文摘
单核细胞增多性李斯特氏菌序列类型1247克隆复杂8造成长期多国爆发五个欧盟国家:丹麦、爱沙尼亚、芬兰、法国、瑞典。共有22个疾病病例与2014年7月和2019年2月之间出现症状。五个病人死于或与疾病。的回顾性分析l . monocytogenes隔离VLTRLM2013揭示了存在的霍乱菌株数占与霍乱疫情相关的(cgMLST类型L2-SL8-ST1247-CT4158)在即食鱼产品一年多前第一个霍乱病例数占与霍乱疫情相关的。参考爆发压力和VLTRLM2013应变比较使用核心基因组和茎全基因组序列类型分析。基因组水平差异的持久l . monocytogenes食源性李氏杆菌病菌株与长期多国爆发。得出的持久特性多国霍乱。数占与霍乱疫情相关的l。monocytogenes应变VLTRLM2013一起压力岛、毒性和抗生素抗性基因的决定因素可能影响广泛、长期爆发五个欧盟国家。我们的研究结果支持系统的全基因组测序在食品和公共卫生监测中的应用,进一步鼓励广泛采用。
1。介绍
单核细胞增多性李斯特氏菌生存繁衍的能力在不同的环境条件(1)、栖息地以及人类和动物造成严重感染(2]。李氏杆菌病的病原体,人类最严重的人畜共患病住院最高(97.0%),病死率(15.6%)比例在欧盟(EU)在2018年,有2549例确诊病例和14食源性李氏杆菌病(3]。
无处不在的自然的病原体4)和食品生产环境的增长领域的存在可能持续的“内部”的原因l。monocytogenes菌株的新兴食品加工厂(1]。使交叉污染食品生产工厂l。monocytogenes进入食品生产链条,最终可能导致污染的食品5]。即食食品(RTE),尤其是鱼和fish-derived产品,已被证明是重要的交通工具l。monocytogenes传播导致人类感染(6,7),因为他们往往消耗熏制或没有任何热处理(8)如盐渍生鱼产品(7]。因此,食用这些产品可能导致食源性李氏杆菌病(9,10]。
在4th2019年6月,欧洲疾病预防与控制中心(ECDC)和欧洲食品安全局(EFSA)快速发表关于多国爆发疫情评估(ROA)所致l . monocytogenes序列类型(ST) 1247年克隆复杂(CC) 8 (10]。截至23日理查德·道金斯2019年5月,丹麦、爱沙尼亚、芬兰、法国、瑞典共22例确诊病例的报道单核细胞增多性李斯特氏菌序列类型ST1247 CC8爆发的时期(2014 - 201910]。疫情调查指出,爱沙尼亚的鱼加工公司作为单一制造商与疫情相关的产品(10]。
一项研究在2012 - 2013年在零售层面在爱沙尼亚(11RTE)收集分离产品,包括那些来自鱼加工公司。l。monocytogenes分离获得了在本研究被存储在食品卫生和兽医公共卫生爱沙尼亚大学生命科学。我们推测,l。monocytogenes分离获得这种文化收集一年半前首先确认霍乱病例数占与霍乱疫情相关的集群是相同的长期多国爆发的一部分。
2。材料和方法
2.1。菌株
l。monocytogenes应变VLTRLM2013是独立于公司vacuum-packaged腌鲑鱼片产品在2013年1月29日。样本最初专注于研究期间收集的真空气氛和修改包装RTE爱沙尼亚起源的肉类和鱼类产品零售水平在2012 - 2013年(11]。VLTRLM2013是唯一的应变,源于公司从这项研究。应变被隔离在爱沙尼亚的兽医和食品实验室按照EVS-EN ISO 11290 - 1:20 00 / A1:2004 [12]。孤立的应变是存储在-82°C保护微生物保存系统管(技术服务顾问,英国)食品卫生和兽医公共卫生爱沙尼亚大学生命科学。
基因组测序和组装进行所述Maesaar和Roasto [13]。隔离为在血琼脂(Biolife Italiana,意大利)在37°C下有氧生长条件。使用一个IndiSpin病原体基因组DNA提取工具包(Indical生物科学,德国)。DNA浓度和质量检查与双链DNA广泛使用量子位4荧光计测定工具包(美国热费希尔科学)。DNA剪使用M220聚焦超声发生器(美国Covaris)和图书馆准备使用TruSeq DNA PCR-free图书馆准备工具包(美国Illumina公司)。在爱沙尼亚的DNA提取和测序进行兽医和食品实验室使用Illumina公司MiSeq系统MiSeq试剂盒v3(600次)。读取的质量评估使用FastQC v0.11.9 [14),和修边做了Trimmomatic v0.39 [15]。读是组装使用黑桃v3.14.1 [16],postassembly质量过滤应用描述Llarena et al。17]和Maesaar Roasto [13]。
