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国际基因组学杂志
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国际基因组学杂志/2020/文章

研究文章|开放获取

体积 2020 |文章的ID 9054192 | https://doi.org/10.1155/2020/9054192

陈亮，胡春，阚俊涛，甘晓娜，张雪，张毅，杜军， ＂植物性膳食补充剂中草药对协同作用机制的综合研究:以保肝保健食品为例"，国际基因组学杂志， 卷。2020， 文章的ID9054192， 14 页面， 2020． https://doi.org/10.1155/2020/9054192

植物性膳食补充剂中草药对协同作用机制的综合研究:以保肝保健食品为例

梁辰，1 春胡，2 莫莉引擎盖，3. j，1 Xiaona甘，1 雪张，1 易张，1 和 俊杜1

1中国上海蔡伦路720号纽崔莱健康研究所，201203

2纽崔莱健康研究所，5600海滨大道，布埃纳帕克，CA 90621，USA

3.纽崔莱健康研究所，7575东富尔顿大街，Ada，密歇根州49355，USA

学术编辑：Antonio Ferrante.
已收到 2019年10月24日
修改 2010年3月1日
接受 2020年3月27日
发表 4月11日4月11日

抽象的

中药对被用作传统中药（TCM）中单味中药和多味中药配方之间的桥梁，为复杂的中药配方提供理论基础。中药对的有效性和合理性已被广泛用作膳食补充剂的一种策略。然而，由于草药材料的个体和组合的植物化学的复杂性，很难从分子或系统的角度揭示它们的有效和协同机制。为了解决这个问题，采用UPLC-Q-TOF/MS分析和系统药理学工具，以白芍为研究对象，探索其作用机制(白芍)及甘草(甘草)的膳食补充剂。从白芍和甘草中分离鉴定出16个化学成分，与73个肝脏保护相关靶点相互作用。然后进行基因本体论和京都基因与基因组百科全书(KEGG)路径富集分析和网络分析。结果表明，白芍和甘草的协同作用机制与其对胆汁分泌和ABC转运体通路的协同调节有关。此外，甘草对药物和外源性代谢途径有特异性反应，而白牡丹对toll样受体信号、c型凝集素受体信号、IL-17信号和TNF信号通路有特异性反应，从而防止肝细胞凋亡，减少免疫和炎症介导的肝损伤。这些研究结果表明，白芍和甘草对草药补充剂将通过互补和协同机制具有保护肝脏的作用。该方法为从中医理论出发探索膳食补充剂中草药配伍提供了一条新的途径。

1.介绍

中国传统医药（TCM）在中国已经实行了几千年。经过反复试验，某些草药混合成为经典的公式来对待抚养，提高生活质量，或滋养身体机能。虽然这些中药复方被有效利用，中各种草药或草药植物化学组合的复杂性使得它很难理解公式的有效性的根本原因在分子或全身水平。了解TCM式理和组合效应已成为一个障碍现代化TCM。因此，重要的是确定，开发和通过利用可用的工具验证的综合方法，以传统知识和可能的密钥解释，产品质量，提升产品开发[1］.

在中医理论和实践，草药对发挥中医配方战略中的重要作用。草药对两种草药中的标准比率的独特组合，其从多个多年的实践来确定[2］.经过几千年的实践，人们发现许多成熟的中药组合比单一中药具有更好的疗效和/或更低的毒性，尽管确切的机制尚未确定。由于中药对是中医方剂最简单的形式，对中药对的研究可能为了解中医方剂疗效的临床相关机制提供一个有用的途径[3.］.系统药理学(又称网络药理学和集成药理学)是生物信息学的一部分，也是生命科学中最活跃的领域之一。系统药理学可以描述植物化学物质和生物系统之间的复杂相互作用，这使得一个理想的工具，以确定潜在的作用机制和理论基础的中药配方[4］.以前的研究已经成功地解释了使用系统药理学在分子水平下草药组合的协同机制[5，6］.在系统药理学分析过程中，草药中化学成分的鉴定在系统中发挥了关键步骤。多个数据库可用于揭示草药的化学信息，包括中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php) [7]，中医（ETCM，）的百科全书（ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/) [8]和中医综合数据库（Tcmid，http://www.megabionet.org/tcmid/) [9］.草药材料通常进行萃取，浓缩和/或纯化，导致化学组合物的改变。因此，来自现有数据库的植物化学数据可能不会直接用于系统药理学探索。额外的化学鉴定方法，例如超级性能液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF / MS），可以是互补工具，以产生更准确的化学成分结果[10］.

