子宫颈癌总体生存预测的一个基于5个基因的预后特征

抽象

目的. 本研究旨在确定宫颈癌的预后特征。主要方法.基因表达数据和子宫颈癌和正常宫颈组织的临床信息是从癌症基因组图谱和从基因表达综合数据库的三个数据集获得的。DESeq2和LIMMA被雇用屏幕差异表达的基因（DEGS）。所有数据集之间的重叠度的视角被认为是最后的度的视角。然后，进行了功能富集分析。此外，进行Cox比例风险回归建立DEGS的预后标志。在Kaplan-Meier分析应用到测试模型。基因表达和在宫颈癌临床病理参数，包括年龄，HPV状态，组织学，分期和淋巴结转移之间的关系，通过卡方检验。这些预后基因的体细胞突变是通过cBioPortal评估。该模型的鲁棒性在另外两个独立验证群体进行了验证。主要发现.总共169重叠上调的基因和29点重叠的下调的基因在宫颈癌鉴定与正常宫颈组织相比。功能富集分析表明DEGS主要富集在DNA复制，细胞周期，和p53信号传导途径。最后，5 - 基因 - （ITM2A，DSG2，SPP1，EFNA1和MMP1）的预后标志建成。根据这个模型，每个病人被赋予了预后相关的风险值。在Kaplan-Meier分析表明，高风险与宫颈癌较差总体生存期，与接收了15年的经营特征0.811曲线下面积。这种模式在宫颈癌结果的预测的有效性在其他两个独立的数据集进行了验证。此外，我们的研究还发现，ITM2A的低表达与宫颈腺癌有关。有趣的是，DSG2与子宫颈癌的HPV状态相关联。意义.我们的研究宫颈癌构建的预测模型，并发现了两个新基因，ITM2A和DSG2，与宫颈癌的发生和生存有关。

一。介绍

宫颈癌在全世界女性中排名第四[1个]. 即使在美国等发达国家，2019年也有约13170例新诊断的宫颈癌病例和4250例死亡病例[2个]. 尽管在宫颈癌筛查技术和人乳头瘤病毒疫苗应用方面取得了一些进展，但存活率仍然很低[三]。宫颈癌另一个关键问题是患有相同疾病的个体之间的临床结果的异质性4个]. 因此，有必要建立一个分子工具来帮助预测患者的预后和制定个性化的治疗计划。

随着下一代测序技术的飞速发展，人们发现了各种各样的基因改变，包括基因的高频突变和癌症中失调的信号通路[5个]. 最近，许多研究表明信使RNA表达在包括宫颈癌在内的多种癌症中的临床重要性[6个]. 信使rna在多种多样的生理和病理过程，如分化、细胞增殖、发育、凋亡和应激反应[7个]。

转录组测序技术（RNA-Seq）和微阵列数据为癌症遗传学研究提供了一个理想的平台。基因表达综合库（GEO）和肿瘤基因组图谱（TCGA）库为宫颈癌的研究提供了丰富的样本资源，有助于寻找可靠的生物标志物。在目前的研究中，对宫颈癌的基因表达进行了分析，以确定预测患者预后的关键基因。通过差异表达基因（DEG）分析和Cox比例风险模型，最终构建了一个基于几个关键基因表达的宫颈癌预后标志。该模型可作为预测宫颈癌患者预后的有效工具。这一发现也有助于确定宫颈癌的新治疗靶点。

2。材料和方法

2.1。数据源

高通量测序数据集和宫颈癌患者的临床信息是从TCGA网站预后信号的筛选下载。三个微阵列数据（GSE6791 [八]，GSE7803号[9个]，和GSE9750[10]）从GEO数据库获得。总共423个样品，包括378个宫颈癌样品和45个正常宫颈组织样品而言，在本研究中收集。

2.2。的识别度

原始计数数据来自TCGA提取。所述DESeq2包[11]作为R用于标准化和识别度的视角。宫颈癌样品中DEGS与相邻的正常宫颈组织相比具有调节的阈值，获得值<0.05和 .的LIMMA包[12]for R用于微阵列数据以识别DEGs。门槛 和 被用来筛选出DEGS。所有数据集之间的重叠度的视角被认为是最后的度的视角。

