文摘
感染志贺毒素——(Stx)生产大肠杆菌可导致溶血性尿毒症综合征(HUS)。大约30%的溶血性尿毒综合征患者罹患并发症在中枢神经系统(CNS),这是在这样的病人死亡率的一个重要因素。尸检显示主要是水肿和中枢神经系统缺血改变,经常与microhemorrhages。有人建议,Stx-induced人类大脑内皮细胞损伤,血脑屏障的重要成分,起着至关重要的作用在中枢神经系统并发症的发展。然而,目前尚不清楚Stx影响大脑神经胶质细胞。在目前的研究中,我们调查了直接Stx参与人类星形胶质细胞的炎症反应(所)Stx对待。免疫组织化学和实时PCR显示globotriaosylceramide的表达(Gb3)受体Stx2, Gb3合成酶(GalT6)曾被interleukin-1增加β(il - 1β)。表达式的interleukin-8(引发)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) mRNA在曾被Stx2显著调节。这些结果表明,Stx2诱发炎症反应,特别是通过趋化因子的表达,既表达Gb3和可能,因此,影响大脑神经胶质细胞,发挥关键作用在中枢神经系统症状的发病机制与溶血尿毒综合症有关。
1。介绍
溶血性尿毒症综合征(HUS)是最常见的儿童急性肾功能衰竭的原因。传统的这种综合症的诊断标准包括与支离破碎红细胞溶血性贫血,血小板减少,肾功能衰竭(1]。溶血性尿毒综合征的流行形式主要是由于发生出血性结肠炎。溶血性尿毒综合征病例的90%,感染志贺毒素——(Stx)生产大肠杆菌(STEC)强烈牵连2]。
Stx分成两大组,称为Stx1和Stx2份额约56%氨基酸序列相似性(3]。Stx1 Stx由本质上是相同的痢疾。Stx2更强有力的造成严重的溶血性尿毒综合征和中枢神经系统(CNS)损伤。Stx 71 kda的蛋白质组成的一个32-kDa亚基(StxA)和五个7.7 -kda B亚基(StxB)。StxA已经N糖苷酶活动,消除了腺嘌呤的28个RNA在60年代核糖体亚基,从而呈现核糖体的蛋白质合成(4]。StxB StxA运输到胞质至关重要。StxB专门与细胞膜结合的globotriaosylceramide (Gb3)受体,它存在于特定的哺乳动物宿主细胞(5]。Stx然后内化与向trans-Golgi Gb3和运输网络(6]。
Stx被认为通过发炎的肠道黏膜进入血液,然后结合亲和力较低的血液细胞,特别是多形核白细胞,从而被运送到靶器官(7]。Stx Gb3,功能性受体,存在表面的各种细胞类型,包括人类肾小球内皮细胞、肾小球上皮细胞(8,人类大脑内皮细胞(HBECs) [9]。Stx绑定到目标细胞表达Gb3抑制蛋白质合成,诱导细胞凋亡和坏死10]。
大约30%的溶血性尿毒综合征患者患有中枢神经系统并发症,这些患者预后最穷的(11]。然而,中枢神经系统功能障碍的发病机制并不完全了解。虽然血栓性microangiopathic损害是溶血性尿毒综合征的特点,被认为是造成的直接细胞毒性循环Stx对血管内皮的影响(12),没有共识的致病机制负责大脑参与溶血性尿毒综合征。然而,一个可能引起炎症反应的细胞因子的作用。临床研究已经证明,溶血性尿毒综合征患者血浆肿瘤坏死因子等细胞因子水平升高α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)和白细胞介素- 6 (il - 6) [13]。在TNF -α或il - 1βStx对内皮细胞的细胞毒性显著增加。此外,肿瘤坏死因子-α和il - 1β移植Gb3在内皮细胞的表达14]。同样,尽管它已经证明HBECs非常耐Stx-induced细胞毒性(9),炎症介质,如肿瘤坏死因子-α和/或il - 1β,显著增加的敏感性HBECs Stx细胞毒性(15),这是由于Gb3调制的表达。
几个组件的Gb3代谢途径可能参与cytokine-stimulated Gb3表达式。Gb3从lactosylceramide合成和UDP-galactose Gb3合成酶(GalT6) [16]。因此,增加Gb3内容可能是由于增加GalT6的活动。Eisenhauer等人表明TNF -α和il - 1β增加GalT6活动和mRNA水平(17]。