白芍(白芍，芍药颇尔）和甘草（甘草，glycyrrhizae uralensis.FISCH。）组合是一种传统的草本对源自“寒害病论"在汉朝(公元前200年)[11］.白牡丹甘草对已用于汤剂以减轻炎症问题[12]通过调节抗炎和抗氧化途径[13，14］.白牡丹甘草对之间的协同作用可通过改善的生物利用率被部分地说明，如甘草酸和芍药苷的吸收是显著改善当口服给药一起[15］.此前，膳食补充剂（白芍药甘草片（WLT））正是基于此药对自行研制并成功注册为在中国的“防止化学性肝损伤的辅助功能要求的功能性食品（批准文号G20141040）”。在WLT的主要活性成分为白芍，甘草，葡萄籽提取物。中国食品药品监督管理局已经认证通过tetrachloromethane- WLT（CCL的功能4- ）或酒精诱导的肝损伤动物模型，中国的标准方法在中国检测和评估保健食品的技术标准（公共卫生部，中国，2003年版）。在我们目前的研究中，我们打算整合UPLC-Q-TOF / MS方法和先进的系统药理学，以探索这种膳食补充剂中白芍和甘草之间的潜在协同作用。

2.结果与讨论

建立了综合研究方法，以探索白牡丹-甘草对在声称对肝脏有益的WLT膳食补充剂中的协同作用机制。实验设计如图所示1．采用超高效液相色谱-高效液相色谱-质谱联用(UPLC-Q-TOF/MS)方法对黄芪中所有化学成分进行鉴定。从多个公共数据库中提取了这些植物化学物质的潜在靶标，随后Cytoscape构建了相应的Phytochemical-Targets (P-Ts)网络。其次，富集基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路，利用ClueGO构建靶路径(T-Ps)网络并进行分析。基于这些步骤的结果，白牡丹-甘草对的潜在协同机制将被论证和讨论。


图1
探索中药对协同作用机制的综合研究方法的实验设计。
2.1。化学成分鉴定

UPLC-ESI-Q-TOF / MS的高分辨率，灵敏度和准确性是研究中医草药植物化学谱的主要工具之一。鉴定了总共22种化合物，包括源自甘草提取物的11个三萜类化合物，源自甘草提取物，源自白色牡丹提取物的1种聚苯酚，以及来自葡萄种子提取物的3种多酚（表1)．负离子模式中的UPLC-Q-TOF-MS色谱分布如图所示2．由于缺乏参考化合物和文献报道，甘草中的3个三萜异构体未被鉴定。然而，这并不影响系统药理学分析的结果，因为不同异构体之间的靶标预测差异可以忽略不计。
不。 RT（分钟） 加合物 测量 预期的 质量误差(ppm) 公式 复合鉴定 MS / MS碎片离子 起源 参考
1 5.49 (mh)- 577.1379 577.1352 4.8 C30.H26O12 原花青素B2 577.1337;425.0909;407.0802;289.0715;125.0245 葡萄籽 ［59］
2 6.19 (mh)- 495.1511 495.1508. 0.6 C23H28O12 Oxypaeoniflorin 495.1516;137.0236 白牡丹 b
3. 6.57 [M-H] - 289.0738 289.0718 1.7 C15H14O6 儿茶素 289.0717;245.0826;203.0684 葡萄籽 b
4 9.80 [M + HCOO]- 525.1627 525.1614 2.5 C23H28O11 alibflin. 525.1608;479.1552;283.0826;121.0292;77.0390 白牡丹 b
5 11.87 [M + HCOO]- 525.1623 525.1614 1.8 C23H28O11 芍药 525.1639;479.1543;449.1444;431.1333;327.1076;165.0290;121.0290;77.0391 白牡丹 b
6 21.15 (mh)- 301.0002 301.9990. 4.0 C14H6O8 鞣花酸 300.9976;216.0066;172.0277;145.0294 葡萄籽 b
