文摘
胰腺炎是一种原因不明的炎性疾病。有许多诱因导致胰腺炎,如酒类、胆总管石头,病毒和先天性或获得主胰管狭窄,通常涉及组织损伤。胰腺炎通常发生在无菌条件下,死者死亡/胰腺实质细胞和坏死组织来自self-digested-pancreas观察。然而,组织损伤之间的因果关系和胰腺炎以及如何组织损伤能诱导胰腺的炎症没有完全阐明直到现在。这项研究表明胞质DNA双链增加几种炎症基因的表达(细胞因子,趋化因子,I型干扰素和主要组织相容性复合体)在大鼠胰腺星状细胞。此外,这些增加伴随着多种信号分子基因,如干扰素调节因子、核factor-kappa B,低分子量蛋白2及抗原处理相关转运子1。我们认为,这种现象是一种合理的机制,可能解释细胞损伤胰腺或组织损伤引发急性,慢性自身免疫性胰腺炎;它可能是宿主免疫应答的诱导期间饮酒相关或其他原因。
1。介绍
1998年,胰腺星形细胞称为胰腺星状细胞已经被识别和特征1,2]。在一个正常的胰腺,已经是静止的,可以确定的存在维生素在细胞质中包含脂滴。胰腺损伤或炎症,他们从静止表型转换成myofibroblast-like细胞,积极自我繁殖,表达α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma),产生的I型胶原等细胞外基质成分3- - - - - -5]。虽然从静止到激活已经引发了各种类型的分子,最近的证据表明,组件的死/宿主细胞死亡也可能触发这种转变(6]。
本研究旨在确定主机双链DNA (dsDNA)导致的功能已经被,尤其是炎症。虽然DNA是历史上被认为是免疫惰性,现在升值,DNA可以被免疫系统7,8]。例如,unmethylated CpG主题,表达了在高频细菌DNA,引起淋巴细胞、树突状细胞、胰腺星状细胞增殖和分泌免疫球蛋白和/或细胞因子(9- - - - - -11],dsDNA上调表面的表达主要组织相容性复合体(MHC)分子在甲状腺细胞(12]。虽然DNA通常隐藏在细胞核,它可以释放到体循环当细胞接受坏死或凋亡。暴露于DNA与自身免疫和炎症性疾病的发展,一直在观察DNase-deficient老鼠(13]。公布的这些发现让我们假设dsDNA受伤的宿主细胞可以作为一个“危险信号”,影响了已经。
在这里,我们报告,胞质dsDNA引发各种炎症基因的表达,发挥作用的组织损伤,介导的炎症活动主机dsDNA。
2。材料和方法
2.1。材料
保利(dA: dT),聚(dI:直流),鼠标antirat alpha-smooth肌肉肌动蛋白抗体,和2000年lipofectamine获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。Antimouse免疫球蛋白Alexa 555 -共轭抗体从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。
2.2。已经被隔离和细胞培养
已经被分离从雄性Wistar鼠密度梯度离心的方法。细胞保持完整的DMEM / F-12:这是一个混合的DMEM(杜尔贝科的修改鹰介质)和火腿的混合物F-12营养补充10%胎牛血清,50单位/毫升的青霉素,50毫克/毫升的链霉素(美国所有从表达载体,卡尔斯巴德,CA)。所有与细胞实验进行段落3和4之间。除非专门描述,我们已经在无血清培养基孵化24小时之前的实验试剂。所有动物程序依法进行指导委员会的九州大学的动物保健。
2.3。转染
除非另外注明,10克的DNA混合5L Lipofectamine2000和985μL无血清培养基和培养在室温下15分钟。没有DNA的复制混合物和/或lipofectamine2000也孵化在室温下15分钟。细胞用无血清培养基,添加了合并后的混合物进行DNA转染(敏感性)。
2.4。表达的受体和胞质DNA dsDNA的影响已经被的功能:实时逆转录聚合酶链反应
