miR-103在脓毒症和非感染性SIRS中的诊断价值及其通过靶向TLR4在脂多糖诱导的炎症反应中的调节作用

抽象的

背景．败血症是一种危及生命的疾病，是由感染引起的全身炎症反应综合征(SIRS)。本研究旨在研究microRNA-103 (miR-103)在脓毒症患者中的表达，评估其诊断价值，并探讨miR-103对脂多糖诱导的单核细胞炎症的调控作用。方法．实时荧光定量PCR检测miR-103的表达。绘制接收者工作特征曲线以评估miR-103的诊断价值。ELISA检测血清和细胞上清中促炎细胞因子水平。miR-103与toll样受体4 (TLR4)之间的相互作用通过荧光素酶报告试验进行分析。在lps处理的单核细胞中检测miR-103对炎症的影响。结果．与健康对照组相比，miR-103在非传染性SIRS和脓毒症患者血清中表达降低，且在脓毒症患者中表达最低(全部) )．血清miR-103水平在区分脓毒症患者与SIRS患者和健康对照组方面具有相当的诊断准确性。miR-103与脓毒症患者的炎症反应呈负相关。在单核细胞中，TLR4被证明是miR-103的直接靶点，并受到miR-103的负调控。单核细胞中LPS促进的炎症反应被miR-103过表达所逆转。结论．所有的数据表明，降低血清中脓毒症患者的miR-103用作一个有前途的非侵入性诊断的生物标志物，并且可以在脓毒症的发病机制通过经由靶向TLR4调节炎症反应有关。

1.介绍

脓毒症是一种由感染引起的全身炎症反应综合征(SIRS) [1］.它被认为是一种由宿主对感染的异常反应引起的危及生命的疾病，是重症监护病房(icu)中死亡的主要原因[2］.统计显示，在美国，由于败血症，约有25万人在icu中死亡[3.］.败血症的发病率在老年人越来越多，而约60％的败血症ICU中患者年龄大于65岁[4］.目前，脓毒症诊断的金标准是血液微生物培养分析，但该方法比其他分子生物标志物如降钙素原(PCT)、c反应蛋白(CRP)等获得检查结果花费的时间更长[5］.然而，这些常用分子在区分败血症和非感染性疾病方面缺乏特异性[6］.因此，具有高灵敏度和特异性的生物标记新颖是必要的败血症的早期诊断。

MicroRNAs (miRNAs)是一组小的非编码rna，在转录后水平的基因表达中起着关键的调节作用[7］.大量的研究为mirna参与细胞过程的调控提供了证据，并在各种疾病中作为有前景的诊断和预后生物标志物[8，9］.从血清或血浆样本中稳定检测mirna的特性使mirna成为一种良好的诊断工具[10］.在脓毒症患者中，一些mirna已被确定为候选诊断生物标志物，如miR-155-5p和miR-133a-3p [11］.toll样受体(TLRs)已被报道在败血症中起重要作用[12］.TLR4是脓毒症中被广泛研究的一种TLRs，是先天免疫系统和脓毒症发生发展中的关键分子[13］.一些潜在的治疗方法已经通过抑制TLR4信号被证实用于脓毒症的治疗[14］.在这项研究中，我们发现的miR-103的互补序列在3 -翻译区(3 -TLR4 UTR)。以往的研究已经证明，miR-103对某些人类疾病(如阿尔茨海默病)的炎症反应具有调节作用[15]及动脉粥样硬化[16］.附注，黄等人的一项研究。研究使用单核细胞的新生儿在新生儿败血症的miRNA表达谱，这是关键的白细胞该链接先天至适应性免疫，并发现了miR-103在LPS处理的细胞[下降17］.以往的研究结果提醒我们，miR-103可能也参与了脓毒症的发生发展。

为了提高对脓毒症的诊断和治疗水平，本研究旨在研究miR-103在脓毒症患者中的表达，评估miR-103在区分脓毒症患者与非传染性SIRS患者以及健康个体中的诊断潜力。此外，本研究利用lps处理的单核细胞探讨miR-103对炎症反应的影响。