原始测序读、基因组序列和基因组组装已经存入国家生物技术信息中心(NCBI)数据库下加入数字SRR11789329分别JABGCT000000000.1和GCA_013302955.1 [13]。基因组组装也提交l。monocytogenes茎序列输入MLST数据库(https://bigsdb.pasteur.fr/listeria/)[18,19根据身份证号码48183年。
代表l。monocytogenesST1247参考暴发菌株基因组中使用本研究之前ECDC和欧洲食品安全署发布的l。monocytogenes快速疫情评估和可用在欧洲核苷酸存档(ENA)加入ERR2223569数量(10]。基因组组装在这项研究中的应用是可用ECDC的要求。
2.2。基因组分析
参考爆发和VLTRLM2013菌株比较使用核心基因组(cg)和全基因组(wg) MLST分析。巴斯德研究所l。monocytogenesMLST数据库被用来执行cgMLST分析方案,其中包括1748个基因(18]。chewBBACA软件v2.5.4 [20.)是用于工作组/ cgMLST模式创建,等位基因的召唤,和cgMLST提取使用默认参数值。参考爆发压力读取使用与参考基因组VLTRLM2013傲慢的v4.6.0变体调用使用默认参数值(21]。基因组注释使用Prokka执行v1.14.6 UniProtl。monocytogenes蛋白质组(UP000000817)作为注释的参考和默认参数值(22,23]。等位基因的差异决定在wg / cgMLST分析翻译然后带注释的使用基本的局部比对搜索工具(爆炸)24- - - - - -26]。毒性的存在、金属和洗涤剂阻力,压力,和抗生素抗性基因的VLTRLM2013应变决心用巴斯德研究所l。monocytogenes数据库(18]
巴斯德研究所的所有结果的分析关于cgMLST,毒性,应力,金属和洗涤剂的阻力,和抗生素抗性基因可以通过访问BIGSdb-Pasteur网站下隔离标识号48183年分配到VLTRLM2013应变。
3所示。结果
这项研究表明,l。monocytogenes与推导出应变VLTRLM2013属于同一ST1247 CC8 PCR-serogroup花絮(4)(13,18)和相同的cgMLST集群(L2-SL8-CC8-CT4158,巴斯德研究所计划(18),分析由巴斯德研究所)作为参考爆发压力(10]。两个菌株有三个等位基因的差异(lmo1630(trpC),lmo2399,lmo2778)中检测到1744个位点隔离基于1748 cgMLST方案18]。
wgMLST方案使用基于VLTRLM2013 chewBBACA和创建和引用爆发菌株由2783个基因。等位基因的比较资料显示五个等位基因之间的差异两个隔离,隔离中检测到2770个位点。三个五个等位基因差异的整合与巴斯德研究所发现的差异1748 cgMLST方案18]。其他两个差异位点的限制性内切核酸酶亚基的代码和UDP-N-acetylmuromoyl-L-alanyl-D-glutamate, 2, 6-diaminopimelate连接酶蛋白质。四个,五个等位基因的单核苷酸多态性差异包括发现的lmo1630,lmo2399,lmo2778,禁闭基因。所有的检测单核苷酸多态性都产生并没有导致过早停止密码子(PMSC)。唯一non-SNP等位基因差异轨迹中标识为限制性内切核酸酶亚基编码蛋白质,两菌株的等位基因之间的相似性为76%基于BLASTp对齐。
的93 virulence-associated基因包含在巴斯德研究所毒性基因计划(18),57在场,可能VLTRLM2013功能(完成编码区域),包括”和inlB基因编码蛋白与宿主细胞入侵(27,28]。李斯特菌致病性岛1 (LIPI-1)在场,但LIPI-2 LIPI-3, LIPI-4基因不是孤立的基因组中发现VLTRLM2013 [29日- - - - - -32]。
没有一个12金属和洗涤剂中抗性基因的巴斯德研究所MLST计划被发现存在于数据库l。monocytogenes应变VLTRLM2013。
岛分析显示压力的存在lmo1800脂肪酶基因编码蛋白的毒性有关l。monocytogenes(33]。此外,这压力的分析发现存在生存胰岛(SSI-1)导致病原体的生长在理想条件下(34]。
WGS分析还揭示了存在的五种抗生素耐药性相关基因:fosX(磷霉素)35),lmo0919(lincosamides) [36),mprF(阳离子抗菌肽)37),norB(喹诺酮)38),而南(磺胺类药)。
4所示。讨论
使用的好处WGS加强监测验证了李氏杆菌病的范机器人瓦力et al。39]。这项研究表明,使用分子类型结合流行病学调查和食品接触可能导致多国爆发的早期检测集群相关l . monocytogenes(39]。WGS已成功应用于调查几个多国l。monocytogenes爆发在欧盟(9,10,40,41]。
