转录组测序的绞股蓝皂识别基因和酶参与三萜生物合成

文摘

g . pentaphyllum(绞股蓝皂),一个匍匐草本多年生与许多重要的药用价值,是广泛分布在亚洲。皂甙(三萜皂甙)的主要有效成分g . pentaphyllum深入研究。FPS(通过焦磷酸合酶),学生(角鲨烯合酶)和SE(角鲨烯环氧酶)是主要的酶参与了三萜皂苷的合成。考虑的重要的药用功能g . pentaphyllum,有必要调查的转录组信息g . pentaphyllum促进未来的研究转录调控。测序后g . pentaphyllum,我们得到50654708 unigenes。接下来,我们使用RPKM每百万读)(每个碱基读取计算表达式的unigenes我们表现的比较数据,五个常见的数据库中包含注释unigenes的不同方面。最后,我们注意到,FPS、SS和SE显示DESeq酶的微分表达式。叶子显示FPS的最高表现,SS, SE相对于其他两个组织。我们的研究提供了转录组信息g . pentaphyllum在自然环境和我们发现的一致性unigene表达,酶表达(FPS、SS和SE)和皂甙含量的分布g . pentaphyllum。我们的结果将使未来相关的研究g . pentaphyllum。

1。介绍

绞股蓝皂(研究)。牧野是一种匍匐草本多年生植物,分布在亚洲。绞股蓝皂(g . pentaphyllum生长在中国的许多地方,包括广西、广东、福建、贵州、云南、湖北、安徽、河北、江苏、河南、山东、四川、山西和在台湾。g . pentaphyllum还生长在周边国家,如孟加拉国、印度、印尼、日本、韩国、马来西亚(数据来自华南植物园)的清单(1]。皂甙(三萜皂甙)的主要有效成分g . pentaphyllum有各种各样的生物活性,解释的广泛应用g . pentaphyllum在天然药物(2- - - - - -13]。例如,皂甙具有降糖效应,增加胰岛素的分泌(11- - - - - -13]。其他功能如抗癌功能,抗炎作用,抗焦虑作用,减脂血,肝脏cells-protecting,神经保护,immunoprotection也被报道(2- - - - - -10]。

皂甙中次生代谢产物合成途径常用药用。甲羟戊酸的前体或类异戊二烯三萜合成途径的开始,我们称之为MVA(甲羟戊酸)或议员(methylerythritol磷酸途径(图)1)[14- - - - - -16]。常用药用的合成途径可以分解成三个部分:(1)的合成IPP(焦磷酸isopentenyl)或DMAPP(焦磷酸dimethylallyl);(2)合成和角鲨烯的环化;和(3)功能化反应收益与角鲨烯(图的复杂性1)。FPS(通过焦磷酸合酶),学生(角鲨烯合酶)和SE(角鲨烯环氧酶)以前确定为三萜皂苷的合成所涉及的主要酶(17- - - - - -20.]。需要FPS、SS和SE合成和角鲨烯的环化,结合了两种倍半萜类化合物成一个三萜()[16,21]。在这一步中,常用药用可以变成许多同种型类型protosteryl类型(chair-chair-chair-boat构象),dammarenyl类型(chair-chair-chair-boat构象),cadinyl类型(chair-chair-chair-boat构象),藿烯和tetrahymanol(chair-chair-chair-chair构象或chair-chair-chair-boat构象)[21]。

图1

三萜合成途径。注意:AACT:乙酰辅酶a C-acetyltransferase;邮政编码:hydroxymethylglutaryl-CoA合成酶;β-:hydroxymethylglutaryl-CoA;HMGR: hydroxymethylglutaryl-CoA还原酶;MVA:甲羟戊酸;可:甲羟戊酸激酶;MVAP:磷酸甲羟戊酸;MPK:甲羟戊酸磷酸激酶;MVAPP:甲羟戊酸二磷酸; MDC: mevalonate diphosphate decarboxylase; G3P: D-glyceraldehyde-3-phosphate acetaldehydetransferase; DXPS: 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase; DXP: 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate; DXR: 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase; MEP: 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate; MCT: 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase; CDP-ME: 4-(cytidine 5′-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol; CDP-ME2P: 2-phospho-4-(cytidine 5′-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol; MECPP: 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate; HDS: l-hydroxy-2-methyl-butenyl-4-diphosphate synthase; HMBPP: l-hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphate; HDR: 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase; IPP: isopentenyl-PP; IDI: isopentenyl-diphosphate delta-isomerase; DMAPP: dimethylallyl-PP; GPS: geranyl-diphosphate synthase; GPS: geranyl-diphosphate synthase; GPPS: geranylgeranyl diphosphate synthase; GPP: geranylgeranyl diphosphate; FPS: farnesyl diphosphate synthase; GGPPS: geranylgeranyl diphosphate synthase; GGPP: geranylgeranyl diphosphate; SS: squalene synthase; and SE: squalene epoxidase.

