微rna和假定的目标发现菊花多倍体育种

文摘

小分子核糖核酸(microrna),大约22个核苷酸(nt)的长度,是内源性的类和非编码RNA分子,在植物发展起着必不可少的作用,通过抑制靶基因的转录在转录水平或抑制翻译在转录后的水平。理解microrna的角色和他们的目标基因在菊花多倍体育种、杂交后三sRNA图书馆的正常和异常的胚胎被RNA-Seq执行。结果,共有170个microrna被确定有41特殊microrna在横的父亲的染色体加倍,如miR169b miR440, miR528-5p。miR164c和miR159a高度表达正常胚胎在授粉后18天,表明胚胎发育后期的监管作用。miR172c才发现在正常胚胎在授粉后18天,这意味着miR172c主要介导基因表达在胚胎发展和这些基因可能促进胚胎的成熟。等其他microrna miR414、miR2661 miR5021,可以调节生长素响应基因参与途径和能量代谢;然后他们一起调节胚胎发育的复杂。

1。介绍

在植物中,小分子核糖核酸(microrna)是一个主要的类的小非编码rna (srna) - nt。srna已确定控制植物通过调节基因表达的发育过程(1]。他们有可能调节基因通过两种方式:(1)转录后的基因沉默(发现)绑定到3翻译区(UTR)的信使rna (mrna)和抑制目标mrna的翻译;(2)转录基因沉默(TGS)通过表观遗传修饰2,3]。发现是主要策略microrna用来调节基因的表达在植物的发展。植物生成成熟的microrna microrna的前体,由核糖核酸酶处理DICER-LIKE1,负调节特定目标mrna (2]。

大量的研究调查了关键的监管角色的microrna在各种植物的生长和发育过程,包括胚胎发育的规定(4,5]。植物胚胎发展包括两个阶段,胚胎形态发生和种子成熟。在模型中植物拟南芥,胚胎模式形成主要关注和研究5]。基于胚胎的形状,细胞分裂经过几个阶段从preglobular到成熟胚,严格监管由多个基因(6]。作为类的小监管RNA, microrna在植物胚胎发育的功能大大近日报道(7]。28645成熟的microrna已经发现并存入公共microrna的数据库miRBase(21日发布,http://www.mirbase.org/)和数百个microrna的目标在植物胚胎。大量的拟南芥基因突变体的microrna的生源论揭示了microrna的关键角色在种子形态发生和成熟。Willmann等人报道早期胚胎的时机成熟拟南芥突变的等位基因DCL1(DICER-LIKE1)microrna的生物起源和证明了负监管职责所需的特定microrna在早期胚胎发生,后来在胚胎发育和种子成熟过程,microrna是关键监管机构计划(8]。

胚胎microrna调解植物胚胎发展通过调节转录因子位于特殊的空间组织和其他关键发展监管机构(5]。在植物、miR165/166 microrna的特征是一个最好的家庭,负责监管五类三世homeodomain亮氨酸拉链基因(HD-ZIP iii级)(的PHB,PHV,牧师,中央社,ATHB8)[9,10]。HD-Zip III基因家族调节顶端胚胎模式和器官极性以及控制射击和根顶端分生组织(山姆和RAM)形成胚胎发生(11- - - - - -13]。家族miR160 / miR167调节生长素反应因素的目标mrna (arf)与生长素内稳态14,15]。生长素反应是一个重要的信号通路在胚胎模式形成,胚胎发展,种子成熟(16]。

菊花(菊花)是一个在经济上重要的世界各地的花,菊花的增加消费,育种者被迫提高品种的特征,如颜色、大小、形状和公差17]。人工远缘杂交是一种最有效的方法来改善和创造新的品种。然而,胚胎流产一般发生在杂交(18,19]。尽管先前的研究分析许多不同的原因导致植物胚胎流产,包括母体基因型(20.),父母倍性(21,22),和基因调控6,23),调节胚胎发育的分子机制了解甚少。张等人发现的基因、蛋白质和microrna的菊花胚胎发展阶段的变化(19,24),提供了大量的信息菊花杂交育种的胚胎流产。证据支持一个主要角色在克服菊花胚胎染色体加倍堕胎已经获得一些研究[22,25),但microrna的功能在很大程度上仍无特征。