7 22.13 (mh)- 631.1685 631.1668 2.6 C30.H32O15 Galloylpaeoniflorin 631.1653;509.1293;491.1138;465.1376;313.0560;271.0382;169.0141 白牡丹 b
8 27.19 (mh)- 939.1144. 939.1109. 3.7 C41H32O26 1,2,3,4,6-O-Pentagalloylglucose 939.1149;769.0946;617.0835;431.0600 白牡丹 b
9 27.77 (mh)- 631.1683 631.1668 2.3 C30.H32O15 4-O- Galloylalbiflorin 631.1645; 169.0129; 121.0286 白牡丹 b
10 37.27 [M + HCOO]- 629.1893 629.1876 2.7 C30.H32O12 Benzoylpaeoniflorin 629.1875; 583.1810; 553.1707; 535.1593; 431.1332; 165.0560; 121.0294; 77.0397 白牡丹 b
11 37.41 (mh)- 983.456 983.4493 6．8 C48H72.O21 甘草 - 皂苷A3 983.4519;863.4062;821.4005;351.0552 甘草 ［10］
12 37.62 [M + HCOO]- 629.1897 629.1876 3.4 C30.H32O12 Benzoylalbiflorin 629.1880;583.1829;553.1720;387.1096;121.0291;77.0395. 白牡丹 b
13 38.65 (mh)- 837.397 837.3914 6．7 C42H62O17 yunghеosidek2. 837.3866; 351.0548 甘草 ［60］
14 40.6 (mh)- 837.3954 837.3914 4.7 C42H62O17 Licorice-saponin G2 837.3909;351.0600;193.0324. 甘草 ［60］
15 41.95 (mh)- 837.396 837.3914 5.5 C42H62O17 甘草的异构体 - 皂苷G2 837.3797; 533.6829; 351.0524 甘草 ［60］
16 42.42 (mh)- 837.3967 837.3914 6．3 C42H62O17 甘草的异构体 - 皂苷G2 837.3798;351.0520. 甘草 ［60］
17 42.86 (mh)- 821.4002 821.3965. 4.5 C42H62O16 甘草酸 821.3930;351.0544. 甘草 b
18 44.38 (mh)- 807.4212 807.4172 4.9 C42H64O15 甘草 - 皂苷B2 807.4032; 351.0560 甘草 ［61］
19 45.21 (mh)- 821.3996 821.3965. 3.8 C42H62O16 Licorice-saponin H2 821.3963;351.0555 甘草 ［61］
20. 45.94 (mh)- 823.4169 823.4122 5.8 C42H64O16 Licorice-saponin J2 823.3996;351.0522 甘草 ［61］
21 46.11. (mh)- 821.4019 821.3965. 6．6 C42H62O16 甘草酸的异构体 821.3855;351.0505 甘草 ［61］
22 47.04 [M + HCOO]- 823.4173. 823.4122 6．2 C41H62O14 Apioglycyrrhizin或Araboglycyrrhizin 823.3987;777.3985;351.0657;175.0220 甘草 ［62］
b由标准参考文献确定。
表格1
在WLT中鉴定的化合物由UPLC-Q-TOF / MS分析。

