的证据在鱼野生种群基因表达分析的复杂性

文摘

目前的工作检查的感应带3离子运输蛋白质,增殖蛋白激酶,乳酸脱氢酶分别与osmolyte运输、细胞体积的规定,和能源生产两腮的罗非鱼菌株接触淡水或咸水环境水。总的来说,基因菌株之间显示出类似的表达模式。然而,野生种群调查一系列自然栖息地和盐度并没有透露预期的模式。虽然重要,但基因表达之间的相关性和盐度略模棱两可的,不显示任何与生活史性状的表型差异之前报道之间相同的数量。与人口相关的微分表达式也没有遗传结构推断从中性标记。观察到的结果表明微分表达式不是进化力量的结果,如遗传漂变或适应自然选择。相反,它可以推测基因对各种非生物和生物因素,包括动物的内在因素。这项研究提供了明确的证据的复杂性在野生种群和基因表达分析表明,需要更多的关注在选择候选人作为潜在生物标志物监测适应性反应到特定的环境扰动。

1。介绍

自然变化的环境因素如温度、盐度、pH值和溶解氧浓度,和自然栖息地的人为改变环境压力对水生生态系统产生深远的和多样化的影响(1,2]。气候变化可以导致物理化学变化的因素包括盐度、温度、溶解氧水平,和水的质量(3]。而盐度已被确定为一个关键环境因素可能对水生物种的生理影响,温度、溶氧,水质也在重大环境约束,可能会广泛影响鱼类生长和繁殖等生物功能(4- - - - - -6]。这些物理化学因素的变化可以为许多动物包括鱼类和压力可能会诱发自适应应激反应(7,8]。生物适应环境变化的自然环境中通过固定蛋白质编码DNA序列的变化,改变蛋白质的功能和提高个人健康和/或通过表观遗传变化影响基因表达(9- - - - - -12]。

突然的变化环境条件需要快速和特定的反应与适应反应相关的先前存在的分子途径。与其他脊椎动物相比,鱼类的特点是非常塑料表型反应变化的环境条件,这是反映基因表达的激烈和快速变化的外部刺激。因此,有人可能认为基因表达模式的变化方向相同的环境因子,诱导他们。短期的生理适应了变化在细胞水平上,其中包括通路的激活和候选基因的诱导适应环境压力。基因表达的调制,因此,在第一压力反应可用于鱼类面临环境条件的变化。因此,相关基因的表达和调控个人健身已经广泛用于调查野生种群的适应当地环境条件(13]。

实验研究通常使用花园里常见的实验来评估基因表达的作用在一个生物的应对环境的变化。这样的实验有帮助为了区分环境影响和种群之间的基因对表型变异的影响。他们已经成功地用于一系列的分类单元,包括鱼类(38-40)。当进行后代从一个人口具有相同遗传背景,花园里常见的实验也可以用来揭示这一套环境因素之一是负责个人间变异在给定的表型特征的人口(14]。这是通过改变一个环境参数,同时保持其他的常数。

环境参数的严格控制在花园里常见的实验与研究的一个主要差异在物种的原生环境,生物和非生物因素是无法控制的。比较和野生种群的进化研究经常进行跨环境cline,如温度和盐度梯度(15- - - - - -18]。这意味着至少有一个环境因素是最限制物种的研究区域,胜过了其他因素。然而,尽管这一优势,还有许多其他生物或非生物参数的变化,然而轻微,可能直接或间接影响特定基因的表达。这些变量的影响可能会干扰的主要因素取决于所涉及的基因分析一个或多个生物学途径和环境压力的反应程度。

渗透调节的研究取得了大量的细胞和分子信息修改与盐度时空变化(19- - - - - -22]。大多数这些研究都聚焦于水,ion-transporting蛋白(23- - - - - -26),和这些离子泵的渗透调节的角色现在很好理解在细胞和分子水平。适应盐度时空变化取决于调整生理盐水的鳃上皮分泌的能力或吸收,根据环境盐度(23,26]。然而,离子浓度的规定不是鱼面临的唯一挑战。他们也面对盐度变化引起的细胞体积的变化。不幸的是,细胞体积调节的机制仍知之甚少。

black-chinned罗非鱼,Sarotherodon melanotheron是广盐性的硬骨鱼广泛分布在西非水生生态系统,在那里经常接触到广泛的盐度值。沿海水域的海洋和淡水中的物种栖息地,那里全年盐度是常数(27]。也代表河口,比如Saloum河口在塞内加尔,在盐度表现出极端的变化,从新鲜到非常高(高达130事业单位),以及季节性的盐度变化可以相当大28,29日]。盐度的存在cline跨物种的分布范围提供了一个绝佳的机会为研究基因表达对盐度变化的反应。