下一代测序(上天)方法已经被用来确定个人microrna在不同样本,和生物信息学分析提供技术支持来预测microrna的目标(26]。在目前的研究中,我们三个小核糖核酸测序从菊花胚胎库的十字架其总黄酮“Yuhualuoying”×四倍体c . nankingense和确认的关键microrna和目标可能促进父亲的染色体加倍的胚胎发展的交叉。

2。材料和方法

2.1。植物材料和人工杂交

人工杂交是交叉进行其总黄酮“Yuhualuoying”(♀, 2 n = 6 x = 54)×四倍体c . nankingense(♂,2 n = 4 x = 36)。这里,秋水仙碱生成的男性是一个同源多倍体二倍体的两倍c . nankingense(2 n = 2 x = 18) (19]。授粉后,三个样本收集,对应于正常的胚胎在授粉后12天(DAP) (NE12),在18 DAP (NE18)正常胚胎,胚胎异常18岁DAP (AE18)。对于每一个样本,我们收集了0.2 g独立生物复制验证和混合其他RNA-Seq一式三份样品(~ 0.5 g)。所有的样品都是立即在液态氮冷冻和储存在−80°C。

2.2。RNA提取,小RNA图书馆准备,Illumina公司测序

总RNA提取试剂盒试剂(豆类生物公司,首先,日本)根据制造商的协议。小分子rna与18 - 30元片段纯度15%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。净化后,他们的结扎5和3适配器和反转录成cDNA一(rt - pcr)。三个小RNA图书馆建造和使用Illumina公司测序HiSeq™2000年北京基因组研究所(BGI)(深圳、广东,中国)。

2.3。守恒和新颖的microrna的预测

首先,数据清洗分析是由摆脱低质读取,读取与5底漆污染物和多聚腺苷酸,读起来没有3底漆和插入标签和读取短于18元。小RNA和microrna的标签,rRNA,核内小RNA, snoRNA, tRNA被调整基因库(注释http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和Rfam数据库(http://rfam.xfam.org/使用所有清洁读取18 ~ 30元。每种的数量和比例srna计算三个库。然后,确定microrna在菊花胚胎,miRBase 19.0 (http://www.mirbase.org/)是用于搜索BlantN守恒的microrna。只有90%的匹配序列被认为是守恒的microrna。允许小分子rna的明确的映射注释,优先规则之后:核糖体rna(基因库> Rfam) >已知的microrna >重复>外显子>基因内区。最后,小说microrna预测使用Mireap软件(https://sourceforge.net/projects/mireap/);在这里,菊花胚胎转录组库获得与本研究相同的样本(NCBI加入PRJNA315793)被用来作为参考数据库。菊花的胚胎,总共99119 unigenes组装平均长度550 - 580元,在本研究被用于预测。

2.4。microrna的目标预测和功能注释

已知的microrna的潜在靶基因预测由web工具psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/与参数由艾伦et al。(建议)27]。菊花胚胎中目标基因转录组数据集(22),这些潜在目标基因的功能注释使用两个蛋白质数据库中,基因本体论(去)(http://geneontology.org/)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG) (http://www.genome.jp/kegg/)。

2.5。微分已知microrna的表达及其目标

找出差异表达microrna在三个样本,我们在三个样品和规范化的microrna的表达获得成绩单每百万(TPM)的表达。规范化表达=实际microrna的数/总菌数的清洁1000000。如果microrna的数是零,这是修改后的0.01进行分析的微分表达式。叠化的日志₂(样本1 / 2)值的归一化计算计算来确定重要的表达变化。最后,那些microrna与叠化> 1值< 0.05被认为是两个样本中差异表达。热图是一个可视化工具反映微分microrna的表达。在目前的研究中,OmicShare工具,一个免费的在线数据分析平台(http://www.omicshare.com/tools),是策划。基于转录组库,我们搜查了这些目标基因的表达模式受microrna表达的差异。