图2.
在WLT补充以负离子模式下使用UPLC-Q-TOF / MS白牡丹和甘草的层析谱。

单萜是白牡丹[的特性的植物化学物质16］.在单调萜类化合物中，Paeoniflorin是对属的复合物芍药属．它是白芍中含量最高的单萜类化合物，可作为白芍的质量控制指标。据报道，单萜类化合物在免疫性肝损伤中具有显著的肝保护作用[13，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) [17]，肝纤维化[18]，以及肝癌模型[19］.对于甘草，三萜类化合物是特征性植物化学物质[20.，其中甘草酸被认为通过抑制自由基生成和脂质过氧化而提供肝保护[14］.临床试验证据支持，甘草三萜降低NAFLD受试者丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平[21］.因此，白牡丹-甘草对的保肝作用归因于在该组合中的单萜和三萜化合物。

2.2。目标识别和P-TS网络建设

整合多个数据库，发现已鉴定的活性植物化学物质的潜在靶标。结果发现，73个与肝脏健康相关的靶点与白牡丹-甘草组合中发现的植物化学物质相互作用。表中显示了这些目标的列表2．可视的P-Ts网络(图3.)，以可视化植物化学物质与靶标之间的相互作用。白牡丹-甘草P-Ts网络由89个节点(73个靶点和16个化合物)和215条边组成。网络中每个植物化学物质的平均靶标数为4.8个，网络集中度为0.33。
目标ID 基因符号 目标名称 分配
T-1 AKR1C2. 醛酮还原酶家族1成员C2 两个都
T-2 ang 血管生成素 甘草
T-3 HMGCR 3-羟基-3-甲基戊齐芳基 - COA还原酶 甘草
T-4. VEGFA 血管内皮生长因子a 两个都
T-5 HSD11B1 羟基11-β脱氢酶1 甘草
T-6. NUDT1. Nudix水解酶1 甘草
T-7. ABCB4 ATP结合盒亚家族B成员4 白牡丹
T-8. ITGB2. 整合素亚单位β2 甘草
T-9. TTR. Transthyretin. 白牡丹
T-10 LGALS9. 加塞9. 白牡丹
T-11 ABCB1 ATP结合盒亚家族B成员1 两个都
T-12 HMGB1 高流动性组盒 甘草
T-13 ABCC2. ATP结合盒C亚家族成员2 甘草
T-14 CHEK1 检查点激酶1 白牡丹
T-15 ABCB11. ATP绑定盒子亚家族B成员11 两个都
T-16 CD14. CD14分子 白牡丹
T-17 lgals1. Galectin 1. 白牡丹
根据18 罗拉 rar相关孤儿受体A 白牡丹
T-19 SHBG. 性激素结合球蛋白 两个都
T-20 lgals3. Galectin 3. 白牡丹
T-21 ESR1 雌激素受体1 白牡丹
T-22 SLCO1B1 溶质载体有机阴离子转运家族成员1B1 两个都
T-23 PPARG. 过氧化物酶体增殖物激活受体 白牡丹
T-24 SERPINE1 Serpin family E成员1 白牡丹
T-25 IL2 白细胞介素2 白牡丹
T-26 PPARD. 过氧化物酶体增殖物激活受体 白牡丹
T-27 NR1H2 核受体亚家族1 H组成员2 白牡丹
T-28 BMP2 骨形成蛋白2 两个都
T-29 MAPK8. 丝裂原激活蛋白激酶8 白牡丹
T-30 GSTP1. 谷胱甘肽S-转移酶1 白牡丹
T-31 SRC. SRC原癌基因，受体酪氨酸激酶 甘草
T-32 UGT2B7. UDP葡萄糖醛酸转移酶家族2成员B7 甘草
t - GJA1 间隙结蛋白α1 甘草
T-34 TLR2 toll样受体2 甘草
T-35 白细胞介素6 白细胞介素6. 白牡丹
T-36 TLR4 toll样受体4 白牡丹
T-37 ABCC1. ATP结合盒C亚家族成员1 甘草
t - 38的 PRKCD 蛋白激酶C Delta 白牡丹
T-39 CXCL8 C-X-C motif趋化因子配体8 白牡丹
T-40 PRKCA 蛋白激酶C alpha 白牡丹
T-41 ANXA1 膜联蛋白A1 甘草
T-42 ATP1A1 ATPase Na + / K +运输亚基α1 两个都
T-43 CYP3A4 细胞色素P450家族3亚家族A成员4 甘草
T-44 CYP3A5. 细胞色素P450家族3亚家族A成员5 甘草
t - 45 MAPK14 丝裂原激活蛋白激酶14 白牡丹
T-46 ptpn1. 蛋白酪氨酸磷酸酶，非受体1型 两个都
T-47 TREM1 髓系细胞表达的触发受体1 白牡丹
T-48 PDPK1 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1 白牡丹
T-49 alb 白蛋白 甘草
t - 50 FGF2 成纤维细胞生长因子2 两个都
T-51 肿瘤坏死因子 肿瘤坏死因子 两个都
T-52 TNNI3. 肌钙蛋白I3，心型 白牡丹
T-53 CYP1A1 细胞色素P450家族1名亚家族A成员1 两个都
T-54 TNNT2 肌钙蛋白T2，心脏型 白牡丹
T-55 MCL1 BCL2家族凋亡调节剂 白牡丹
T-56 雌性生殖道 囊性纤维化跨膜电导调节剂 甘草
T-57 PPARGC1A PPARG共激活剂1α的 甘草
T-58 BCL2. BCL2，细胞凋亡调节剂 甘草
T-59 F2 凝血因子II，凝血酶 白牡丹
T-60. CASP3. 半胱天冬酶3 两个都
T-61 MMP3 矩阵metallopeptidase 3 白牡丹
T-62 BCL2L1 BCL2-like 1 甘草
T-63 CYP2C19 细胞色素P450家庭2子家族C成员19 甘草
T-64 F10 凝血因子X 白牡丹
T-65. CYP2C9 细胞色素P450家族2亚家族C成员9 甘草
T-66 CYP2C8 细胞色素P450家族2亚家族C成员8 甘草
T-67 UGT1A1 UDP葡萄糖醛酸转移酶家族1成员A1 甘草
T-68 ICAM1. 胞间粘附分子1 甘草
T-69. GC GC，维生素d结合蛋白 白牡丹
T-70. NR3C1 核受体亚家族3族C成员1 甘草
T-71. LPL 脂蛋白脂酶 甘草
T-72. nfkb1 核因子NF-Kappa-B 甘草
T-73 TNNC1 肌钙蛋白C，慢骨骼和心肌肌肉 白牡丹
表2.
鉴定了16种植物化学物质的靶标。

