒症患者人类重组APC的持续时间缩短呼吸功能障碍和加速冲击的逆转23]。我们研究了在随机试验中严重的AP患者和没有发现差异进化的multiorgan APC和安慰剂组之间功能障碍(24]。然而,APC对SAP患者的炎性标志物的影响还没有被研究过的随机对照试验。
因此,我们旨在确定APC干预对等离子体的影响水平的促炎(引发)赞成/抗炎(il - 6)和抗炎(il - 10, IL-1ra) [25)细胞因子和sE-selectin激活标记血液单核细胞(CD14、CD11b CD62L)和中性粒细胞(CD11b CD62L) HLA-DR单核细胞表面表达的水平,免疫抑制的标记,和血清水平的原降钙素(PCT),一个标记中使用的全身炎症的临床决策。
2。对象和方法
2.1。病人和健康受试者
我们之前进行了一项随机研究APC SAP患者的24]。简而言之,这种前瞻性随机双盲研究包括分析32例SAP患者的赫尔辛基大学三级护理单元中心医院2003年6月至2007年8月。入选标准是(1)住院< 96 h发作的疼痛,(2)增加三倍血清淀粉酶(IU / L)超过正常范围上或/和验证的SAP在计算机断层扫描中,(3)至少一个器官功能障碍(OD)定义为连续的器官衰竭评估(沙发)至少3 4,和(4)从第一OD < 48小时。病人被随机分配接受APC (drotrecogin阿尔法激活)()或0.9%生理盐水作为安慰剂()。APC为96小时的剂量管理24μ克/公斤/小时。
我们参考血样分析获得的细胞表面标记流式细胞术的65名健康志愿者(137个样本)从医院和实验室工作人员没有药物和没有感染的迹象。监控水平的荧光强度,从一个健康志愿者血液样本研究根据研究协议一周一次。有58个妇女和参照组7人。在重复抽样的情况下,意味着使用的数据。
研究伦理委员会批准的协议是赫尔辛基大学中央医院。知情同意是获得所有的病人或其近亲。注册研究协议ClinicalTrials.gov(NCT01017107)。
2.2。血液样本
当病人满足入选标准我们收集外周血样本测定细胞标记首次静脉穿刺的炎症。病人被随机分配。后续的样本收集后的第三,第五,第七,第14天。血液样本为流式细胞术和等离子体测量实际上与pyrogen-free acid-citrate葡萄糖(ACD)。血样立即在冰水浴冷却,保持在0°C到染色流式细胞术。等离子体被离心分离+ 4°C和储存在−70°C到细胞因子的浓度和sE-selectin确定。同时收集血液样本测定血清PCT。
2.3。分析可溶性标记
il - 10、il - 6的浓度、引发IL-1Ra, E-selectin血浆样品测定酶免疫测定(EIA)通过使用商业试剂(il - 6和il - 10: PeliPair ELISA, Sanquin,阿姆斯特丹,荷兰;引发:选择环评,BD生物科学、Erembodegem比利时;IL-1Ra:两组ELISA、研发系统欧洲有限公司Abindgon,英国;E-Selectin: ELISA, HyCult生物技术、Uden、荷兰)。检测极限和intra-assay interassay变异系数(CV %)如下:il - 6: 0.3 pg / mL, 3.6%和5.4%;引发:1.6 pg / mL, 3.5%, 3.4%;il - 10: 0.3 pg / mL, 3.7%, 5.9%;IL-1Ra: 10 pg / mL, 4.2%, 5.2%;E-selectin 20.5 pg / mL, 3.5%, 6.9%。
原降钙素(PCT)测量使用ADVIA半人马XP免疫测定系统ADVIA半人马勃拉姆斯PCT测定。化学发光免疫分析法测定是一个三明治用单克隆抗体荧光素共价链接到顺磁粒子和两个原降钙素的抗体和荧光素标记。根据制造商,within-run方法的精度是4.3%,1.5%,1.5%,PCT为0.2,0.97和65.9μ分别g / L。between-run精度为8.5%,2.1%,7.2%,相应的浓度。试验的检测极限是0.04μ75 g / L和稀释点μg / L。