2.6。实时定量PCR(存在)的验证microrna和目标基因

我们随机选择12 microrna和9目标基因验证中存在的可靠性sRNA测序。RNA样本用于测序反向转录使用PrimeScript microrna qPCR starter kit版本2.0(豆类生物,大连,中国)。执行中存在使用SYBR预混料交货Taq工具包(豆类,大连,中国),和描述的PCR扩增是Zhang et al。24]。三个生物复制为每个样本,进行计算和相对表达水平的2^−△△CT方法。菊花基因EF1α(延长因子1)(基因库加入KF305681)作为参考,这是在菊花中表达的稳定19]。使用PRIMER3版本2.3.4特殊引物设计。所有的引物见表S1。

3所示。结果

3.1。测序分析sRNA

探索microrna在菊花胚胎发展的规定当父亲的染色体被翻了一倍,三个小rna的互补脱氧核糖核酸数据库,名为NE12, NE18, AE18。所有清洁读取通过过滤低质量的序列,适配器序列,和多聚腺苷酸序列短于18元,共导致超过99.79%的原始读取。这些小RNA标签映射到基因组时,约有20%的读取每个样本匹配。唯一srna匹配基因组的三个图书馆3864037年,3780667年和3734164年,占9.62%,10.04%,10.29%的独特srna(表1)。

当这些独特的srna基因库和miRBase对齐,许多类型的srna,包括microrna的核糖体rna,核内小rna, snoRNA, tRNA,但绝大多数未经序列。不同类型的的长度srna不符;因为在菊花胚胎,最丰富的类sRNA显示24元的长度(显性核),然后21 nt(主要是microrna), 22元(图1)。在目前的研究中,独特的microrna在每个库为后续分析,考虑和microrna的比例为0.26%,0.24%,和0.26% NE12库,NE18和AE18(表1)。

3.2。microrna基因和目标确定在三个库

在所有样本中,共有170个交谈microrna miRBase被确定,到130年,131年和132年microrna在NE12表示,NE18和AE18分别。100 microrna(占58.8%)被发现在三个样品;然而,一些是在两个不同的样品,如10 microrna NE12 NE18, 7 microrna NE18 AE18,和6 microrna NE12 AE18。维恩图(图2)守恒的microrna的数量分布在菊花胚胎。

表达水平是一个重要的特性来解释microrna的监管功能,它们在不同的样本通常差异很大。在这里,170 microrna的表达序列分析和规范化。最丰富的microrna在三个样本miR156a miR157a,和miR166a,表达超过一千(表S2)。然而,一些microrna高表达在一个特定的示例中,如miR398b-5p的表达,是3524年AE18但无论是在NE12还是NE18, miR5721只NE18表达,只在NE12 miR5662。

研究生物功能的microrna的菊花胚胎发展,目标信使rna序列的注意。总共有770个目标基因识别和规定88年microrna(51.76%的microrna),和miRNA414最目标(347 unigenes),紧随其后的是miR5293(61目标)和miR5021(44目标)(表S3)。34个目标由两个microrna基因调控,如CL1999。Contig2再次遭到miR165a miR166a;unigene10412 miR156a和miR157a(表的目标S3)。

3.3。目标基因的功能注释

基因本体论(去)是一个标准化的分类系统的基因用于描述在生物基因和基因产物的特点。结果表明,517年目标基因基因本体分为三个类别:生物过程、细胞组件和分子功能(图3)。40的功能类别,每个样本中基因的数量是不同的,但在大多数的类别,NE12最多,但至少在AE18。在第三本体的分子功能,有些目标基因表达在一个特定的示例中,如“电子载体活动”相关的基因只在NE12表示,两个基因的表达的一类“酶调节活动”NE18,但是没有基因调控“分子传感器活动”在NE18(图3)。