总RNA提取已经使用一个RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)。RT - pcr, 20 - 100 ng总RNA反转录成第一链互补DNA(互补)使用PrimeScript RT试剂盒(豆类生物公司,大津,志贺,日本)根据制造商的指示。使用LightCycler rt - PCR进行实时PCR系统(瑞士罗氏公司)根据制造商的指示。反应混合物(20μL)包含SYBR预混料交货Taq II (TLi RNAseH +;豆类生物公司,大津,MgCl志贺,日本),4毫米20.5毫米的上游和下游PCR引物(表1),2μL的第一链cDNA模板。控制变化的反应,所有PCR对GAPDH表达数据规范化。
2.5。量化的可溶性单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1): MCP-1 ELISA
孵化24小时后,MCP-1水平文化上层清液由ELISA测定(鼠MCP-1 ELISA从热科学,罗克福德,,美国)根据制造商的指示。
2.6。细胞生存能力分析:MTS试验
细胞生存能力评估的MTS试验(CellTiter 96细胞增殖测定水一个解决方案,麦迪逊,WI,美国)。与dsDNA治疗后24 h, MTS的解决方案是添加到细胞和孵化继续在37°C 1 h。潜伏期后,细胞生存能力量化了不同波长的吸光度570和690海里。
2.7。细胞的细胞毒性试验:LDH测定
细胞细胞毒性评估了LDH测定(WI CytoTox 96非放射性细胞毒性试验,麦迪逊,美国)。dsDNA治疗24 h后,细胞上清液转移到另一个微型板块,然后LDH基质添加到上层清液,孵化持续30分钟的37°C。潜伏期后,停止的解决方案是添加和细胞细胞毒性是由不同波长的吸光度量化570和690海里。
2.8。Alpha-Smooth肌肉肌动蛋白的表达和M30细胞角蛋白:Immunofluorescent共焦显微镜
细胞活化和细胞凋亡被immunofluorescent评估细胞化学。鼠标antirat alpha-smooth肌肉肌动蛋白抗体被用来评估细胞的激活,和FITC-labelled M30抗体被用来评估细胞凋亡。孵化后,细胞被洗磷酸盐,4%多聚甲醛固定,分析下荧光共焦激光扫描显微镜(尼康A1 / C1,东京,日本)。
2.9。统计分析
结果表示为手段(SEM) 3 - 4不同的细胞每实验准备工作协议。学生的- - - - - -测试是用于统计分析。< 0.05的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。老鼠已经被表达受体胞质DNA
没有以前的报告表达的外源DNA比toll样受体受体已经被其他9 (TLR9识别)2]。因此,我们首先测量的mRNA表达依赖dna的激活IFN-regulatory因素(戴)和没有黑色素瘤2 (AIM2),识别胞质dsDNA使用实时PCR。已经表达了傣族和AIM2无论通道,可以识别受体胞质DNA(图1(一))。接下来,引入dsDNA细胞质中合成的脂质转染确定受体的数量增加的反应,也就是说,炎症是否启动。在这项研究中使用的合成dsDNA主机dsDNA的结构类似,并已广泛用于模仿主持人dsDNA来源于细胞和组织损伤。保利(dA: dT)据报道,诱导I型干扰素(IFN)细胞因子,趋化因子,引发炎症反应。然而,它也知道dsDNA转化为双链RNA(极)RNA聚合酶III rig - i受体检测到的,认识到极。因此,这是不正确的DNA刺激(14]。相比之下,保利(dI:直流)缺乏3′ppp结构由rig - i感觉到,感觉到只有受体识别dsDNA。虽然聚(dA: dT)和聚(dI: dC)不受细胞外DNA刺激,介绍脂质转染的细胞内dsDNA被证明能显著增加受体的数量表达和诱导炎症(图1 (b))。
(一)
(b)
3.2。dsDNA细胞因子和趋化因子表达增加