溶血性尿毒综合征是相关的炎症趋化因子的释放,引发的水平和MCP-1溶血性尿毒综合征病人收集的尿液样本中显著增加(18]。中性粒细胞化学引诱物的纯化stx直接诱导表达引发人类肠道上皮细胞(19]。这些Stx-induced增加引发的肠上皮细胞可能是重要的合成增加宿主粘膜炎症反应STEC感染(20.]。内皮细胞暴露于Stx2释放炎症趋化因子,如引发和MCP-1刺激白细胞的粘附和轮回(21]。这些趋化因子可能也在溶血尿毒综合症的发病机制中发挥作用。然而,在脑实质细胞和神经胶质细胞,趋化因子的表达,以应对Stx尚未研究。
一些研究支持的假设Stx溶血性尿毒综合征会导致脑损伤。静脉注射接种的兔子Stx2造成严重的中枢神经系统损伤与入侵Stx2透过BBB [22]。一些作者报道,intracerebroventricular Stx2管理导致神经元死亡和胶质细胞损伤大鼠的大脑。透射电子显微镜研究显示凋亡神经元,神经胶细胞的超微结构改变,脱髓鞘纤维(23]。此外,共焦显微镜表明反应性星形胶质细胞与神经元Stx2-containing [24]。这些发现支持论点,Stx2对大脑神经胶质细胞有直接影响。
大脑包含神经元、神经胶质(例如,星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞),和内皮细胞。人类星形胶质细胞(所)是最丰富的一种胶质细胞在人类的大脑。他们在发展上发挥了关键作用,体内平衡,炎症反应,生产和修复中枢神经系统的各种细胞因子,趋化因子,生长因子和受体表达的这些分子(25]。这些趋化因子在开发中扮演着重要角色,增长,细胞迁移,生产自由基、细胞凋亡,t细胞激活,肿瘤,炎症调节受伤,伤口愈合,组织修复,和巨噬细胞的招募,以及与病原体相互作用,包括病毒(26- - - - - -29日]。趋化因子及其受体发挥着重要作用在几个神经退行性和中枢神经系统的炎症性疾病,包括创伤、中风、阿尔茨海默氏症、多发性硬化症、中枢神经系统肿瘤,和人类免疫缺陷病毒脑炎30.- - - - - -32]。我们推测,stx将直接作用于星形胶质细胞诱导趋化因子的产生和发挥作用的中枢神经系统并发症。
在目前的研究中,我们研究如何Gb3表达式,包括GalT6在内的所由炎性细胞因子控制。此外,我们试图获得进一步证明Stx2行为所产生趋化因子,这些趋化因子参与中枢神经系统并发症的发病机理与溶血尿毒综合症有关。
2。方法
2.1。试剂和毒素
纯化Stx2购买从毒素技术有限公司(美国佛罗里达州萨拉索塔)。确定毒性大于107使用维洛细胞试验单位每毫克。所有试剂都是购自西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。
2.2。细胞培养条件
竟源自人类胎儿脑组织(Lonza Walkersville,医学博士,美国)经常亚文化每6天Clonetics星形胶质细胞生长培养基(Lonza)。细胞受移植者在达到融合在每平方厘米3500个细胞,在37°C的环境在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司2。曾在实验后使用两到四个段落。
2.3。分析Gb3表达il - 1的刺激β
分析Gb3表达il - 1的刺激β使用Vectastain精英是由免疫组织化学ABC工具包(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)。既培养了10−6mol / L il - 1β或单独使用媒介。48 h和il - 1的细胞被刺激β和固定在4%多聚甲醛在室温下10分钟。幻灯片准备和孵化鼠反CD77 IgM抗体(1:100稀释;美国贝克曼库尔特,沥青,CA)或PBS 8 h在室温下,然后洗和孵化1:100稀释的二次抗体(Vectastain工具包中提供)在室温下1 h。获得的比色反应是使用0.5毫克/毫升diaminobenzidine (DAB)底物溶液(向量实验室)0.02%的H2O2。幻灯片和吉尔的苏木精复染色。
2.4。实时定量PCR GalT-6 mRNA