许多研究报道复发性与持久性污染食品l。monocytogenes菌株生存在食品加工厂在几个月几年(1,4,42- - - - - -44]。在这项研究中,持久性定义为长期生存,例如,重复的隔离l。monocytogenes菌株属于食品加工环境中的ST1247反复交叉污染的食品在很长一段时间。l。monocytogenesST1247 CC8隔离匹配参考基因组爆发菌株的分离从2014年7月到2019年2月(10]。隔离来自爱沙尼亚的环境样品和鱼产品加工公司也从人类患者(10]。l。monocytogenesST1247 CC8应变VLTRLM2013被隔离在2013年1月从同一家公司的vacuum-packaged腌鲑鱼片产品。先前的研究在爱沙尼亚进行证实,RTE鱼产品是高风险类别产品有关l。monocytogenes(7,11]。回顾性分析发现霍乱。数占与霍乱疫情相关的存在l。monocytogenes应变在一年多前第一个霍乱病例数占与霍乱疫情相关的。应变VLTRLM2013被分配到同一个cgMLST集群(L2-SL8-CC8-CT4158)丹麦代表2017年暴发菌株分离。两株只有三cgMLST等位基因差异用巴斯德研究所计划(18),类似于核心基因组进化速率之前报道的莫拉et al。18]。cgMLST分析证实了这一假设l。monocytogenes应变爆发VLTRLM2013属于集群ECDC和欧洲食品安全署(检测到的10]。此外,wgMLST模式创建基于隔离启用扩展的结果从巴斯德研究所cgMLST架构。wgMLST分析显示只有5个等位基因之间的差异两个隔离。等位基因的数量差异表明,两个隔离非常相似,进一步支持一组假设。
l。monocytogenesST1247 CC8霍乱隔离已经流传了数占与霍乱疫情相关的六年,从2013年到2019年,导致长期多国爆发22李氏杆菌病病例(10]。在2014 - 2018年期间,总共9l。monocytogenesST1247菌株被发现在爱沙尼亚健康委员会(45]。SSI-1的存在,之前与持久l . monocytogenes压力(43),可能是相关的长期爆发的潜在原因l。monocytogenesST1247 CC8 VLTRLM2013隔离。SSI-1的存在会给增长隔离的一个竞争优势在低pH值和高盐的浓度,因此使隔离更持久的在理想条件下,例如,在食品环境(34]。
从所有确诊李氏杆菌病病例( )引起的l。monocytogenesST1247、五个病人死于或与疾病(10]。毒性相关的应变VLTRLM2013可能会57已知的毒力基因的存在揭示了毒力因子分析。结果包括”和inlB基因与宿主细胞入侵(27,28]。舒伯特et al。27)表明,listerial蛋白”在细菌粘附的作用,在人类的肠上皮细胞的入侵。后者是辅以InlB促进入侵细胞的能力不宽容”(28]。隔离VLTRLM2013港口LIPI-1基因,但缺乏LIPI-2 LIPI-3, LIPI-4基因,也没有金属和洗涤剂抗性基因。此外,VLTRLM2013有压力lmo1800脂肪酶基因编码蛋白的毒性有关l。monocytogenes体内(33]。菌株的基因组VLTRLM2013抗磷霉素抗生素抗性基因,lincosamides,阳离子抗菌肽、喹诺酮类、磺胺类药。
的持久特性多国霍乱。数占与霍乱疫情相关的l。monocytogenes应变VLTRLM2013一起压力岛、毒性和抗生素抗性基因可能会被这样一个广泛的长期爆发的原因影响欧盟五国(10]。
5。结论
回顾使用全基因组测序分析启用扩展的知识l . monocytogenes集群ST1247 CC8多国爆发。在目前的研究中,我们提供了洞察基因组水平持续的差异l . monocytogenes菌株与长期多国相关食源性疫情李氏杆菌病。国家食品控制等涉及不同利益相关者和公共卫生机构、大学和其他研究机构保证了提示食源性疾病暴发的流行病学分析。
系统和及时的WGS在常规监测中的应用有助于食源性疫情调查的有效性,因此,帮助预防和/或减少食源性霍乱病病例数占与霍乱疫情相关的。关于后者,WGS常规分析和基因组数据共享的重要性不可低估。
数据可用性
作者确认所有的支持数据,提供了代码,和协议内的文章。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
我们要感谢欧洲食品安全局(EFSA),欧洲疾病预防和控制中心(ECDC),提供丹麦代表暴发菌株基因组大会和巴斯德研究所的策展人BIGSdb-Lm数据库托管https://bigsdb.pasteur.fr有用的反馈。特别感谢Saara Kotila (ECDC)和亚历山德拉莫拉(巴斯德研究所)相关专题讨论和专业建议l。monocytogenespcr分析。这项工作是由欧盟支持的地平线2020格兰特COMBIVET 857418”设置比较医学的时代的椅子的兽医和动物科学研究所爱沙尼亚大学生命科学。”