接下来,我们决定炎性细胞因子和趋化因子基因的表达是否使用rt - pcr诱导。结果表明,尽管DNA细胞外刺激没有诱导促炎细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α(TNF -α)和白细胞介素- 6 (il - 6)和MCP-1等趋化因子和细胞因子诱导的中性粒细胞化学引诱物1 (CINC-1),细胞内dsDNA并刺激他们的表达在6 h(图2(一个))。基因表达调控等转录因子核factor-kappa (NF - BκB)。这项研究表明,这些基因的表达增加了细胞内dsDNA刺激(图2 (b)),这表明释放过剩的主机dsDNA由于病毒感染和组织损伤可能引发炎症。
(一)
(b)
(c)
3.3。dsDNA诱导MHC表达式
我们也决定gene-controlled抗原的表达存在与否的演讲中,激活T-cell-mediated细胞免疫。结果显示,细胞内dsDNA刺激增加类MHC基因表达,不仅参与了炎症淋巴细胞的激活和其他人(图3(一个))。MHC II级表达式也检查了,因为据说已经被吞噬活动(15];然而,表情并没有增加。抗原处理相关转运子1 (TAP1)和低分子量蛋白2 (LMP2)中扮演重要角色的诱导表达MHC类我12]。我们的研究表明,TAP1和LMP2表达也增加(图3 (b)),这表明存在过剩的主机dsDNA由于组织损伤可能引起异常表达MHC和慢性自身免疫性胰腺炎患者中观察到。
(一)
(b)
3.4。dsDNA诱导I型干扰素诱导
像MHC I型干扰素是参与细胞免疫的激活;干扰素-α或干扰素-β主要是根据细胞类型。已经,干扰素-β感应,也被报道成纤维细胞,观察(图4(一))。各种干扰素调节因子(irf)参与上述基因的表达(12]。在这项研究中,IRF的表达1、2和7增加,而IRF3表达式没有诱导(图4 (b))。
(一)
(b)
3.5。dsDNA特异性功能受损
据报道,吞没的腺泡细胞坏死的减毒的激活和胶原蛋白合成PSC (6]。我们对这种现象是否可再生的和合成dsDNA已经被刺激时。激活细胞内dsDNA减毒,I型胶原基因诱导和增殖(数字5(一个)和5 (c))。此外,细胞外聚(dI: dC)减毒I型胶原基因诱导,表明细胞外dsDNA的可能的功能。我们确认的减少sma在蛋白质水平immunofluorescent细胞化学(图5 (b))。LDH测定和M30染色显示细胞死亡的相伴,包括坏死和凋亡(数字5 (d)和5 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
他们的发现的时候,已经被确认为成纤维细胞内稳态的维持细胞外基质(1,2]。然而,最近已经被认为是一种多功能细胞(5,16- - - - - -18]从胰腺的细胞分化良好型的略有不同,如腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞。的先天免疫反应已经被认为是特别重要的诱导胰腺炎症。此外,各种胞外细菌和死细胞的吞噬作用通过已经导致激活细胞免疫抗原的演讲中,也有一些报告已经被吞噬作用和内吞作用的(15,17]。刺激的先天免疫通常分为感染性和非感染性的刺激(19),感觉刺激的途径包括phagolysosomal通路,endosomal-lysosomal通路,通过吞噬作用和其他自噬通路功能。一些类型的刺激被不同的核酸受体诱导炎症反应通过共同等下游转录因子的激活NF -κB和IRF [20.,21]。相比之下,有病理条件,诱导炎症反应在一个未受感染的环境,这是类似于传染性的环境。炎症的机制是未知的。然而,目前广泛理解,炎性疾病发展因为先天免疫激活内源性分子释放由于组织损伤,这被称为有关分子模式(抑制)22,23]。