理解目标基因的生物学功能,KEGG分析,同去,也用于分析候选目标。在NE12,共有337个目标基因的生物功能207 KEGG通路,但有更少的目标基因和通路NE18 AE18。211年与118年目标基因通路NE18和179年注释注释与113年AE18通路(表目标基因S4)。有些目标基因注释在数十只在NE12图书馆的途径,包括一些能量代谢途径,如ko00280(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸退化),ko00310(赖氨酸退化),和ko00410 (beta-alanine代谢)。

3.4。差异表达microrna在菊花胚胎

本研究的目的是分析不同的microrna可能参与菊花胚胎发展,所以我们认为112后差异表达microrna至少1.5倍标准表达式。热图显示这些microrna的表达模式(图4)。他们聚集在三组根据表达的趋势。组NE18 / AE18,调节microrna表达下调几乎是一样的,和类似的数量分布发生在NE12 / NE18。然而,不同的是在NE12 / AE18,只有1/3的microrna在调节在AE18 NE12,意味着更多的消极的基因。

3.5。菊花目标基因在胚胎发展的特点

microrna调节植物发展中介目标基因的表达。除了这些冗余由几个microrna,共有770个目标基因被菊花转录组数据集识别和注释。表的表达水平和注释S5。他们中的大多数是由一个microrna的,有些是消极的microrna监管,如转录因子MYB11 Unigene2183 NE12中高度表达,但目标miR858b表达水平最低。另一个转录因子WRKY48 (Unigene25838)表示在AE18最高和最低NE12,显示负监管由miR414(图5、表S2和S5)。几个目标是由两个microrna,没有样本中差异表达的水平。例如,unigene21756 miR5215的目标和miR5373及其FPKM附近的三个样品,没有负监管这两个microrna。

为了研究目标基因调节胚胎发展,一些目标差异表达基因(FPKM > 1.5)的褶皱选择根据他们的Nr / Nt注释,这可能是参与菊花胚胎发展(表2)。他们包含一些转录因子,能量代谢和蛋白质合成相关的基因,和一些无特征的蛋白质。转录因子的表达是不同的;WRKY和南汽在AE18最高,但MYB最低。一些与生长素和ATP合成相关的基因的表达下调AE18(表2和图5)。

3.6。验证中存在

存在是一种有效和准确的方法检查RNA-Seq的结果。在目前的研究中,总共有12个microrna双测试中存在,表明高兼容性的两种方法(图之间的表达模式6)。七人AE18最高的表达,如miR169b miR159a, miR858b。miR167c-3p在NE18验证表达最高的两个方法。miR414监管最目标基因与不同的表达水平在NE12(图表达占优势6)。

4所示。讨论

4.1。确定microrna在菊花胚胎

microrna能调节植物胚胎发育,研究了重要的和多样化的角色在不同的物种;然而,microrna的特定功能仍无特征stage-specific胚胎(5]。下一代测序更易于识别的microrna家庭从不同植物器官或治疗。在松果体taeda(15),芸苔属植物显著(28),microrna从受精卵的胚胎在发育后期阶段被确定。越来越多的研究人员提供了丰富的证据,microrna所需大部分胚胎细胞分化和发展拟南芥(29日,30.]。在菊花杂交育种,胚胎发育种子形成的关键阶段,但在菊花远缘杂交胚胎流产是普遍31日,32]。先前的研究探讨这一障碍的细胞结构、基因表达和microrna的监管19,24),227个microrna在从交叉混合胚胎其总黄酮和二倍体c . nankingense。因为染色体加倍的重要性在杂交育种,在目前的研究中,我们进行了杂交利用其总黄酮和四倍体c . nankingense;179 microrna被确定在三个胚胎样品(表S2)。相比之下,两个十字架,microrna在父亲的染色体加倍后确定;结果,135年microrna同时被确定在两个十字架,44新microrna在目前的交叉,如miR169b miR440, miR528-5p,但92年microrna表达了在前面的十字没有检测到这里,如miR172a miR172b, miR391 [24]。这些异同表明,大部分的识别microrna在两个十字架在菊花调节胚胎发育的主要因素,这些表达特定的交叉可能调节发展取决于男性染色体翻了一倍。在某种程度上,它涉及染色体加倍对远缘杂交胚胎发展有影响microrna的监管。