2.3条。功能富集

基因本体论(GO)资源提供了关于许多不同生物体基因功能的科学知识[13,14]。GO富集分析通过使用在线软件数据库进行注释、可视化和集成发现(DAVID，版本6.8)[15]. GO项由分子功能（MF）、细胞成分（CC）和生物过程（BP）三大类组成。京都基因和基因组百科全书（KEGG）路径数据库分析了路径富集[16]，它由反应网络和分子间的相互作用的生化途径的图的集合的。 被认为是一个显著的差异。

2.4条。预测信号构建与评价

从TCGA下载每百万值千碱基片段的表达式配置文件，并执行log2转换。应用生存包进行单变量Cox比例危险度回归分析，分析各DEG的预后价值[17]，与总生存率显著相关的R. DEGs ( )留作进一步分析。其次，在SPSS（18.0版）中采用多变量Cox比例风险逐步回归和后向选择建立预后模型。根据基因表达值的线性加权组合建立预后特征。每个基因的权重为回归系数( )从多元Cox比例风险回归分析。预后风险评分预测总生存期（OS）如下： .根据中位数风险评分，将患者分为低和高风险人群。然后，预后标志模型是由Kaplan-Meier分析研究。为了评估宫颈癌结果预后签名的预测准确性，接收器操作特性（ROC）曲线是由survivalROC包R.绘制

2.5条。宫颈癌临床病理参数分析

从TCGA下载宫颈癌患者的预后基因表达水平和临床病理参数，包括年龄、HPV状态、组织学、分期、淋巴结转移等。只包括有相关临床资料的样本。根据基因表达中值将患者分为低表达组和高表达组。应用卡方检验分析宫颈癌基因表达与临床病理参数的关系。 被认为是统计学上的显著差异。

2.6条。预后基因突变

通过cBioPortal评估宫颈癌患者预后基因的体细胞突变，包括错义突变、截断突变、融合、扩增和深度缺失[18]。

2.7。的预后标志的鲁棒性的验证

的预后标志的对宫颈癌患者生存期预测的稳健性在验证群体评价GSE52903和GSE39001 [19,20]。相应的基因的差异表达水平，通过Student的比较 -测试。被施加的Kaplan-Meier分析，以确认的预测模型中的预后签名。

2.8条。宫颈癌临床参数与危险度评分的预后价值

此外，所有的临床资料，包括年龄，HPV状态，组织学，分期，淋巴结转移，都是从TCGA收集的。采用单变量Cox比例危险度回归和多变量Cox比例危险度回归分析宫颈癌临床参数和危险度评分的预后价值。 被认为是统计学上的显著差异。

3.结果

3.1条。宫颈癌与正常宫颈组织差异表达基因的鉴定

在数据集TCGA，正常宫颈样品相比，被确定3 769个基因被上调显著，而被发现2点297的基因在宫颈癌被显著下调。对于数据集GSE6791，宫颈癌和正常宫颈样品之间的差异表达分析鉴定3个991上调DEGS和488个下调DEGS。对于GSE7803和GSE9750数据集，502个上调和下调414和DEGS 1 432上调和3个525下调DEGS是在宫颈癌分别发现。总之，与正常宫颈样本，169个上调DEGS和三个微阵列数据和所述数据集TCGA之间重叠宫颈癌29个下调DEGS相比（图1个)。

3.2条。宫颈癌的功能富集

GO富集表明，DEGS被主要涉及生物过程的功能，其中包括DNA复制（ ）细胞分裂 （ ）和G1 / S的有丝分裂细胞周期的过渡（ )。在细胞室类别的GO结果表明，度的视角主要富集于核质（ ）核（ ）和船体中部（ )。在分子功能方面，DEGs参与了蛋白质结合( ）ATP结合( ）和DNA结合( )。图中显示了前10个GO术语2个.