本研究的目的是评估盐度之间的关系在三种蛋白质和基因表达模式,即带3离子运输蛋白质(SLC4A1),增殖蛋白激酶(MAPK),乳酸脱氢酶(LDH),相对于osmolyte运输、细胞体积的规定,和能源生产,分别在个人black-chinned罗非鱼适应不同的盐度。根据他们的功能,这些基因可能扮演重要角色美国melanotheron适应盐度变化。SLC4A1是运输蛋白促进氯离子的可逆的碳酸氢盐离子交换(30.]。这个阴离子交换剂的主要因素是补偿机制的细胞肿胀,因为它促进osmolytes的流出,包括氯化钾和氨基酸(31日,32),一种机制,在pH值和细胞体积监管至关重要。MAPKs蛋白激酶,应对一些细胞外信号和参与各种细胞活动,例如基因表达的调节,有丝分裂,分化,细胞生存/凋亡[33,34]。MAPKs参与细胞外信号的放大和集成,因此,在鱼的适应盐度非常重要。LDH是糖酵解的关键酶参与厌氧能源生产和可逆的丙酮酸和NADH转化为乳酸和河畔⁺分别为(35]。这种酶被发现在一些器官包括心脏,肾脏,肝脏,肌肉,以及在较小程度上,腮,在葡萄糖稳态中起着重要的作用。

分析了三种基因的研究最初确定使用抑制差减杂交(SSH)美国melanotheron适应不同矿化度(0和70年事业单位)在实验室控制条件下(36]。他们被选为当前研究因为他们没有客房服务或引用的基因,也就是说,各种各样的组织或细胞中基因表达没有或最小变异个体间基因表达的模式。他们选择模式的基础上表达应对环境盐度在实验条件相关的个体应对环境变化的能力。因此,转录反应可能反映了盐度差异在自然环境中这个参数是主要的压力源。

我们之前发表的作品进行相同的人口使用基因编码离子泵和渠道(Na / K-ATPase,压敏电阻器阴离子通道)37,38),基因编码一般应激蛋白质如HSP70 (37(相同的SSH库),垂体激素(生长激素、催乳素)29日]。有明确的这些基因的信使rna表达水平之间的关系和环境盐度、可以用这一事实来解释这些基因扮演主要角色的反应渗透压力。本研究,我们试图测试其他基因(来自相同的SSH库而不是分析第一个发表报告)的参与渗透调节的流程还没有或描述。我们选择的基因可能参与渗透调节,因为他们参与这个函数相关生理过程如osmolyte交通、能源生产和细胞体积和监管是普遍接受的信号。很可能这些生理过程中被激活适应性反应生物或非生物环境盐度以外的压力。尽管水盐度是最约束的非生物因素美国melanotheron在我们的研究领域,基因表达可能是受生物因素包括内在因素动物和野生种群的影响难以评估。

相对的这些基因的表达水平在鱼类的鳃首次在实验条件下的个体进行比较美国melanotheron养殖的源于两种不同的菌株在高盐度水和海水,收集。然后我调查的假设相对基因表达野生种群适应盐度范围从0到100年事业单位与盐度。组新基因进行了分析同时收集样品,而不是那些用于我们先前发表的研究。这项研究的主要优势比以前作品的比较转录反应条件和菌株之间,其次是野生种群的调查一系列自然栖息地和盐度,构成一个很好的方法来选择候选人作为潜在生物标志物监测适应性反应到特定的环境扰动。实验和野生种群的结合还提供了允许的优势更好的理解基因表达的作用在鱼类适应极端盐度和也可以突出自然环境中基因表达分析的复杂性。