2.4。细胞表面标记物的分析
单克隆抗体和流式细胞术
单核细胞CD14表达、CD11b CD62L HLA-DR和中性粒细胞表达CD62L CD11b使用全血流式细胞术测定,如前所述[9,13]。单克隆抗体(mAb)如下:藻红蛋白(PE)和异硫氰酸荧光素(FITC)配合anti-CD14马伯(IgG2b克隆MFP9), PE共轭anti-HLA-DR马伯(IgG2a克隆L243),反CD11b mAb (IgG2a克隆D12)和控制鼠标IgG2a,马伯,FITC共轭anti-CD62L马伯(IgG2a克隆SK11)。所有的试剂都从正欲购买(美国加利福尼亚州圣何塞)。染色的整除的血液样本在0°C流式细胞术进行了如前所述[9,13]。数据采集和分析是由一个FACSCalibur流式细胞分析仪和细胞追求软件(BD科学,圣何塞,CA)。中性粒细胞被确定的光散射特性和单核细胞CD14克隆标志。单核细胞HLA-DR表达决心HLA-DR积极的单核细胞的比例,如前所述[13]。荧光强度提出了相对荧光单位(RFUs)。
2.5。统计分析
随机研究的主要终点是沙发评分的变化。研究样本量确定根据主要终点:会有三点不同改变沙发组(之间的分数和力量的80%)24]。值作为中位数和范围。比较两组之间的标记水平(APC组和安慰剂组)是由Mann-Whitney执行的U以及。以防重复抽样的健康志愿者意味着数据被用来获得一个值为每个人,之后使用中位数。的Wilcoxon符号秩检验使用重复测量的比较。一个区别值小于0.05的被认为是具有统计学意义。使用SPSS19.0统计软件进行统计分析(芝加哥,伊利诺斯州)。
3所示。结果
3.1。病人
32 SAP患者的特点给出了表1。除了一个ICU患者承认。ICU的患者承认之前1 0天(0 - 3天)APC组和2 0(1 - 2天)在安慰剂组()。APC组有两个nonsurvivors:一个在收到13个小时的APC注入另一个有41小时的APC灌注后剖腹手术。
3.2。溶性标记
促炎细胞因子引发的所有患者的血浆浓度下降在入院后的第一个五天(0天:264 pg / mL和第五天:110 pg / mL,)。APC治疗没有显著影响的变化引发的浓度在随访期间(表2)。
等离子体浓度的pro - /抗炎细胞因子il - 6(图1),所有患者抗炎细胞因子il - 10和IL-1Ra下降的第一个五天随访期间(il - 6 0天:670 pg / mL和第五天:215 pg / mL,;il - 10 0天:12.7 pg / mL和第五天:11.3 pg / mL,;IL-1Ra 0天:2890 pg / mL和第五天:1250 pg / mL,)。APC治疗没有任何重大影响il - 6的变化,il - 10, IL-1Ra浓度在第一次随访5到14天的时间(表2)。
所有患者血浆浓度的可溶性E-selectin下降沿病程(0天:45.5 ng / mL和第五天:38.2 ng / mL,),但是APC治疗没有任何重大影响sE-selectin浓度(表的变化2)。
原降钙素的血清浓度没有明显的变化,所有的病人在第一个五天(0天:0.97 ng / mL和第五天:0.66 ng / mL,APC)和管理没有改变PCT浓度的变化(表2)。
3.3。细胞表面标记
标记的免疫抑制单核细胞HLA-DR所有病人的表达没有明显改变前五天的随访期间(0天:54%,第五天:58%,)。既没有APC注入任何影响HLA-DR表达式(表3)。
细胞表面的表达CD11b, CD14、CD62L测定活化的单核细胞的标记。CD11b的细胞表面表达,在单核细胞CD14、CD62L所有患者中表达下调前5天(MoCD11b 0天:291年RFU与第五天:200 RFU,;MoCD14 0天:168年RFU与第五天:150 RFU,;MoCD62L 0天:217年RFU与第五天:135 RFU,)。的表达CD11b, CD14、CD62L安慰剂和APC-treatment之间没有显著差异组(表3)。