图3.
白牡丹和甘草植物化学物质的P-Ts网络及其潜在靶标甘草中的植物化学物质用蓝色矩形表示，白牡丹中的植物化学物质用橙色矩形表示。白牡丹或甘草的目标用淡蓝色的椭圆表示，而白牡丹和甘草的目标都用黄色的椭圆表示。
2.2.1。白色牡丹的靶蛋白

白芍中的8种植物化学物质抑制或激活45个肝脏保护相关靶点，其中芍药苷作用于18个靶点，包括CXCL8、IL6、TNF、MAPK14（p38）-α），MAPK8，TLR4，PPARG，NR1H2，FGF2，CD14，ABCB1，TTR，ATP1A1，CYP1A1，VEGFA，LGALS1，LGALS3，和LGALS9。芍药苷对上述目标，这些生物活性已通过验证体外和体内实验。据报道[22Paeoniflorin抑制了TLR4，MAPK14的表达（P38-α）和MAPK8（JNK1），其参与HMGB1-TLR4途径以保护免受肝脏缺血/再灌注（I / R）损伤。在原发性人肝正弦内皮细胞中观察到芍药蛋白的CXCL8抑制，表明芍药蛋白可有效缓解炎症诱导的肝损伤[23］.此外，Paeoniflorin通过调节PPAR途径来有效地防止NAFLD发育[24］.

2.2.2。甘草靶蛋白

甘草中鉴定的8个三萜共有41个肝脏相关靶点，其中甘草酸调节33个靶点，包括NFKB1、CASP3、TNF、LPL、HSD11B1、HMGB1、HMGCR、HSD11B1和细胞色素P450酶(CYP酶)。肿瘤坏死因子-α在内毒素引起的肝损伤以及急慢性肝病的发病机制中起着关键作用。NFKB1活化与许多炎症性疾病相关，CASP3活化在细胞凋亡中起作用。既往研究发现甘草酸的保肝作用与其通过抑制TNF、NFKB1、CASP3的抗炎、抗凋亡活性相关[25，26]. 同样，甘草酸通过阻止HMGB1诱导的肝细胞凋亡而抑制HMGMB1[27］.据报道，甘草酸对CYP酶起作用，其主要在肝脏中表达，并负责I相（氧化）代谢，以防止其诱导肝损伤[28］.此外，甘草酸下调肝脏中的LPL，促进脂质的脱离肝脏进入氧化组织，以防止脂质积聚在肝脏中[29］.

2.2.3。P-TS网络分析

网络显示SLCO1B1 ( ）与白芍和甘草中的植物化学成分互作最多，其次是ABCB1 ( )．SLCO1B1在肝基底膜高度表达，是相关的许多肝脏疾病。它由PharmaADME联盟[起着的胆汁酸和盐有助于药物清除的钠独立运输中起重要作用，并已被指定为一个ADME（吸收，分布，代谢和排泄）基因30.- - - - - -32］.ABCB1（也称为P-糖蛋白或多药耐药蛋白1）是在肠，肝，肾和上皮细胞膜局部的膜转运蛋白，并且它依赖于三磷酸腺苷（ATP）。通过胆管和肾近端小管，ABCB1为药物消除的功能性蛋白质，从而保护免受毒性外源物[各种组织33，34] ABCB1中的单一核苷酸多态性与阿托伐他汀诱导的肝损伤（AILI）密切相关[35］.这些结果表明，与药物/化学代谢和消除相关的胆汁分泌和膜转运蛋白可能是白芍和甘草以缓解化学诱导的肝损伤的重要机制。此外，一系列LGALS（半胶质素）蛋白质，包括LGALS1（ ),LGALS3（ ),和LGALS9（ ）被发现在仅白牡丹植物化学物质相互作用。LGALS蛋白与炎症和纤维化肝脏病理相关联36］.LGALS1通过neuropilin-1激活TGF-促进肝星状细胞的迁移和激活β和PDGF样信号传导[37］.LGALS3是肝脏炎症和纤维形成的关键介质，可能是肝炎症和纤维形成治疗干预的靶点[38，39］.越来越多的证据表明，LGALS9驱动器的各种的miRNA显示出对肝细胞的抗细胞凋亡，抗炎，和proproliferative功能以减轻肝疾病和损伤的进展[40，41］.因此，白芍的保肝作用可能主要是预防炎症性肝损伤。