2。方法

2.1。在控制条件下的实验

原black-chinned罗非鱼的养殖(美国melanotheron博士)青少年用于本研究收集的Abdou Mbow(如果)在雨季Kaolack(站点4 c图1)的上游Saloum河口在塞内加尔,盐度的48个事业单位。他们都被转移到CIRAD设施(蒙彼利埃)近15年前。鱼类在联合运输合作项目如果和CIRAD研究机构之间,没有鱼运输到法国需要许可证。从那时起,从相同的初始养殖鱼类已经使用在许多科学出版物(36- - - - - -39]。他们分成两组60个人,保持在30 L淡水水族馆被转移到海水前三天。每个水族馆配备恒温器保持恒定的水温(表25°C1)。水族馆是配备了一个机械/生物过滤系统和airstones确保最优氧饱和度。鱼与商业加工鱼饲料喂食含有40%粗蛋白质分布的每周训练六天。后一个星期的适应时期海水,一半的鱼的盐度增加高盐度条件举行(70年事业单位),而另一半,是减少淡水条件。海水盐度变化是由慢慢排空,代之以淡水或咸水环境水。商业海洋盐(即时海洋®盐)用于使海水和超咸水包含的所有组件的天然海水和最初溶解在一桶的水一样使用的淡水水族馆之前被添加到一个特定的水族馆。45天后,鱼在淡水和咸水环境水麻醉与二苯氧乙醇(1.5毫升/ L的水),重,被斩首。鳃组织收集,立即在液态氮冷冻,储存在−80°C到处理。同样的步骤之后的另一个black-chinned罗非鱼应变,收集海水(塞内加尔Joal)。第二个实验是进行验证第一个实验的结果。 The genes that are differentially expressed in both strains as a result of salinity variations are most likely to be real candidates for salinity adaptation. The experimental conditions were identical to those described for the first experiment, except that the time of the year when the experiment was conducted, the size and type of the tanks, the type of food, and the developmental stage differed from those of the first experiment. In the second experiment, gill tissues were collected after an exposure period of only 10 days to freshwater and hypersaline water. This experiment was specially designed to identify genes involved in the long-term survival of fish exposed to specific salinity conditions. Such routinely expressed genes can be expected to be the target of adaptive selection in wild populations that are subjected to long-term natural acclimatisation. For this reason, samples were collected after an exposure period of 45 or 10 days to different conditions because at these times, fish can be considered already acclimatised to extreme salinities [40,41]。

2.2。抽样设计的自然种群

六个自然种群(图1)Sarotherodon melanotheron在2006年被采样的旱季(可能),当盐度Saloum河口最大水平,稳定了几个月。的两个抽样地点(圭尔湖(网站1)和损害湾(3)]有相对稳定的盐度,而其他网站(Saloum河口的三个位置,即Missirah (4) Foundiougne (4 b)和Kaolack (4 c),和一个位置在冈比亚河口,Balingho(2)展览大空间和季节性盐度的变化。鱼抽样是由当地渔民用撒网。只有五个鱼从每个采样鱼网抛出,以限制鱼压力和预防处理产生的变化。鉴于基因表达可能受到不同的发育或性阶段,只有大小类之间的120和160毫米叉长度与性阶段1或2 (42相应的不成熟的个体进行分析(表2)。收集所有个人在同一时间在同一采样活动和处理样品完全相同,避免抽样文物。鳃是立即从这些个人和捕获存储在RNAlater在4°C (Ambion) 24小时然后−20°C到处理。

2.3。道德的声明

本研究没有伦理批准所需。本研究中使用的样本收集按照良好的动物实践中由法国研究所开发的海洋(i)在培训课程如何处理鱼在实验条件下,促进他们的福利。i不批准或给出一个许可证的研究野生种群的鱼只提供一个行为准则遵循实验中鱼的痛苦降到最低。研究另一个学术道德委员会批准(许可证或批准ID)没有必要因为所有程序进行black-chinned罗非鱼在这项研究符合i建议。没有特定的权限所需收集的样本Saloum河口(Kaolack、Foundiougne Missirah位置),圭尔湖,损害湾。这些生态系统正在经历重要的环境和人为扰动。塞内加尔当局鼓励科学家进行科学项目的后果在这些领域更好地理解这些环境和人为限制生活历史特征的生物居住在这些地区包括鱼类。鼓励他们去调查这些领域,政府免费给科学家来执行他们的研究没有任何之前的行政许可。抽样的许可Balingho位置在冈比亚河口是冈比亚的口头渔业部门。没有官方冈比亚的渔业部门的书面文件是必需的。 Likewise, approval for working on the tilapia美国melanotheron在研究区域是不需要任何动物伦理委员会因为这个物种不是一个濒临灭绝的物种。相反,它是最适应环境和人为塞内加尔和冈比亚河口的变化,科学家们相信当局使用它作为生物和生态模型的研究。

2.4。环境数据收集

对于每个采样位置,盐度(事业单位)和温度(°C)原位测量的时间和地方鱼采样与折射计(ATAGO)和一个温度计,分别(表2)。Saloum和冈比亚的河口,额外的盐度、温度和溶解氧IRD实验鱼采样得到的数据研究小组你070 -说唱(塞内加尔达喀尔)。在这些抽样考察,表面盐度测量和光学折射计和底层盐度测量YSI多参数探测,允许同时测量的盐度、水温、溶解氧。相同的探针用于氧饱和度测量表面和底部的百分比。先前的研究已经表明,之间没有显著差异底部和表面水温在这些取样位置(4,6]。因此,只有靠近水面的温度用温度计测量。额外的数据在盐度、水温、溶解氧被IRD气象站的研究小组UR098-FLAG(塞内加尔达喀尔)圭尔湖和损害湾的位置(补充表在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/1258396)。