因生长在six-well板块在il - 1孵化β(10−8到10−5mol / L)或TNF -α(10−8到10−5mol / L)。在0 8和24 h postinoculation,总RNA分离使用RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA),与一个RNase-free DNase(试剂盒)治疗30分钟按照制造商的指示。RNA是反向转录产生互补脱氧核糖核酸RT试剂配套使用的脚本(豆类生物,大津,日本)。实时定量聚合酶链反应(PCR)进行热循环仪使用SYBR绿色PCR反应混合液和骰子实时系统(豆类生物)。所有实验进行了五次。实时PCR引物特定GalT-6和管家基因glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)表中列出1。PCR条件95°C 10年代,紧随其后的是40个周期95°C的5 s和60°C 30年代。信使rna的相对数量确定的阈值周期值参考基因,GAPDH。所有进一步的计算和统计分析进行了基于这些价值观和被称为相对表达比率。
2.5。趋化因子酶联免疫吸附试验(ELISA)
因生长在six-well板块在10孵化−9和10−10mol / L Stx2。在0、24和48 h postinoculation细胞上清液治疗已经被离心收集,储存在−80°C,直到进一步的分析。引发的ELISA和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)使用对应的Quantikine进行比色夹心ELISA试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)按照制造商的协议。趋化因子是量化的测量吸光度在450海里680微量滴定板读者(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。趋化因子蛋白浓度是根据标准曲线计算。试验敏感性是4 pg / mL(引发)和5 pg / mL (MCP-1)。
2.6。实时定量PCR的趋化因子mRNA
因生长在six-well盘子是孵化与10−9或10−10mol / L Stx2 10−9与10 mol / L Stx2−6mol / L il - 1β,或10−6mol / L il - 1β一个人。在0 8和24 h postinoculation,总RNA提取和实时定量PCR使用前面描述的方法执行。实时PCR引物引发特定和MCP-1(豆类Bio)表中列出1。PCR条件一个周期在95°C 10年代,紧随其后的是40个周期95°C的5 s和60°C 30年代。信使rna的相对量测定如前所述。
2.7。统计数据
意味着±SD测定和平均值的两个独立的团体使用学生的比较以及。差异被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。免疫组织化学分析Gb3表达所接受il - 1β
促炎细胞因子的表达增加Stx受体Gb3 Stx靶细胞表面上的不同。确定Gb3表达所接受il - 1的水平β、免疫组织化学。与10所治疗48 h−6mol / L il - 1β相对较高的Gb3(图1(一))检测相比,未经处理的控制(图1 (b))。相反,没有检测到Gb3水平的变化与肿瘤坏死因子-所治疗α(数据没有显示)。
(一)
(b)
3.2。实时定量PCR分析GalT6 mRNA感应与il - 1所治疗β或肿瘤坏死因子-α
它已被证实使用HBECs和肠道上皮细胞,炎症细胞因子增加Gb3表达水平通过生成lactosylceramide GalT6的激活。免疫组织化学显示Gb3曾是增加了il - 1的表达β。此外,我们研究了GalT6 mRNA的表达相对于未经处理的控制与il - 1治疗后β(10−8到10−5mol / L)或TNF -α(10−8到10−5mol / L) 8、24 h。8 h, il - 1β(10−7到10−5mol / L)治疗导致显著的感应()GalT6 mRNA(图相对于未经处理的控制2(一个))。增加6.5倍的水平GalT6信使rna诱导了10−6mol / L il - 1β。肿瘤坏死因子-α治疗显示il - 1的类似的趋势β治疗8 h,但它并没有显著(图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。趋化因子mRNA的表达与Stx2竟在刺激
星形胶质细胞趋化因子的重要来源,在大脑炎症反应中发挥作用。调查是否引发和MCP-1 mRNA的表达增加与Stx2所治疗,我们使用实时PCR。治疗后10−10到10−9mol / L Stx2 8或24 h,实时定量PCR验证执行引发的表达和MCP-1记录。Stx2治疗后,引发信使rna诱导显著升高相对于未经处理的控制(图3(一个))。256倍增加引发mRNA水平是由10−10mol / L Stx2,诱导了10 1155倍增加−9mol / L Stx2 8 h。增加5.7倍MCP-1信使rna诱导了10−10mol / L Stx2,增长了11.6倍诱导了10−9mol / L Stx2 8 h,相比与未经处理的控制(图3 (b))。