2.3。GO富集和KEGG途径分析

顶端10富集显著GO在生物过程（BP），细胞组分（CC），和分子功能（MF）类别相关的字词被选择和显示在图4， 分别。结果表明，所得到的靶参与应对药物，化学品，脂质，和脂多糖（LPS），以及调节代谢，凋亡，和炎症过程可能导致肝保护。值得注意的是，目标的大比例与对药物的反应和LPS相关，这表明白芍，甘草对通过外源性代谢的调节保护肝脏。此外，78种显著KEGG途径（调整 值小于0.05）被成功地富集基于73个目标（细节是在补充表可用S1)．富集的KEGG通路可分为以下几个亚类:(1)外源性生物降解和代谢，包括药物代谢-细胞色素P450 (KEGG:00982)和外源性药物通过细胞色素P450的代谢(KEGG:00980);(2) ABC转运体的膜转运(KEGG:02010);(3)炎症和氧化相关信号转导，包括MAPK (KEGG:04010)、VEGF (KEGG:04370)、NF-kappa B (KEGG:04064)、TNF (KEGG:04668)、AMPK (KEGG:04152)和mTOR (KEGG:04150)信号通路;(4)免疫系统，包括toll样受体(KEGG:04620)、nod样受体(KEGG:04621)、rig - i样受体(KEGG:04622)和T细胞受体(KEGG:04660)信号通路;(5)胆汁分泌消化系统(KEGG:04976);(6)化学致癌癌(KEGG:05204);(7)其他。图中显示了白牡丹-甘草对可能影响的与肝保护益处相关的潜在途径5．毒素包括酒精，环境污染物，以及某些药物进入经门静脉或代谢和消除系统性流通肝脏;因此，肝脏受到毒性损伤，其频率高于其他器官。化学性肝损伤的发病机制可能是由于以下系统的机制来概括：（一）直接细胞功能障碍，（二）小管和胆汁淤积损伤，（C）自身免疫和炎症，刺激（d）细胞凋亡的刺激[42- - - - - -44］.因此，白牡丹-甘草对上保护免受化学性肝损伤的底层机制可以通过调节进行说明化学品，药物，和通过CYP代谢异生物质的酶来减少细胞功能障碍;防止泪小管和胆汁淤积损伤调节涉及ABC转运蛋白和胆汁分泌途径，促进胆汁酸形成和移动膜转运蛋白;通过调节NF-κB的，TNF，VEGF，mTOR的，MAPK，AMPK，Toll样受体，和NOD样受体信号途径减少免疫应答和炎症;并通过细胞凋亡和p53信号通路减少细胞死亡。


图4.
对于所获得的白牡丹-甘草对目标GO富集分析：生物过程富集（蓝色），细胞组分富集（棕色），和分子功能富集（橙色）。
（一种）＂name=
（一种）
（b）＂name=
（b）
图5.
富含白芍对潜在目标的Kegg途径的分布。（a）潜在的肝脏保护效果相关途径的重量;（b）分布在所选途径中的基因的重量。

NAFLD是肝细胞内脂肪的积累，当脂肪的输入或合成超过其输出或降解[45］.NAFLD途径（KEGG：04932）复杂且由多种途径组成，包括II型糖尿病，脂肪酸生物合成，内质网，凋亡，氧化磷酸化，PI3K-ATP，胰岛素信号传导，脂肪细胞因子信号，PPAR信号，和TNF信号传导途径。在这项研究中，发现白色牡丹甘草在多个NAFLD相关途径上采取行动，包括PI3K-ATP（ ),细胞凋亡( ),TNF信令（ ),adipocytokine信号（ ),及PPAR信号( )．这表明，白芍甘草对有助于改善NAFLD。

2.4。协同机制研究 - 基于集群T-PS网络分析

ClueGO分析共富集并聚类了25条具有统计学意义的KEGG通路(Supplementary table)S2)．集群的T-PS网络如图所示6．在AGE-RAGE信号转导通路具有目标连接的最大数目（ ),其次是化学致癌，11度。其他先前提到的途径，如胆汁分泌( ),胰岛素抵抗 （ ),TOLS样受体信号传导途径（ ),药物代谢( ),和ABC运输车（ ),也在该T-PS网络显著富集。群集T-PS网络可以被归类到三个官能团：（1）通过CYP酶的生物外源性生物降解和代谢;（2）膜转运以及用于调节脂肪，胆固醇，或异生素消除胆汁分泌;炎症，氧化应激，免疫和细胞凋亡的和（3）信号传导。有趣的是，甘草的目标特异性富集所述第一和第二官能团的途径，而白牡丹的目标特异性富集所述第三官能团的通路。