4.2。microrna的菊花胚胎的作用

在植物胚胎,microrna能调解下游目标和规范的表达一些转录因子或其他关键发育监管机构(5]。microrna及其目标基因的超表达允许转让在胚胎发育的作用,营养,和花器官形成边界(33,34其中miR164这个),如miR159 miR165/166, miR172, miR319家庭。它其中miR164这个证明直接调节NAC域基因进行植物形态发生和胚胎正常的功能(34]。其中miR164这个在目前的研究中,没有检测到,但miR164c表示三个样品和异常胚胎(表中表达水平较高S2)。先前的研究显示的最高表达miR164c在正常胚胎在18个衣冠楚楚的男是二倍体c . nankingense(24),这表明miR164c可能重要的监管作用在胚胎发育的后期阶段,和较低的表达水平miR164c 18岁在正常胚胎DAP可能有利于菊花胚胎正常发展。类似的情况发生在miR159a;没有miR159菊花中发现胚胎,但miR159a差异表达在正常和异常胚胎在18个衣冠楚楚的,建议与胚胎发育期间miR164a菊花连接函数。

miR172显示初花期和花器官的监管功能标识缺陷通过调节AP2和脚趾(35]。miR172c是在这项研究中发现,样本的表达是零NE12 AE18,这意味着miR172c主要介导基因表达在胚胎发展和这些基因可能促进胚胎的成熟。DCL1胚胎发育的关键基因在胚胎杀伤力,这是由miR163 [36,37]。然而,没有miR163菊花中确定胚胎是否十字架有父亲的染色体加倍。这个结果展示,DCL1不受miR163,参与胚胎在菊花的杀伤力。

4.3。菊花miRNA-Mediated目标基因在胚胎

在过去十年的研究表明,microrna的至关重要的作用在植物胚胎发生通过调节多种基因和通路(38]。它包含空间分异控制的过程中,生长素反应,调节和时间控制的区别(5]。一个研究miR160防ARF17转基因显示叛逃子叶,表明miR160负调控基因参与生长素信号是至关重要的,适当的胚和子叶的发展39]。生长素反应是胚胎发育的关键生物通路,它也被报道在菊花22]。在目前的研究中,miR160被NE12和NE18 NE18中高度表达的(表S2)。目标基因预测的结果表明,miR160的目标是生长素响应因子与样品(表之间的微分表达式2)。胚胎发育后期(DAP) 18日,生长素响应因子的目标(unigene9514)基因表达下调与NE12相比。除此之外,还有部分靶基因参与能量代谢根据Nr / Nt注释,和他们的表达是异常胚胎(表表达下调2)。转录组提供能源的重要性的证据合成正常胚胎发展(22];这里,这些确定目标基因被microrna监管,如miR414 miR2661, miR5021,也支持能量代谢菊花胚胎发展的重要性。

5。结论

多倍体育种在未来将更加关注从基因组研究作为下一代测序技术飞速发展,使得前所未有的机会去探索和了解基因组或转录组变化的监管。作为一个关键的调节因子,microrna的功能吸引了大量的注意力在植物的生长和发展。在菊花远缘杂交,育种者总是面临的障碍存在于胚胎发育。目前的研究提供了一些解释关于胚胎流产和microrna与胚胎发展甚至他们的目标基因。我们建议晚期胚胎microrna,尤其是miR164a,调节NAC转录因子,从而影响胚胎发育。miR160介导生长素响应,miR414 miR2661, miR5021调节能量代谢的基因;在一起,他们调节菊花杂交胚胎发展。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

作者的贡献

Fengjiao张和赵Jingya贡献同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(31672182,31672182),江苏省自然科学基金(BK20161449),中央大学和基础研究基金(KYTZ201602)。

补充材料

补充1。表S1:引物用于验证microrna的表达和目标基因。

补充2。表S2: microrna的表达水平确定在菊花胚胎。

补充3。菊花表S3:确定目标基因在胚胎。

补充4。表S4: KEGG目标基因的注释。

补充5。表S5:所有目标基因的注释。

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