2.5。选择候选标记

根据他们的功能,这些基因也可能扮演重要角色美国melanotheron适应盐度变化。SLC4A1是运输蛋白促进氯离子的可逆的碳酸氢盐离子交换(30.]。这个阴离子交换剂的主要因素是补偿机制的细胞肿胀,因为它促进osmolytes的流出,包括氯化钾和氨基酸(31日,32),一种机制,在pH值和细胞体积监管至关重要。MAPKs蛋白激酶,应对一些细胞外信号和参与各种细胞活动,例如基因表达的调节,有丝分裂,分化,细胞生存/凋亡[33,34]。MAPKs参与细胞外信号的放大和集成,因此,在鱼的适应盐度非常重要。LDH是糖酵解的关键酶参与厌氧能源生产和可逆的丙酮酸和NADH转化为乳酸和河畔⁺分别为(35]。这种酶被发现在一些器官包括心脏,肾脏,肝脏,肌肉,以及在较小程度上,腮,在葡萄糖稳态中起着重要的作用。

没有普遍的基因控制的盐度。因此,积极控制(渗透调节状态的指示器)如离子吸收的基因会被用来显示一个著名salinity-regulated基因模式。可以添加这样一个指标来评估盐度变化引起的应力状态的鱼和验证实验程序。例如,我们可以使用钠钾atp酶(Na⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶α膜蛋白亚基),维持细胞内稳态所需离子梯度的渗透调节的状态评估鱼在自然环境中。在这项研究中,我们不使用积极的控制基因,因为我们曾经证明了Na的信使rna表达水平⁺/ K⁺腺苷三磷酸酶α亚基在同一种群与环境盐度(43]。

2.6。信使RNA RNA提取、净化、逆转录和实时PCR分析

用试剂盒提取总RNA®试剂(美国Gibco-BRL)根据制造商的指示。RNA浓度测定spectrophotometrically, TAE 1 x和RNA完整性验证了1%琼脂糖凝胶电泳(40毫米三、醋酸和1毫米EDTA)。的相对表达SLC4A1(加入基因库ES881098数量)、MAPK (ES881524)和LDH (ES881483)分析自然和实验种群。

腺苷酸残留的真核mrna具备重复他们的3′末端,用于净化方法的聚(a)纯粹™工具(Ambion)。该方法首先在于通过总RNA的解决方法运用到一个列有polydT寡核苷酸结合位点。这些低聚糖(dT)被困在磁性粒子耦合链霉亲和素,仅保留mrna。水相含有核糖体rna和转移rna是消除,然后,mrna筛选了与先前热压处理过的超纯水。我们使用这个方法来净化信使RNA从2毫克的总RNA样本实验和野生种群。

吉尔的纯化mrna实验和野生种群retrotranscribed成cDNA使用BD PCR-Select™cDNA减法工具包(Ambion)。合成第一链cDNA、4μg mRNA的混合1μL的互补脱氧核糖核酸合成引物总量的5μ在70°C l .整个混合物加热2分钟,消除潜在的二级结构。变性后,混合物冷却立即稳定的冰。然后,2μL 5 x Fist-Strand缓冲区,1μL的核苷酸(10毫米),1μL无菌水,1μlamv逆转录酶(20 Lμ信用证μL)被添加到这个反应混合物。最后混合是在42°C的环境1 h和30分钟在ptc - 100 mt thermocycler (MJ研究Inc .)。第二个链cDNA是合成通过添加以下产品包含第一链合成反应的管:48.4μL无菌水,16岁μL 5 x两样东西缓冲区,1.6μL的核苷酸(10毫米),4μL 20 x两样东西酶鸡尾酒。总反应是孵化16°C 2 h和30分钟和2μL的T4添加30分钟结束前孵化。第二个链的合成停止通过添加4μ20 L x EDTA /糖原混合。的双链cDNA由苯酚/氯仿抽提纯化,以100%乙醇沉淀,用75%乙醇洗净,暂停到50μL nuclease-free水。

Primer3软件被用于这些基因设计引物扩增。

以下转发(F)和反向(R)引物序列用于存在放大:SLC4A1 (F: TCTGCAAAGAAGTGGCATCA;接待员:ATGACGCCAAGGTGACATTT)、LDH (F: TGATCACCTCGTAGGCACTG;接待员:AAATGTGGCTGGAGTCAACC)、MAPK (F: CTGGCCCTTCAACAGAGACTG;R: CTCTTCGATGGCCTGTTTCAC)和beta-actin (F: ACAGGTCCTTACGGATGTCG;R: CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT)。