的释放抑制引起的各种组织损伤,例如,缺血和再灌注损伤24),创伤25),和其他有害刺激(酒精性胰腺炎、药物引起的胰腺炎和其他人),从而诱导关键的细胞凋亡和坏死。因此,组织损伤诱发细胞内分子的释放(核酸、HSP UA, HMGB1,和其他人)和细胞外基质的降解(透明质酸),导致诱导炎症和修复受伤的网站(26]。然而,不受控制的组织损伤,例如,造成自身消化大量坏死胰腺腺泡细胞,产生许多坏死细胞。抑制,如基因组DNA片段,激活先天免疫和后天免疫诱导自身免疫性炎症而抑制特异性功能(12,27,28]。死细胞通常被居民吞噬细胞;然而,胰腺没有间质巨噬细胞类似于肝枯氏细胞,所以已经被吞噬死亡细胞。因此,已经被认为是主要的细胞,诱发炎症。在肝内DNase II胜过老鼠缺乏能力降低凋亡的核酸吞噬作用和生产许多I型干扰素,从而导致慢性炎症(13]。DNase我敲除小鼠开发抗核抗体阳性SLE-like症状通过相同的机制(29日],DNase三世胜过老鼠的细胞内DNA受体激活核外基因的积累,导致致命的炎症性心肌炎的发病与大规模干扰素诱导(30.]。上述研究结果表明,过度的核酸积累从死细胞诱导的细胞内DNA处理系统。这导致生产胞质dsDNA,通常不存在,不仅引发炎症,也会导致自身免疫性疾病的发展。此外,这些发现表明,DNase的处理机制以及其刺激dsDNA应该研究。
大多数以前的研究已经集中在先天免疫反应只有在感染刺激,抑制和没有报告。尽管众所周知,提高受体的数量由于pamp刺激或抑制启动炎症,许多受体表达的变化,比如已经被tlr,尚未被研究过。至少有2受体识别胞内dsDNA和引发炎症。戴的表达和AIM2,哪一个是最负责的炎症,增加(图1 (b)),这表明一个小组织损伤可能会蔓延至整个器官(31日,32]。然而,TLR9识别受体的数量并没有增加。相反,受体增加某些刺激特别敏感,这可能区分自我和异物。除了上述2受体,还有其他核酸受体,细胞外H2B被认为发挥重要作用在自身免疫性甲状腺疾病的发病27,33,34]。受体或受体负责胰腺炎的发病在未来应该澄清。诱导细胞因子和趋化因子有显著影响胰腺炎的发病和临床治疗。有报道称,刺激由革兰氏阴性杆菌的一个组成部分,如有限合伙人或鞭毛蛋白,革兰氏阳性球菌的组件,如英国网球协会,或刺激类似于病毒感染,如保利(我:C),类似于胞质dsDNA刺激的影响。因此,常见的转录因子,比如NF -κB,被认为是诱发炎症细胞因子和趋化因子基因的表达(17,35,36]。我们以前报道,dsDNA等细菌没有炎症效应(11]。这可能是由于细胞内DNA受体不刺激由于各种因素,包括长度和数量的细菌DNA和细胞吸收途径的细菌基因组DNA。在这项研究中,我们首次证明表达式与抗原呈现细胞免疫激活的因素,如干扰素-β和MHC类我引起的胞质dsDNA刺激。我们认为,这些数据将被用于评估异常MHC表达与淋巴细胞激活胰腺组织的慢性和自身免疫性胰腺炎患者37- - - - - -40]。此外,这些数据显示主机的可能性dsDNA从组织损伤可能参与上述疾病的发生通过先天免疫激活。异常表达MHC不是在胰腺腺泡的细胞,但在国际米兰确实存在——和intralobular微胆管38]。已经被认为可能是部分负责这个表达式。然而,由于很可能MHC II级也可能参与自身免疫性胰腺炎的发病(40),主机dsDNA以外的刺激可能与发病有关。
因为细胞内和细胞外dsDNA PSC的特异性功能受损,功能组织修复在环境的预期损失大量坏死dsDNA释放受伤组织和细胞碎片。细胞存活率和细胞内dsDNA也减少了,这可能是招募了从骨髓中萃取出来PSC增加胰腺(PSC的总数41,42]。据报道,吞没的腺泡细胞坏死的减毒PSC的特异性功能(6),这可能反映出的大量dsDNA吞噬溶酶体引起的泄漏dsDNA片段被胞质dsDNA传感器。我们无法定义的类型的细胞死亡,因为lipofectamine向细胞坏死的影响很小,但我们认为dsDNA诱导细胞坏死和细胞凋亡在胰腺炎经常被观察到。
在这项研究中,我们发现,先天免疫反应的诱导dsDNA反映了胰腺炎的发生和恶化在无菌条件下(图6)。这项研究的结果将是非常有用的在阐明新胰腺炎的病理和决定对这些疾病的治疗目标,包括自身免疫性胰腺炎。在急性胰腺炎的情况下,抑制其他比主机dsDNA如HSP (43和尿酸44)可能参与病理学;因此,未来的研究应该从先天免疫的角度进行。
利益冲突
作者没有潜在的利益冲突。
确认
这项工作得到了教育部的资助,文化,体育,科学和技术,日本(20590808,t . Ito)和胰腺的棘手的疾病的研究委员会(首席研究员:Tooru Shimosegawa),由卫生部、劳动、和福利,日本(50253448,t . Ito)。