2.材料和方法

2．1.患者及样本收集

共有108名脓毒症患者和89名年龄和性别匹配的非感染性SIRS患者在2014年和2017年之间血微生物培养的基础上进行的患者的诊断潍坊医学院附属医院的重症监护病房这项研究招募根据危重病急救医学胸科医师学会/美国大学[的标准结果18］.脓毒症患者病情严重程度由脓毒症相关器官衰竭评估(SOFA)评分确定[19]和急性生理和慢性健康评估(APACHE) II评分[20.]。此外，本研究纳入68名健康志愿者作为健康对照组，健康人群与脓毒症和SIRS患者之间无统计学意义。首次诊断时采集受试者血液样本，离心分离血清，-80℃保存。本研究的实验方案经潍坊医学院附属医院伦理委员会批准，并获得每位受试者的书面知情同意。

２.２.收集单核细胞和LPS处理

脓毒症患者的血液标本用4.5%葡聚糖500 (1:5;将白细胞从红细胞中分离出来。如前所述，使用Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia, Biotech AB, Uppsala, Sweden)密度梯度离心分离单核细胞[21］.分离后的单核细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中37°C、5% CO的湿化培养箱中培养₂．为了模拟脓毒症的炎症反应进程，使用100 ng/mL的脂多糖(LPS;Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA)用于刺激单核细胞，诱导过度炎症反应。

２.３.细胞转染

为了调节miR-103在单核细胞中的表达，按照制造商的方案，用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)转染miR-103 mimic、miR-103 inhibitor或阴性对照(mimic NC和inhibitor NC) (GenePharma，上海，中国)(GenePharma，上海，中国)。这个实验重复了三次。

2.4。RNA提取和定量实时PCR（定量RT-PCR）

采用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从108名脓毒症患者、89名非传染性SIRS患者和68名健康对照者的单核细胞和血清样本中提取总RNA，并使用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)评估RNA的浓度和纯度。获得的RNA由PrimeScript RT试剂试剂盒(TaKaRa，志贺，日本)按照制造商的说明反转录为cDNA。使用SYBR green I Master Mix试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)和7300 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, USA)检测miR-103和TLR4 mRNA的相对表达。每个样本至少要检查三次。最后的相对表达式值使用2计算^−ΔΔCt方法并归一化为U6或GAPDH。

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

本研究通过检测血清或细胞上清中促炎细胞因子水平来反映炎症反应状态。IL-1的水平β，IL-6和TNF-α采用酶联免疫吸附测定试剂盒(Bioscience, San Diego, CA, USA)，采用酶标仪(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)读取450 nm处的光密度(OD)。本实验共进行三次。

2.6。荧光素酶报告实验

这项研究使用了miRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)来预测TLR4含有miR-103的互补序列。随后进行荧光素酶报告基因检测，验证miR-103和TLR4之间的相互作用。野生型(WT)和突变型(MUT -TLR4的utr分别在pGL3基本载体(Promega, Madison, WI)中克隆，联合载体与miR-103 mimic、miR-103 inhibitor或使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)共转染单核细胞。采用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega)检测各组荧光素酶活性，检测重复三次。

2.7。统计分析

本研究获得的数据表示为 并使用SPSS 18.0软件(SPSS Inc.， Chicago, IL)和GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad software, Inc.， USA)进行分析。组间的差异使用Student’s进行比较检验、单因素方差分析或卡方检验。采用Pearson相关系数评价指标间的相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估miR-103的诊断性能。所有的分析都至少重复了三次。与…不同 表示具有统计学意义。

3.结果

3．1.miR-103在脓毒症患者血清中的表达

根据定量RT-PCR，血清表达的miR-103进行了检查。如图所示1， miR-103在非传染性SIRS患者中的表达均降低( ）及败血症患者( ）与健康对照组相比( ）(包括 )．此外，与非传染性SIRS患者的表达结果相比，脓毒症患者中miR-103的表达较低( )．