图6.
白芍-甘草对的肝脏保护相关聚集T-Ps网络。白芍和甘草的目标分别用蓝色和红色椭圆表示。白芍和甘草的路径簇分别用蓝色和红色圆圈表示。颜色的明暗度与颜色成反比 价值。

协同的概念是中医哲学的内在组成部分[46］.中药对被认为通过增强疗效和/或减少毒性而表现出协同作用[2］.草本对可以针对不同的生物过程/途径，但效果导致类似的健康结果。在我们现在的工作中，探索了白芍 - 甘草对的协同效应和解释。首先，白牡丹和甘草可以通过在相同或不同的目标上作出相同的肝脏保护相关途径。例如，SLCO1B1，ABCB1，ABCB11和ATPIA1通过白牡丹和甘草的植物化学物质是COREGUICATIOG，而ABCC1，ABCC2，HMGCR和CFTR仅受甘草的植物化学物质调节，ABCB4仅被白牡丹的植物化学物质调节。这些靶标涉及胆汁分泌和ABC转运途径，其与消除过量的胆固醇，废物和有毒化合物有关，以防止化学诱导的肝损伤。这些结果表明，肝脏保护潜在肝脏保护的白芍和甘草的协同机制可以部分地解释它们的胆汁分泌和ABC转运途径的核心。但是，结果需要进一步的实验验证。作为一种用于肝脏健康的传统解毒草药，甘草已经通过其对胆汁分泌的调节来验证[47］.根据上述蛋白在组织中的分布情况，白芍和甘草可能通过调节SLCO1B1和ATP1A1转运体协同促进肝细胞产生胆汁酸，然后通过调节ABCB11 (BSEP)、ABCC2 (MRP2)、ABCB1 (MDR1)和ABCB4 (MDR3)转运体向胆管转运。其次，白牡丹和甘草可能通过调节不同的生物途径协同保护肝脏。如图所示6，甘草调节药物和外源性代谢相关途径，防止其代谢物与蛋白质和核酸结合，从而导致肝脏损伤。白牡丹主要负责调节toll样受体信号、c型凝集素受体信号、TNF信号、IL-17信号等通路，减少新抗原诱导的自身免疫和炎症刺激，氧化应激诱导的凋亡，预防炎症和免疫介导的肝损伤。

3.材料与方法

3．1.补充和试剂

WLT补充资料来自安利（中国广州）；批号为20171121。WLT中芍药苷和甘草酸的含量分别为4.3%和3.5%。Hypergrade甲醇和乙腈购自默克公司（德国达姆施塔特）。甲酸来自CNW Technologies GmbH，超纯水来自A.S.沃森集团（香港）有限公司。其他分析级试剂来自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。

3.2. 基于UPLC-Q-TOF/MS的WLT植物化学分析

将10片样品片粉碎。100 然后将mg粉末转移到带塞子的锥形烧瓶中，并进行30分钟的超声波处理 最小值（KQ-300DB，300 W、 四十 （千赫）25 ml甲醇，分析前过滤。在安捷伦1290 UPLC系统（安捷伦科技公司，美国帕洛阿尔托）上进行化学分析，该系统与配备双射线源（电喷雾电离，ESI）的Sciex TripleTOF 4600®四极飞行时间质谱仪（德国达姆施塔特AB Sciex）耦合。Acquity UPLC®HSS T3柱( I.D.，1.8 μM水）用于组分分离。流动相为含0.1%甲酸（A）和乙腈（B）的水。使用以下梯度条件：0-3.0 最低，2%-10%B；3.0-5.0 最低，10%-11%B；5.0-12.0 最低，11%B；12.0-20.0 最低，11%-15%B；20.0-25.0 最低，15%-17%B；25.0-29.0 最低，17%-19%B；29.0-33.0 最低，19%-23%B；33.0-35.0 最低，23%-32%B；35.0-50.0 最低，32%-42%B；50.0-58.0 最低，42%-50%B；和58.0-63.0 最小，50%-80%B，流速为0.3 ml/min。注射量为3 μL，柱烘箱温度设定在30℃。质谱仪在全扫描TOF-MS中操作 100-1500和信息依赖采集(IDA) MS/MS模式，包括正离子和负离子模式。碰撞能量为 ，ion source gas 1 and 2 were set 50 psi, and curtain gas was 35 psi. The temperature and ion spray voltage floating were 500°C and 5000/-4500 V, respectively.