基因表达是量化使用定量实时PCR(存在)LightCycler(罗氏分子生物医学)使用QuantiTect SYBR绿色PCR大师混合工具(试剂盒)。量化执行的每个样本总量的10μL包含1μ0.5 L的cDNA、μL每个引物和1 x SYBR绿色主人混合(试剂盒)。每个存在的反应是在重复进行的,与最初的变性步骤15分钟在95°C,紧随其后的是一个放大的目标cDNA 40周期,每个周期组成的变性为15秒95°C,退火和54°C之间55°C 15 s,并为15秒72°C伸长。确定每一对引物的存在效率、标准曲线生成使用五连环稀释(1,1/10,1/50,1/100,1/500)的一个独特的互补脱氧核糖核酸样品池的构成6 cDNA从每个盐度组或人口分析。效率(E)中存在的反应从给定的标准曲线的斜率计算方程E= 10^{(−1 /坡)}。放大产品验证通过分析扩增子的大小通过琼脂糖凝胶电泳。结果显示为相对表达的变化,正常参考基因,β肌动蛋白,使用2^−ΔΔCt方法描述Kultz [34];β肌动蛋白之前分析和显示没有回应盐度适应环境的变化。

2.7。统计分析

基因表达数据在每个站点上表示为±SEM。巴特利特(44]和Kolmogorov-Smirnov [45测试,分别用于测试数据的方差的同质性和常态。这些测试表明,表达数据不是正态分布,没有统一的方差。因此,只有应用非参数统计检验。对于每个变量,克鲁斯卡尔-沃利斯非参数方差分析(方差分析)46]揭示盐度之间的显著差异意味着执行条件和采样站点。的Mann-WhitneyU测试应用作为事后测试来评估不同盐度条件和种群之间的基因表达水平。从网站,使用个人数据之间的相关性盐度、温度和mRNA转录水平的基因是评估通过斯皮尔曼等级相关测试(43]。这些测试进行R软件(v.3.1.1)。对于所有的测试,0.05的显著性水平。

3所示。结果

3.1。环境数据

盐度测量采样地点在旱季事业单位(表范围从0到1002)。盐度的参考站点范围从0(圭尔湖,淡水)37(损害湾海水)。盐度是明显更高Saloum河口的网站,一个极端的100年事业单位Kaolack(表2)。研究区域的特点是季节性的变化环境盐度和相关水质恶化由于交替延长8个月旱季(11月至6月)和一个短暂的四个月的雨季(7月至10月)。在冈比亚和Saloum河口盐度水平这两个季节之间的变化非常显著(28,29日]。盐度增加非常明显在第一个月雨季结束后因为强烈的蒸发6]。然后就很稳定在干燥季节的结束。短暂的雨季期间,相比之下,在河口盐度非常不稳定,可以大大降低由于淡水输入来自降水,这大大改变了水质(浊度)。贫穷的水质在雨季代表一个额外的非生物因素,可以约束的数量美国melanotheron。然而,鱼分析在这项研究中收集的干季(6月)在河口盐度稳定了几个月,水浊度的最低水平。水温度(表2)网站中略有不同,从26岁到29°C。额外的环境数据表示,盐度衡量网站结合季节性Saloum河口的数据范围从咸水咸水(130事业单位)在河口的上游(补充图)。在圭尔湖,淡水条件下全年盛行而损害湾、盐度变化略37和38个事业单位(补充表之间的关系)。水温在Saloum(补充图和冈比亚河口略有变化)。平均水温为24.9和25°C在圭尔湖和损害湾(补充表)。没有一个抽样地点并达到的百分比氧饱和度值限制鱼的生存(补充图和表)。根据这些结果,可以得出结论,盐度是最制约环境因素美国melanotheron在我们的研究领域在旱季。

3.2。鳃大量SLC4A1、MAPK和LDH mRNA

实时PCR分析显示的效率值约为1.9,这意味着两个引物对每个基因(包括参考基因,β肌动蛋白)放大一个特定的产品。熔解曲线分析和琼脂糖凝胶可视化没有显示在这项研究中,但参考基因的扩增的产品以前在琼脂糖凝胶电泳验证通过分析扩增子的大小(47]。相对丰富的个人超咸水和海水压力计算修正效率的差异。结果显示显著差异在SLC4A1和MAPK表达水平之间的盐度条件(克鲁斯卡尔-沃利斯检验; )在高盐度的水压力。鱼在淡水中维护SLC4A1 mRNA水平要明显高于那些适应高盐度水(图2)。MAPK mRNA水平表现出类似的模式之间的盐度条件下,在淡水更高和更低的高水(图2)。海水压力(Joal)显示,LDH显著差异表达水平之间的淡水和咸水环境水(克鲁斯卡尔-沃利斯检验; ),但没有显著区别这两种盐度条件下个人的高盐度(Saloum应变(图)2)。不同菌株之间的比较表明,SLC4A1和MAPK表达菌株(图之间的资料具有可比性2)水平升高在超咸水淡水和低水平。相比之下,有显著差异基因表达谱LDH基因的菌株之间高位被记录在超咸水海水压力。