3.2。的miR-103和败血症患者的临床病理特征的相关性研究

这项研究总结了脓毒症患者的临床病理特征，包括身体质量指数（BMI），白细胞（WBC），CRP，PCT，APACHE II评分，沙发得分。为了分析败血症发展的miR-103的潜在作用，的miR-103和败血症患者的临床数据之间的相关性进行了评估。在表格中1，我们发现miR-103的表达与脓毒症患者的WBC、CRP、PCT、APACHE II评分、SOFA评分呈负相关(均为阴性) )，而miR-103与BMI之间无显著相关性( )．

３．３．血清miR-103水平的诊断性能

鉴于miR-103在SIRS患者和脓毒症患者中的表达与健康个体相比出现了下调，我们进一步评估了miR-103的诊断潜力。如图所示2(一个)中，曲线（AUC）下面积为0.830对的miR-103 SIRS患者区分来自健康对照。在图中所示的结果2 (b)揭示的miR-103的高诊断的准确性在来自健康个体的脓毒症患者之间的区分，由0.916的AUC和灵敏度和89.8％和88.2％的特异性以0.685的截断值所证明的。此外，的miR-103的在从SIRS败血症分化的诊断性能也进行了研究。如图所示2 (c)， AUC为0.783，敏感性和特异性分别为83.3%和76.4%，临界值为0.525，说明miR-103在从非传染性SIRS患者中筛选脓毒症患者中具有诊断价值。

3．4．miR-103与脓毒症患者炎症的关系

本研究分析了miR103与脓毒症患者炎症反应的相关性。结果列于表中2提示血清miR-103水平与IL-1水平呈负相关β（ ， )，il - 6 ( ， )，和肿瘤坏死因子-α（ ， ）在败血症患者中。

3．5．lps处理单核细胞中miR-103和TLR4的表达

将收集的单核细胞用LPS处理，模拟脓毒症的发病机制。采用qRT-PCR检测LPS刺激单核细胞中miR-103和TLR4的表达。结果如图所示3(一个)和3 (b)提示在LPS处理组中TLR4的mRNA表达预期增加，而在LPS处理的单核细胞中miR-103的相对表达降低(两者均) )．miR-103的互补序列预测在3 -TLR4的UTR(图3 (c))，随后进行荧光素酶报告基因检测，以证实两者的相互作用。如图所示3 (d)，在WT组中，过表达miR-103显著抑制荧光素酶的相对活性，但miR-103的降低促进了荧光素酶的相对活性(两者都有) )．MUT组荧光素酶活性未见明显变化( )．进而通过调节单核细胞中miR-103的表达来检测miR-103对TLR4表达的调控作用。细胞转染效率结果显示，miR-103 mimic成功上调miR-103表达，miR-103 inhibitor成功下调miR-103表达(两者均下调) ，数字3 (e))．TLR4 mRNA表达结果如图所示3 (f)结果表明，在lps处理的单核细胞中，上调miR-103可抑制TLR4的表达，下调miR-103可促进TLR4的表达 )．

3.6。miR-103对lps处理单核细胞炎症反应的影响

体外处理miR-103后，进一步研究LPS处理单核细胞炎症反应的变化。如图所示4，我们观察到的增加的IL-1水平β，IL-6和TNF-α在单核细胞中，miR-103的过表达均可逆转miR-103的表达，而miR-103的敲低则加重了miR-103的表达 )．

4.讨论

mirna的失调越来越受到人们的关注，因为它们在各种人类疾病的发病机制中发挥着关键作用，包括炎症性疾病，如SIRS [22］.脓毒症被认为是一种由感染引起的SIRS，了解SIRS和脓毒症的免疫病理学对开发新的诊断和治疗方法非常重要[23］.目前，在败血症中已经发现了一些异常表达的mirna。例如，脓毒症患者外周血单个核细胞中miR-23b表达降低与炎症反应呈负相关，可缓解lps刺激的炎症细胞因子[24］.miR-21在脓毒症患者中表达降低，显示出很好的预测脓毒症风险的价值，因此被确定为脓毒症发展和进展的候选生物标志物[25］.在ICU收集的患者中，低水平的血清miR-143被认为是预测脓毒症发病和疾病严重程度的指标[26］.这些先前的研究结果表明mirna的失调在脓毒症的发病机制中起着关键作用。