数据收集和分析使用Analyst Ver. 1.6软件(AB Sciex, USA)。参照SCIEX天然产物的HR-MS/MS谱库、标准参考文献和文献报道，根据保留时间、前体离子质量准确度、MS/MS谱图和裂解途径对化合物进行初步表征。

３．３．目标预测与筛选

除了现有的TCM数据库，包括TCMSP、ETCM等，公共研究平台提供的储备复合靶标捕捞技术也常用来进行靶标预测[48，49］.UPLC-Q-TOF / MS鉴定化合物的SDF和规范微型格式，并获得了PUBCHEM（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound). 然后，组合多个数据库以获得尽可能多的目标，包括TCMSP、ETCM( 被选择），针迹（http://stitch.embl.de/) [50]，相似性集合方法（SEA）（http://sea.bkslab.org/) [51]，瑞士目标预测（STP）（http://www.swisstargetprediction.ch/） ( 被选中）[52]及药物银行(https://www.drugbank.ca/)．所有获得的目标都仅限于智人并映射到的UniProt（https://www.uniprot.org/），CTD（http://www.ctdbase.org/），以及数据库和治疗靶点数据库（https://db.idrblab.org/ttd/)，以便归一化[6]，去除冗余和错误的目标，以保证目标的准确性。PubMed基因的文本挖掘（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)以“肝损伤”或“肝损伤”为关键词检索与肝相关的靶点。将获取的靶标下载并添加到肝脏损伤相关靶标数据库中。只保留了与肝损伤相关的靶标数据库中存在的植物化学物质靶标。字符串(11.0版本,https://string-db.org/) [53]采用筛选核心目标。挑选具有大于或等于0.7的蛋白质 - 蛋白质相互作用评分的靶标以进行下一个功能分析。

3．4．GO和KEGG通路富集

大卫生物信息学资源6.8(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp) [54]，一个在线标注、集成和可视化平台，用于进行GO分析，包括BP、CC和MF [55］.排名前十的词汇( ， 使用“Benjamini-Hochberg”方法对BP、MF和CC类别中的值进行调整（分别列出多项测试）。OmicsBean平台(http://www.omicsbean.cn.) [56]是一种多组数据分析工具，可使KEGG通路数据库保持更新，并用于进行通路富集分析。统计分析采用超几何算法的Fisher精确检验，然后采用“Benjamini-Hochberg”方法进行调整。

3．5．网络建设与分析

P-Ts网络由Cytoscape(版本3.6.1)生成[57]，一种用于生物网络可视化和数据集成的流行生物信息工具。在构建的网络中，植物化学物质和靶标由节点表示，而它们之间的相互作用由边缘表示。Cytoscape的网络分析仪用于分析其定义为连接到节点的边的数量并且由节点大小表示的重要拓扑参数度。来自不同草药的植物化学和目标由不同的颜色表示。为了证明白芍甘草对改善肝脏健康的协同作用，使用Cluego（最新版本2.5.4）生成并分析聚类目标路径（T-PS）网络[58]，一个Cytoscape的插件最新KEGG通路数据库集成。从白牡丹和甘草目标进口到ClueGO分别作为两个基团并且通过不同的颜色来表示。ClueGO分析的视觉风格设定为“集群”。每个簇的基因的最小数目和最小百分比分别为5和5％之间。集群特异度为60％。通路网络连接的卡伯分数设定为0.6。双面使用，并使用邦弗朗尼步骤上下调整超几何测试。

4。结论

总之，目前的工作提供了使用UPLC-Q-TOF / MS方法和先进的系统药理学探索白Peony-和有效和协同机制的综合调查甘草为主的保护肝脏的膳食补充剂。从白芍药甘草作用于肝脏73健康有关的目标，然后充实与肝保护津贴78种显著KEGG途径鉴定的植物化学化合物。这些与展示群集T-PS网络的分析结果一起，该白牡丹-甘草对协同机制可能是由于这样的事实，它们coregulate胆汁分泌和ABC转运途径和甘草具体地调节药物和异生物质代谢途径，导致消除的外源化学品的，而白牡丹具体响应Toll样受体信号转导，C型凝集素受体信号，IL-17信号传导，TNF信号，等等的途径，从而防止肝细胞凋亡并减少免疫和炎症介导的肝损伤。这项研究是由缺乏限制体外实验数据来验证这些发现;需要进一步的实验验证来证实我们的发现。本案例研究为探讨中药对的协同作用机制提供了一种综合的调查方法，可为基于草药和植物的膳食补充剂设计的配方策略提供理论依据。

数据可用性

所有用于支持本研究发现的研究数据均可在要求时从通信作者处获得。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们要感谢上海周阳博士标准科技有限公司为植物化学分析和鉴定。

补充材料

补充表S1:芍药、甘草对保肝作用的KEGG通路。（补充材料）

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