在野生种群,SLC4A1表达式之间的比较采样位置显示种群之间的显著差异(克鲁斯卡尔-沃利斯检验; )。现场SLC4A1 mRNA水平高3(图3(一个))比冈比亚采样站点的网站(2)和Saloum (4 4 a, b, c)河口,和他们也高于1,而后者在这个网站水平都高于另取样的位置。Saloum河口内鱼现场采样4 b, SLC4A1 mRNA水平较低的盐度是中间,比鱼样本越少盐站(4 a)和最盐水采样站点(4 c)(图3(一个))。在SLC4A1表达无显著差异被发现网站4和4摄氏度之间。MAPK信使rna的含量明显高于(克鲁斯卡尔-沃利斯检验; )在淡水、半咸水和海水在站点1、2和3,分别(图3 (b)),相比大多数盐水采样站点(4 4 a, b, c) Saloum河口。MAPK表达被发现之间的差异不显著网站1,2,3(图3 (b))。在Saloum河口,MAPK表达水平明显高于在网站1和3 2相比,但这两个地点之间没有明显差异。LDH mRNA水平最高(克鲁斯卡尔-沃利斯检验; )记录在网站3和Saloum河口(4 4 a, b, c)而最低水平观察至少盐水位置、网站(图1和23 (c))。在Saloum河口,没有显著差异在LDH表达式之间的位置。LDH的相对表达水平在Saloum河口位置没有显著不同于现场3(图3 (c))。LDH mRNA在站点2的数量高于现场1。

3.3。相关性盐度、温度和基因表达

环境盐度和SLC4A1 mRNA水平负相关(斯皮尔曼等级相关: , ),相同的关系被发现对盐度和MAPK相对表达式( , )(图4)。相比之下,LDH mRNA水平与盐度呈极显著的正相关关系, ; )(图4)。之间没有显著相关性环境温度和SLC4A1 mRNA水平( ; )、MAPK ( ; )和LDH ( ; )。

4所示。讨论

在实验室控制条件下的实验结果显示显著差异取决于鱼的盐度条件。相比之下,自然环境的微分表达式是不符合中性模型的分歧的野生种群,也不反映salinity-induced生活史特征观察群体间的差异。这些结果表明,基因表达模式不是进化的结果如遗传漂变或适应自然选择。他们认为,基因对各种环境压力,这可能发生在结合生物压力,包括动物的内在因素。虽然在两个不同的基因表达的变化,探讨菌株(海水和超咸水株)在实验室建立了15年前与上面所描述的那样,在实验条件下相同的整体基因显示出类似的表达模式。这些结果表明再现性也缺乏应变的影响。相比之下,缺乏实验室和野外条件之间的相关性可能反映实验鱼的适应实验室环境。很可能在实验室个人适应这么长时间已经进化出特殊的适应实验室条件下加上近亲繁殖的影响。

为更好的理解这里的微分表达式观察如何与罗非鱼种群环境盐度的适应,有必要对比基因表达模式与种群的遗传结构推断从中性标记。这种比较的期望是否与遗传分化相关基因表达模式;这可能表明,遗传漂变的数量出现差异。种群之间的遗传分化并不是分析在这项研究中,但是以前的工作表明,人口的美国melanotheron强烈的结构,即使在microgeographical尺度(即。在Saloum河口)[48]。这种高人口遗传结构本质上是由于低幼虫传播能力的物种,mouth-brooding生殖行为的结果。然而,基因表达的模式发现这里并不反映的遗传分化美国melanotheron人群中揭示了中性标记。例如,基因和地理位置偏远人群Saloum网站4,4 b和4 c没有显示任何SLC4A1表达水平的差异。同样,LDH表达水平无显著差异被发现网站的数量1和2之间,两个种群遗传分化。这些观察表明,在本研究中观察到的差异表达不是遗传漂变的结果。相比之下,这不能排除微分表达式反映了自然选择的影响,可以解决一些特定的适应性多态性可能增加种群的相对健康的自然环境。然而,考虑到广泛的颞Saloum盐度条件的变化和冈比亚河口,认为不同的选择可能导致固定的突变似乎不太可能。事实上,盐度Saloum和冈比亚河口增加在第一个月结束后的雨季,因为强烈的蒸发6),然后变得相当稳定在干燥季节的结束。因此,在漫长的旱季,河口展品的盐度变化较小。相比之下,在短暂的雨季,在河口盐度非常不稳定,可以大大降低由于淡水输入从降水。在这种情况下,长期适应环境条件的响应中保持相对稳定的物种的生命周期是不可能的。相比之下,不稳定的盐度在雨季可能代表一个主要驱动压力因子的选择基因型更适合调整生理反应来管理压力的后果。