(一)
(b)
3.4。趋化因子释放与Stx2由所刺激
确定趋化因子mRNA的upregulation伴随着释放这些趋化因子中,因受到10−9mol / L和10−10mol / L Stx2 24和48 h,和趋化因子的浓度在中被ELISA测定。治疗和10所−9mol / L和10−10mol / L Stx2增加引发的分泌到培养基中相对于控制文化在24和48 h(图4(一))。引发介质的浓度明显高于在Stx2-treated文化,特别是对于10−9mol / L Stx2,比控制文化在24和48 h。同样,治疗和10所−9mol / L和10−10mol / L Stx2 MCP-1到介质的分泌增加相对于控制文化在24和48 h(图4 (b))。与引发不同,MCP-1被释放在缺乏Stx2刺激(图4 (b))。
(一)
(b)
3.5。在刺激引发mRNA的表达所Stx2和il - 1β
使用实时PCR,我们发现GalT6 mRNA的表达与il - 1增加了刺激β、免疫组织化学显示所Gb3表达水平也增加了il - 1β刺激。调查是否增加Gb3表达il - 1引起的β刺激与趋化因子mRNA的表达,我们对待所Stx2和il - 1β。诱导引发mRNA在刺激与10−9mol / L Stx2和10−6mol / L il - 1β结合显著更大()24小时比带来的刺激与代理独自住在相同的浓度(图5)。3700倍增加是引起这Stx2和il - 1的结合β相比,与控制水平。Coincubation Stx2 il - 1β没有引起显著增加MCP-1 mRNA水平(数据没有显示)。
4所示。讨论
中枢神经系统功能障碍是预后的重要因素和儿童死亡率溶血性尿毒综合征(11]。虽然中枢神经系统参与溶血尿毒综合症的发病机制并不完全理解,BBB的破坏和渗透性增加和神经障碍造成HBEC损伤至关重要事件在中枢神经系统并发症观察急性期的溶血性尿毒综合征(15]。
在前一个病理研究中,Mizuguchi等人表明,静脉Stx2兔子导致出血和坏死的神经和大脑内皮细胞(33]。此外,一个在活的有机体内研究表明,Stx2静脉注入兔子的脑脊液(CSF)中检测出,Stx2流入引起的脑脊液受伤室管膜细胞之间的紧密连接,导致破坏的BBB16]。一些作者报道,intracerebroventricular Stx2管理导致神经元死亡和胶质细胞损伤大鼠大脑(23]。然而,目前尚不清楚Stx2如何影响神经胶质细胞在炎症反应。
所占总人数的55% - -60%的人类大脑细胞(34)和参与几乎所有类型的大脑病理学。曾在发展上发挥了关键作用,炎症,修复中枢神经系统通过产生各种趋化因子。炎症或病理条件下,竟成为激活并显示增强的生产一些细胞因子,趋化因子,生长因子。此外,因一般开始增殖在这种情况下,这种现象称为astrogliosis。因此,细胞反应的知识所Stx是必不可少的理解神经病理学观察到严重的溶血性尿毒综合征。
在这项研究中,il - 1β治疗因增加Gb3和GalT6 mRNA表达,分别由免疫组织化学和实时PCR。此外,治疗与Stx2诱导趋化因子的生产所引发和MCP-1。Stx2和il - 1的混合物β诱导引发显著的程度。这些发现表明,Stx2触发免疫反应已经通过趋化因子的表达。
毒素的主要决定因素是绑定Gb3 Stx蛋白质的细胞毒性和病理的影响。以前有研究指出促炎的药物的作用在增强的敏感性不同的靶细胞,包括HBECs Stx通过upregulation Gb3表达的影响9,35]。Gb3-expressing细胞被公认是Stx的目标。主要HBECs变得容易Stx TNF -当他们表达Gb3响应α,进一步加剧了疾病过程(15]。因此,我们调查是否Gb3表达既增加了炎性细胞因子。使用实时PCR,我们确定GalT6 mRNA的表达增加了il - 1β刺激,免疫组织化学显示Gb3表达水平既增加了il - 1β刺激。这些结果表明,竟,中枢神经系统实质细胞,表达Gb3,这个表达式是增加了炎性细胞因子。在HBECs, il - 1β和肿瘤坏死因子-α增加Gb3的表达和增强Stx的毒性。只有il - 1βGalT6 mRNA的表达增加,使Gb3表达水平增加。治疗与肿瘤坏死因子-α引起对il - 1类似的反应βGalT6 mRNA的表达方面8 h,虽然并没有显著的相似度。在这项研究中,il - 1的机制β增加的程度已经超过TNF - Gb3表达式α不是理解,尽管它可能会由于不同的细胞类型,并进一步调查这是必需的。