KEGG途径的富集表明DEGs在DNA复制、细胞周期和p53信号途径中显著富集（图三)。

3.3条。预测信号构建与评价

进一步分析将通过DEGS单变量Cox比例风险分析，以确定宫颈癌的生存相关的基因。分析鉴定8是被显著相关的总生存期差在TCGA队列和均与良好的整体生存3下调度的视角（上调度的视角 )。总共发现11生存相关度的视角。

然后，进行构建预后模型的多变量Cox比例风险分析。五个基因，ITM2A，DSG2，SPP1，EFNA1和MMP1，这表明一个显著值，已选定（表1个)。用该方法计算了线性模型 .在TCGA数据集中计算每个患者的风险评分。根据中位风险评分，将患者分为高危组和低危组。Kaplan-Meier分析显示，高风险患者组的总生存期明显短于低风险患者组(图2)图4（a）)。风险分数，生存状态和个体患者的基因表达水平的分布显示在图4 (b). 此外，进行ROC分析以评估预后模型的预测准确性。10年预测曲线下面积（AUC）为0.762。15年预测的AUC高达0.811（图4 (c))。

3.4。宫颈癌临床病理特征分析

探讨5种预后基因表达与宫颈癌临床病理参数的关系。如表所示2个，ITM2A表达与宫颈癌的组织学相关联。宫颈癌患者ITM2A的低表达更可能具有腺癌或腺鳞癌，而宫颈癌患者ITM2A的高表达倾向于具有鳞状细胞癌。然而，ITM2A表现出与年龄，HPV状态，阶段，或淋巴结转移宫颈癌没有关联。

DSG2表达与宫颈癌不同临床病理参数的关系见表三.有趣的是，DSG2表达与HPV状态。所有的宫颈癌患者有DSG2的高表达是HPV阳性。然而，患者的DSG2的低表达大约9.1％为HPV阴性。DSG2表达与在宫颈癌患者其他临床病理参数相关。

表4个和5个表明EFNA1和MMP1与宫颈癌患者的临床病理参数无相关性。

表6个显示SPP1在宫颈癌的结果。SPP1发现可能与宫颈癌患者的年龄和组织学。患者高SPP1表达均高于低SPP1表达老。低表达组倾向于具有腺癌型子宫颈癌。

3.5。预后基因突变

本研究进一步探讨了5个预后基因的体细胞突变（图5个)。在宫颈癌中，10%的患者显示MMP1基因改变。2.5%的宫颈癌患者存在EFNA1突变。扩增是这两个基因中最常见的突变。DSG2、SPP1和ITM2A的突变率分别为2.2%、1.8%和1.8%。在ITM2A中可见缺失，这些突变可能与相应基因的异常表达有关。

3.6条。预测信号稳健性的验证

在验证队列GSE52903和GSE39001中对预测宫颈癌患者生存的预后特征的稳健性进行了评估。GSE52903数据集由17个正常宫颈组织和55个宫颈癌样本组成。首先，检测正常宫颈组织和宫颈癌标本中5种预后生物标志物的差异表达水平。ITM2A在宫颈癌中较正常宫颈标本下调，其余4个基因(DSG2、SPP1、EFNA1、MMP1)在宫颈癌中显著上调，与上述结果一致(图)图6（a）–6（e）)。然后，从个人宫颈癌患者的风险分数根据上面所示的预后线性模型进行了计算。将患者分为高风险和低风险群体。的卡普兰 - 迈耶结果表明高风险评分与较短的总体生存期，这证实了上述结果发现（图相关联的6（华氏度）)。

所述数据集GSE39001由12个正常宫颈组织和43个宫颈癌样品。上述结果在GSE39001数据集进一步证实（图7个)。

3.7。宫颈癌临床参数和风险评分的预后价值

此外，还分析了宫颈癌患者临床参数的预后价值(表)7个)。单变量Cox比例风险回归分析显示淋巴结转移和风险评分与总生存期相关。然而，多变量Cox比例风险回归显示，只有风险评分是宫颈癌生存的独立预后指标。