因此,种群之间的基因表达差异可能源于基因可塑性盐度变化的反应。基因的表达分析这可能是不同监管直接回应盐度变化(49]。因此,这将是有趣的和多样性的表观遗传模式进行对比分析,群体间解释微分反应的基因表达环境。环境因素诱发的表型变化,称为基因表达可塑性,已报告在一些鱼类(50- - - - - -52]。这种可塑性可以适应在表型变异赋予更高的适合一个特定的个体(53,54]。以前的研究已经表明美国melanotheron在中间盐度人口方面表现出更大的健身,渗透调节的能源成本较低,在高盐度条件相比,在受损的增长和早熟繁殖观察(28,55]。然而,这里观察微分表达式模式不能反映这些差异在生活史特征盐度的变化引起的。此外,基因表达水平之间的相关性和环境盐度还有些模糊,提出环境盐度以外的因素的潜在影响。

SLC4A1基因可能是由其他因素包括人为的污染,因为这个基因是参与其他监管流程,如金属体内平衡。同样,LDH表达式可能反映了开关在用于产生所需的能量代谢途径hydromineral维护(56- - - - - -58]。事实上,LDH表达水平升高被认为在超咸水海水应变,这是符合水平升高中观察到所有的野生种群在盐度超过22个事业单位。这些结果指向更高的能源需求。虽然Saloum河口的LDH表达水平升高(网站4、4 b和4 c)可能反映了能源成本在高矿化度、渗透调节在海水中观察到的信使rna含量升高(网站3)有些难以解释。他们可能会反映出能源投资增长美国melanotheron众所周知,海水(最好的增长表现55]。同样,在海水中表达水平升高(网站3)SLC4A1有点难以解释。他们可能反映了一个这种基因参与体增长,尤其是该物种具有更好的增长率在海水盐度。事实上,它已经表明,MAPK / ERK通路激活在禁食和抑制刺激期间重新喂料(59]。同一作者建立了胰岛素样生长因子之间的联系(IGF-I)、MAPK / ERK的活化,和体细胞增长好挣扎,强烈建议监管MAPK通路对鱼类生长的影响。虽然MAPK表达水平低盐度高于正常海水盐度时,只观察观察Saloum人群中受损的增长(28,55),符合这个解释,低表达在微咸水(站点2、22事业单位)表明恰恰相反。MAPK通路被激活的变化包括氧化应激生物因素,生长因子,细胞因子(60,61年]。这些内部因素扮演着重要的角色在转录反应通过反馈机制,通过生物应对内部生理状态包括营养和能量可用性、增长率和病原体感染,通过激活基因表达程序。基因表达机制,直接联系与内部变量与响应外部信号,通过基因表达直接调制的信号转导途径,将细胞外刺激转化为胞内反应来应对环境的变化。在自然环境中生物因素无法控制,外部环境因素的影响可能会干扰和影响种群之间的基因表达水平。这也许可以解释缺乏显著的基因表达和环境盐度之间的相关性研究。据报道,许多基因调节应激反应时没有被具体由给定的扰动,但从应激反应途径的一部分。这样的不具体的应激反应基因一起应对各种可能发生的环境压力和/或结合内在因素对动物的影响更难以评估。此外,非特定的应激反应基因普遍参与的其他生物功能包括多样性增长,性成熟,和繁殖,这可能会干扰压力反应。生物因素的影响,这一事实可能会干扰自然环境中的外部环境因素可以解释LDH的差异表达水平之间的繁殖株和野生鱼。

我们的方法的主要缺点是有限数量的基因分析,但是这些基因在这里用作代理整个网络的压力反应通路。SLC4A1和MAPK基因的角色曾被调查在同一种群中基因表达对盐度的适应可塑性变化(17]。可利用这些基因来解决新问题的优势更好地阐明他们的角色适应盐度变化的反应。这里实验种群分析暴露在特定治疗不同长度的时间,这可能使研究结果难以解释关于人口和盐度的起源时间和暴露在一个特定的治疗。然而,实验表明,两个三个基因之间的明显差异表达分析淡水和咸水环境治疗,并在这两种情况下,人口因此起源和盐度的鱼被捕获并没有显着影响的三个基因的表达。同样,不同实验发展阶段、类型的坦克,食品类型,今年光,时间似乎不影响鱼类的生理机能,因此,他们的基因表达水平。