Huang等的一项研究报道了miR-103在新生儿败血症中的失调，miR-103在LPS处理的新生儿单核细胞中表达降低[17］.在这项研究中，我们首先研究的miR-103的表达在成人败血症，发现的miR-103的血清表达在非感染性SIRS，并与健康人相比，脓毒症患者下降，而较低的miR-103水平在脓毒症证明比非感染性SIRS。此外，的miR-103和临床特征，包括WBC，CRP，PCT，APACHE II评分，SOFA评分之间的显著的关联，是在败血症患者中发现，暗示了miR-103可能在发生和发展参与败血症。

miRNAs可以很容易地从血清和血浆样本中检测到，使它们成为一组很好的诊断各种疾病的工具[27］.Guo等人提供了血清miR-495降低作为从健康人群中筛选脓毒症患者的诊断生物标志物的证据[28］.Lan等报道血清miR-155-5p和miR-133a-3p水平在脓毒症中升高，并与疾病严重程度相关，可作为诊断脓毒症的候选生物标志物[11］.在脓毒症患者中miR-146a表达下调被确定为区分脓毒症患者与非脓毒症- sirs患者的诊断标志物[6］.考虑到与非感染性SIRS患者和健康志愿者相比，败血症患者中miR-103的表达最低，我们进一步评估了miR-103的诊断潜力。ROC分析数据表明，miR-103表达降低在从健康个体分化脓毒症和非传染性SIRS方面具有相对较高的诊断准确性。值得注意的是，miR-103的低表达对于区分脓毒症患者与非传染性SIRS患者也具有相当的诊断价值。由于败血症是一种危及生命的疾病，早期诊断，特别是从非败血症- sirs中筛查败血症，对于及时治疗非常重要。我们的结果为miR-103作为从SIRS患者中筛选脓毒症病例的候选生物标志物提供了证据。

既往研究表明，miR-103在炎症反应中发挥着重要的调节作用，如miR-103对肥胖和代谢综合征相关疾病的炎症的抑制作用[29]、慢性阻塞性肺疾病[30.]，和阿尔茨海默氏病[15］.在本研究中，我们发现血清miR-103与脓毒症患者的炎症因子水平呈负相关。此外，过表达miR-103可抑制lps诱导的单核细胞炎症反应。这些结果提示miR-103可能通过改善病理性炎症而成为脓毒症的潜在治疗靶点。TLR4是被广泛研究的TLRs之一，是脓毒症炎症反应调控的关键分子[13］.3. -TLR4的UTR含有miR-103的互补序列，我们证明miR-103可以直接与3结合 -TLR4的UTR和单核细胞中负调节TLR4 mRNA的表达。TLR4脓毒症与我们的研究结果相结合的重要作用，使我们推断出的miR-103可能通过抑制针对TLR4脓毒症的炎症反应。

总之，本研究证明血清中miR-103的降低可以作为从非传染性SIRS患者和健康人群中筛选脓毒症患者的候选诊断标志物。miR-103过表达可能是一个有希望的治疗靶点，通过TLR4信号减弱炎症反应。虽然本研究为脓毒症的诊断和治疗提供了新的见解，但血清miR-103的临床意义以及miR-103在脓毒症中的功能作用还需要进一步的研究来证实。

数据可用性

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文中。

伦理批准

本研究的实验方案经潍坊医学院附属医院伦理委员会批准，并获得每位受试者的书面知情同意。

的利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

MY和MS设计了本研究，进行了临床研究，并撰写了手稿。LZ进行了细胞实验并分析了细胞数据。

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