四。讨论

宫颈癌是女性最致命的恶性肿瘤之一，给家庭和世界带来沉重负担[21]。宫颈癌结果的准确预测是对治疗方法的选择和预后的改善具有重要意义。在本研究中，四个独立的数据集被用来确定子宫颈癌和正常宫颈组织之间DEGS。总体上，198度的视角，包括29个下调和169上调基因，进行了鉴定。为了更好地了解宫颈肿瘤发生机制，进行了DEGS的富集分析。在GO富集方面，DEGS主要富集在DNA复制，细胞分裂，和有丝分裂的细胞周期的G1 / S转换。的KEGG通路结果表明，DEGS主要参与DNA复制和细胞周期。这些调查结果与事实DNA复制和细胞周期调控在癌症的发展中发挥重要作用一致[22]。

为了确定与生存相关的DEGs，进行了单变量Cox比例风险回归。共发现11例与生存相关的DEGs。然后，通过逐步选择，选择5个独立的预后mrna（SPP1、EFNA1、MMP1、ITM2A和DSG2）并结合构建预后特征。基于这五个基因的预后模型在区分宫颈癌患者预后的好坏方面显示了很高的效率。根据Hosmer-Lemeshow分类法，ROC曲线下0.80到0.90的区域被认为是优秀的[23]. 该模型15年预测ROC曲线下面积达到0.811。在两个独立的队列中证实了预后特征的稳健性。在临床上，这种预后特征可以作为宫颈癌生存率的预测指标。

SPP1是SIBLING家族的分泌glycophosphoprotein播放在生理和病理生理学过程中起关键作用[24]. 在多发性癌症中，包括结肠癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病和慢性髓系白血病中，已观察到SPP1的高表达[25–27]。SPP1表达也较高宫颈癌[28]. 在Cho的研究中，SPP1作为宫颈癌的诊断生物标记物具有50.6%的敏感性和95.0%的特异性[29]。SPP1的高表达密切相关，更糟糕的无病生存期和总生存期的宫颈癌患者[29]. 目前的研究结果与以前的研究一致。

EFNA1，糖基磷脂酰肌醇锚定的配位体，与其受体结合EPHA2，以促进自体磷酸化[30个,31个]。自磷酸化然后触发下游信号以调节细胞迁移和生长[30个]。EFNA1，肿瘤相关基因，在许多肿瘤中，包括子宫颈癌是显著上调[32个–36个]. 据报道，EFNA1的表达与宫颈癌的深部浸润、旁浸润、肿瘤大小和预后有关[36个,37个]。我们的研究还发现EFNA1的高表达的宫颈癌，其表达与总体生存较差。

基质金属蛋白酶1（MMP1）用作在细胞外基质的降解在正常生理过程和疾病过程[酶38个]。越来越多的证据表明，MMP-1起着致肿瘤和癌症转移关键作用[39个]. 一些研究已经观察到MMP1在宫颈癌中的上调[40个]. MMP1基因敲除可通过上皮-间质转化抑制宫颈癌细胞的侵袭、迁移和增殖[41个]。MMP1用在宫颈癌淋巴结转移和指示不利存活相关[41个]. 本研究支持先前的报道，表明MMP1的高表达与宫颈癌的总体生存率低有显著相关性。