5。结论

基因,导致压力的具体特征公差已经成功研究仍被用作生物标记为调查受雇于生物对环境变化的适应机制。基因表达之间的关系和环境盐度的变化美国melanotheron人口在盐度梯度已经成功地探索了在先前的研究17,47,62年]。盐度之间的显著相关性被发现在人群和mRNA转录水平的基因推定地参与渗透调节,这表明它们在盐度适应中发挥作用。也表明,基因表达模式在野生种群生活史特征的匹配salinity-related差异以前观察到的相同的人口(63年]。这些结果清楚地表明美国melanotheron是一个很好的模型物种对于理解鱼所使用的分子和生理机制应对极端环境盐度的变化,特别是在塞内加尔和冈比亚河口,其他因素,如水温、溶解氧、显示相当大的变化。这些结果也清楚地表明,候选基因的方法可以应用于野生种群识别基因和通路参与极端盐度的适应,包括人口居住在河口生态系统环境条件的复杂性,可以带来巨大的困难在基因表达谱的解释。本研究的结果表明,候选基因选择的实验条件下对盐度变化没有显示预期的行为当监控在野生自然试验样品的生活在一个类似的盐度梯度。这些结果提出研究基因的可能性并不特别,完全响应盐胁迫。他们可以限定为非特定的应激反应基因,对可能发生的各种环境压力结合生物压力包括动物和内在因素的影响难以评估野生种群。本研究首先说明基因表达分析的复杂性导致野生鱼类种群的固有限制候选基因识别方法,本质上依赖于知识在生理、生化和代谢功能。这些结果尤其重要,因为它们提供一个指示多少需要注意在选择的候选基因研究自然种群。

缩写

SLC4A1:	带3离子运输蛋白质
MAPK:	增殖蛋白激酶
LDH:	乳酸脱氢酶
存在:	定量实时聚合酶链反应
扫描电镜:	均值的标准误差
SSH:	抑制差减杂交。

附加分

支持数据的可用性。内的所有数据集支持本文的结果及其附加文件1条。加入数字的核酸序列的三个候选标记在这项研究中所示部分使用2.6:SLC4A1(加入基因库ES881098数量)、MAPK(加入基因库ES881524),和LDH(加入基因库ES881483数量)。作者的信息。Mbaye齿是一个进化生物学家,他执行他的博士论文在进化生物学和生态学的蒙彼利埃大学二世,在部门综合生物学研究所的科学、进化、弗朗索瓦博士的指导下Bonhomme (CNRS)博士Jean-Dominique杜兰(IRD)。他的研究集中在遗传和生理机制鱼类对环境变化的适应,包括环境盐度的变化。他第一次进行博士后研究基因组学与进化实验室的马克斯普朗克研究所的理查德·莱因哈特博士在柏林分子遗传学。之后,他执行第二个博士后在基因组学和下一代测序基因组中心MIP科隆。更具体地说,他曾在欧洲鲈鱼(测序项目Dicentrarchus labraxl .)基因组,这是发表在《自然通讯。他正在做他的研究在分子约翰内斯堡大学动物学实验室他工作在一个项目,旨在研究热适应和表型可塑性的作用在沿海无脊椎动物和/或鱼类物种通过研究人群的范围跨多个南非海洋生物地理的省份。

的利益冲突

最终的利益冲突(包括个人通信或额外的权限和相关手稿),金融支持的来源,企业参与,和专利资产披露。

作者的贡献

Mbaye齿的构思和策划。他收集了野生种群样品在自然环境中博士的帮助下Jean-Dominique杜兰和Khady迪奥普。他进行了花园里常见的实验的帮助下Jean Francois Baroiller博士和他的团队。他进行基因表达和统计分析、计划和协调手稿准备,写的手稿。

确认

作者感谢Jean-Dominique杜兰和Khady迪奥普的帮助在样本收集的自然环境。他还感谢Jean Francois Baroiller和他的团队提供设施和帮助进行花园里常见的实验。这个项目已经被IRD财政支持研究中心070 -说唱和支持和培训部门(DST)。金融支持(博士后奖学金)也从马克斯·普朗克分子遗传学研究所获得(德国柏林)和动物学,约翰内斯堡大学(南非)手稿准备。

补充材料

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