CD11b的表达式和CD62L测定中性粒细胞激活的标记。CD11b和CD62L(图的表达式2)的所有病人都表达下调前五天的随访期间(PMNCD11b 0天:325年RFU与第五天:259 RFU,;neutrCD62L 0天:146年RFU与第五天:81 RFU,)。APC治疗没有任何效果的变化CD11b或CD62L表达式对中性粒细胞细胞之间天0和5(表3)。
4所示。讨论
结果表明,重组APC (drotrecogin阿尔法激活)治疗SAP患者并没有改变全身炎症的过程中,确定使用溶性和系统性炎症反应的细胞标记。这是依照这些患者的临床结果,这表明沙发得分变化,organ-failure-free天,加护病房或住院时间,ventilator-free天,肾脏替代therapy-free天,vasopressor-free天或几天活着以外医院(60天)APC和安慰剂组之间是相似的(24]。细胞因子在后续的整体下降趋势类似于早期的结果,表明赞成和抗炎破裂早期现象严重的美联社(15]。
一些体外和动物实验表明,APC抗炎活性。管理APC可以下调炎性细胞因子和趋化因子的表达。APC块从Th2细胞细胞因子的生产26]。APC已被证明会降低生产的endotoxemia-induced促炎细胞因子(il - 6,引发、IL-1beta和TNF阿尔法)(27]。从单核细胞在体外生产引发被APC (LPS-stimulated THP-1细胞)(28]。体外APC可以抑制由人类中性粒细胞趋化性和释放il - 6 (29日]。APC抑制tnf生产通过阻断核转录因子(NF) kB转录因子在单核细胞(30.]。APC可以上调抗炎介质,如il - 10在严重脓毒症患者血液单核细胞(31日]。APC还可以阻止贩卖白细胞减少的表达粘附分子(ICAM-1, E-selectin, VCAM-1)内皮(32- - - - - -35]。
已经建立了一些临床试验评价APC治疗脓毒症患者。在能力试验中他们发现,重组体人活化蛋白C (drotrecogin阿尔法)降低死亡率在严重脓毒症患者36]。在这个随机多中心试验他们发现减少肺动脉栓塞的水平和患者的血浆il - 6水平被视为APC(抗炎作用的证据23]。HLA-DR表达式,作为免疫抑制的标志,已被证明与PC和APC级别在SAP (22]。尚未发表PROWESS-SHOCK试验结果初步表明APC没有有益影响28天脓毒性休克患者的生存期。
没有之前的随机试验审查APC SAP患者的影响,也没有这样的证据SAP的APC对炎症的影响。本研究炎标记支持这样的观点,APC治疗不影响全身炎症的过程中在协议没有发现影响器官功能障碍(24]。
该研究的局限性。研究样本大小()是决定根据主要终点而不是为对比组之间的系统性炎症反应。另外后续样品的数量/病人减少在第五天()和14天();因此不可能排除II型错误。
5。结论
重组APC (drotrecogin阿尔法激活)治疗SAP患者并没有改变全身炎症的过程中,确定使用溶性和系统性炎症的细胞标记。
缩写
| APCAP: | 活化蛋白C在急性胰腺炎 |
| 记者: | 急性胰腺炎 |
| SAP: | 重症急性胰腺炎 |
| PC: | 蛋白质C |
| APC: | 活化蛋白C |
| PCT: | 原降钙素 |
| OD: | 器官功能障碍 |
| 沙发: | 连续的器官衰竭评估 |
| 环境影响评价: | 酶免疫分析 |
| RFU: | 相对荧光单位 |
| 加护病房: | 重症监护室 |
| 实力: | 重组人蛋白C激活全球评估在严重脓毒症。 |
确认
这项研究是支持由赫尔辛基大学中央医院研究基金,赫尔辛基芬兰坦佩雷大学医院的竞争研究经费,坦佩雷,芬兰。