ITM2A是含有Brichos结构域[II型整合膜蛋白42个,43个]. 一些研究支持ITM2A与细胞分化有关，包括软骨发生、成牙。和肌生成阶段[44个–46个]。先前的研究发现，ITM2A显着下调在浸润性卵巢癌与正常卵巢组织[比较47个]. 此外，ITM2A的丢失与卵巢癌的FIGO分期高、复发、化疗耐药和预后差显著相关[47个]。ITM2A诱导G2 / M细胞周期停滞和抑制卵巢癌细胞的生长通过降低细胞周期蛋白B1，P-CDC2，CDC2，和CDC25C的表达[表达47个]。以上结果提示ITM2A可能作为卵巢癌的肿瘤抑制因子。然而，目前还没有关于ITM2A在宫颈癌中的表达及预后价值的研究。在这项研究中，ITM2A被证明是下调的，并与宫颈癌的良好预后相关。ITM2A的不同表达水平也与宫颈癌的具体组织学表型相关。ITM2A低表达的宫颈癌患者更容易发生腺癌或腺鳞癌，而ITM2A高表达的宫颈癌患者更容易发生鳞状癌。与鳞状细胞癌相比，宫颈腺癌的预后更差[48个,49个]。我们的研究发现，ITM2A的低表达与预后差，宫颈腺癌有关。在临床实践中，ITM2A可能被用作用于子宫颈癌的分类的指标，并用低ITM2A表达可以更积极的治疗子宫颈癌的患者。当然，这一发现还需要进一步调查。

细胞间粘附在维持多细胞结构和细胞 - 细胞信号传递[中起重要作用50个]。桥粒是提供强的粘合强度间的连接，和桥粒成分的失调可通过改变细胞信号传导途径[导致癌症的发展51个]. DSG2是一种跨膜桥粒钙粘蛋白[52个]. DSG2在各种癌症中有不同的功能，可以作为癌基因或肿瘤抑制因子。一些研究者报道了DSG2在黑色素瘤、人上皮鳞状细胞癌、基底细胞癌、非小细胞肺癌和结肠腺癌中的高表达[52个–55岁]。然而，DSG2在前列腺癌，胰腺肿瘤，和弥漫型胃癌[下调56个–58个]。DSG2据报道，参与调节肿瘤细胞增殖和肿瘤形成。蔡等人。[54个]提示DSG2表达下调导致非小细胞肺癌细胞生长抑制和G1期阻滞。Kamekura等人。[55岁]发现DSG2的损失抑制细胞增殖通过EGFR信号传导在结肠癌。血管形成是在小鼠的DSG2损失菌株减毒[59个]. Tan等人。[53个]研究发现，DSG2可能在人类黑色素瘤，这是肿瘤的血液供应的另一个重要方法调节血管生成拟态的活动中发挥着重要的作用。DSG2还担任在黑素瘤不良的预后指标[53个]. 目前还没有关于DSG2在宫颈癌中的报道。在本研究中，在子宫颈癌中观察到DSG2的上调，提示其预后不良。值得注意的是，DSG2与宫颈癌的HPV状态有关。提示DSG2可能参与HPV诱导的宫颈癌。但DSG2与HPV协同作用在宫颈癌发生中的作用尚需进一步研究。

5.结论

总之，本研究将5个微阵列数据集与一个RNA-Seq数据集相结合，构建并验证了一个基于5基因mRNA表达的特征，它可以作为宫颈癌生存率的独立指标。SPP1、EFNA1和MMP-1在宫颈癌中的预后价值已有研究。在我们的研究中也发现了类似的结果。值得注意的是，ITM2A和DSG2是两个从未在宫颈癌中研究过的新基因。此外，ITM2A与宫颈癌不同的组织学表型有关。DSG2与宫颈癌的HPV状态有关。这些发现有助于更好地了解宫颈癌的潜在机制，并有助于制定精确的个体临床治疗决策奠定基础。然而，目前的研究结果需要在未来的研究中进一步验证。这五个基因在细胞和动物模型中的敲除和过度表达可以用来验证这些基因在宫颈癌中的致癌作用。

数据可用性

表达数据和子宫颈癌和在该研究中分析的正常宫颈样品的临床信息可从TCGA（获取http://cancergenome.nih.gov网站/)和地理(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。

伦理审批

从公开的数据集，得到在这项研究中的所有数据。无需额外的患者在本研究中招收。

利益冲突

提交人已声明不存在任何相互竞争的利益。

致谢

这项工作是由温州市（第ZS2017006）和中心的科学技术计划项目子宫癌诊断与浙江省的治疗的研究资助。主办方曾在收集，分析和解释数据，或在稿件的写作中没有参与。

补充材料

表四：差异表达基因。(补充材料)

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