一系列促炎细胞因子,趋化因子分为两亚科:科学家家族代表在这项研究中,引发和CC的家人,MCP-1表现出来的一样。白细胞的趋化因子刺激目标特异性定向迁移,可能是炎症过程的有力调停者。人类引发促炎主要由单核细胞趋化因子分泌,内皮细胞、胶质细胞和充当化学引诱物和激活的中性粒细胞通过CXCR1和CXCR2受体信号。MCP-1是一个强有力的趋化因子单核细胞,调节修复过程中起着重要的作用和细胞间的相互作用在中枢神经系统25,26]。它可以表达的许多细胞类型包括小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元(20.,21]。
近年来,它已被证明在中枢神经系统的炎症趋化因子扮演很多角色,负责各种神经退行性疾病的发展和缺血性损害大脑细胞(17,18]。MCP-1和引发老年痴呆症患者的大脑中调节(24]。此外,MCP-1和引发的水平显著升高的CSF婴儿肌萎缩性脊髓侧索硬化症,日本脑炎,或分36]。
我们发现等Stx2趋化因子通过刺激所引发和MCP-1产生,引发的生产尤其明显。高浓度的引发和MCP-1 mRNA toxin-treated中发现了细胞相比,未经处理的控制。引发和MCP-1蛋白被发现在更高水平的条件媒体Stx2-treated比未经处理的细胞,细胞和趋化因子引发MCP-1与Stx后所产生的刺激。几项研究已经表明,Stx诱发引发的表达和MCP-1肠道上皮细胞,内皮细胞和单核细胞,引发的水平和MCP-1显著增加尿液样本收集的溶血性尿毒综合征患者。因此,有人认为,趋化因子如引发和MCP-1溶血尿毒综合症的发病机制中发挥特殊的作用。对于溶血性尿毒综合征患者,多形核中性粒细胞计数高外围在演示与不良预后密切相关37]。多形核中性粒细胞激活可能导致大脑炎症反应,参与溶血性尿毒综合征BBB破坏后的二次伤害。Stx2诱导表达的趋化因子,如引发MCP-1,星形胶质细胞,并可能持续诱导的炎症反应。溶血性尿毒综合征小鼠模型,中和的趋化因子导致减少肾纤维蛋白沉积,表明破坏或消除这些巨噬细胞趋化因子可能是一个有用的治疗肾脏损害相关的溶血性尿毒综合征(38]。目前,尚不清楚是否引发和MCP-1诱导在中枢神经系统。在目前的研究中,我们发现星形胶质细胞反应Stx2和引发和MCP-1生产的。在生物系统中,进一步的研究将需要解决是否引发和MCP-1 Stx2引起的中枢神经系统,和他们产生什么影响。
溶血性尿毒综合征治疗脑病尚未建立。然而,藤井裕久等人表明,倍他米松磷酸钠脉冲疗法减少了死亡率,延长了生存期的兔子Stx2-toxemia [39]。倍他米松磷酸钠是经常用作类固醇治疗脑水肿患者。地塞米松的渗透率降低正常小鼠的BBB [40]。脑星形胶质细胞,金等人显示angiotensin-1协调监管和血管内皮生长因子(VEGF)地塞米松,提出一个新颖的机制激素性稳定的BBB41]。此外,岩石等人研究了细胞因子和趋化因子的表达,没有地塞米松人类小胶质细胞和星形胶质细胞的感染结核分枝杆菌。他们报告说,与地塞米松治疗有效地抑制生产这些介质(42]。类固醇保护作用被认为是由免疫调节活动,如减少促炎细胞因子的生产。因此,抗炎化合物可能有治疗潜力Stx-induced神经系统表现。调查的糖皮质激素调节趋化因子表达的Stx2所目前正在进行中。
总之,我们的结果表明可能过度趋化因子生产之间的关系在中枢神经系统和大脑损伤一旦Stx2到达大脑实质。我们建议抑制趋化因子的生产可能是一个新战略在溶血性尿毒综合征脑病治疗中枢神经系统损伤。
5。结论
在这项研究中,我们调查了人类的星形胶质细胞的炎症反应Stx2对待。免疫组织化学和实时PCR显示globotriaosylceramide的表达(Gb3)受体Stx2, Gb3合成酶(GalT6)曾被interleukin-1增加β(il - 1β)。在星形胶质细胞趋化因子mRNA表达被Stx2显著调节。趋化因子在中枢神经系统可能与中枢神经系统表现与溶血性尿毒综合征的发病机制有关。
确认
作者要感谢博士Masakazu Miyawaki Koichi录像技术建议和博士的审查。