皂苷含量,皂甙(常用药用)g . pentaphyllum有各种各样的和重要的应用在医学和健康(22]。然而,皂甙显示更高的异质性与皂苷含量相比,169多种皂甙被发现g . pentaphyllum(23- - - - - -28]。换句话说,超过五倍的三萜皂甙被发现g . pentaphyllum相对于人参(p .人参)。这是有趣的g . pentaphyllum有这种多样性与其他植物相比,常用药用(26]。这可能与不同的基因表达和酶参与常用药用的合成途径。如今,转录组测序(RNA序列)是一个越来越流行的工具来探索转录组过程(29日- - - - - -37],因为RNA序列有几个优点相对于DNA测序等费用更低,效率更高,更高级的功能,等等36- - - - - -39]。2011年,Sathiyamoorthy Subramaniyam转录组的分析g . pentaphyllum有关常用药用的合成途径。然而,这篇文章有两个重要的局限性。首先,样品仅用于测序包括两个组织(根和叶)和g . pentaphyllum采样并测序是种植在水里而不是在自然环境(32]。这是很重要的,因为g . pentaphyllum展品伟大的表型多样性在不同环境中由于其适应性强(33,40- - - - - -44]。此外,虽然作者显示测序数据,分析unigenes表达式之间没有联系,酶表达,或皂甙含量的分布g . pentaphyllum是确定。2015年,赵等人发现EST-SSR制造商通过分析两个物种的测序数据Gynostemma(葫芦科)33]。在这篇文章中,组织是自然的和完整的,但这三个组织(年轻的叶子,花,和不成熟的种子)从各种g . pentaphyllum混在一起来提取RNA为构建cDNA序列。换句话说,测序数据和相关信息在这篇文章是一个混合的结果,这些结果不能被组织分类。因此,为了解决这一不足的知识,我们收集g . pentaphyllum分别在自然环境及其转录组测序的Illumina公司NextSeq 500。

2。材料和方法

2.1。样本收集和准备

g . pentaphyllum用于测序在药用植物种植花园广西中医药大学的南宁城市,广西自治区,中国。2015年7月,我们收获g . pentaphyllum伊琳先生鉴定后朱(广西中医药大学)。纤维根、叶和茎分别收集和清洗等杂质去除土壤(生物重复三次每个组织的集合)(图S1-S5在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/7840914)。最后,样本保存在cryotubes并立即浸泡在液氮。

2.2。Illumina公司测序

植物组织的样本g . pentaphyllum被派去Personalbio公司(上海,中国)使用新一代测序转录组测序(上天)技术基于测序平台的Illumina公司NextSeq 500。首先,信使rna与化学试剂裂解成小段治疗后,温度高。接下来,部分被用来构造cDNA文库测序的配对(PE)读取结束。

2.3。Unigene组装

三一(r20140717 k-mer 25个基点)专业软件被用来组装RNA序列(45]。首先,高质量的序列被构造成一个短序列库k-mer的长度。接下来,主要序列重叠群扩展得到的短序列库使用重叠k-mer-1长度。接下来,主要叠连群序列分类重叠和分类重叠群被构建到De Bruijn图。基于读入每个类别的识别率,记录序列重叠群的恢复。由三一组合后,爆炸(版本2.2.30 +)被用来比较序列与参考序列在NCBI组装(国家生物技术信息中心)nonredundant蛋白质(NR)序列来确定最佳的比较结果。最后,序列相同的gi归类为同一unigene数量和最长的序列被认为是代表序列unigene [46]。

2.4。分析Unigene表达式

RPKM(每个碱基读取每百万读)被用来计算unigene表达g . pentaphyllum和RPKM是下面描述的计算方法47]。我们计算unigene表达式之前,我们需要处理的阅读数量unigenes领结2(2.2.4,默认设置)48]。RPKM密度分布通常反映了基因表达的模式。通常,unigenes与媒介表达覆盖大部分的曲线下的面积(AUC)的密度分布RPKM(用软件R)的密度函数。相对的,与高或低表达unigenes占领AUC的少数民族。DESeq(1.18.0版)软件被用来分析的微分表达式unigenes在我们的研究(49]。unigenes的表达比较的褶皱变化(褶皱变化> 2)及其意义(值< 0.05)。最终结果由文氏图显示。

2.5。功能注释

分类之后,unigenes注释功能使用五个数据库:NCBI nonredundant蛋白质(NR)序列,基因本体论(去)50,51),《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG) [52,53,基因的进化谱系:Nonsupervised同源组(蛋),(54]和Swiss-Prot [55,56]。

2.6。皂甙含量的分布分析g . pentaphyllum

首先,干粉末的样品(约15毫克)和10毫升的萃取溶剂(乙醇含有5.0%纯净水)和被继续处理超声波治疗30分钟。第二,混合溶剂是一个旋转蒸发器蒸发干燥使用。干皂甙被再溶解在5.0毫升热水(50°C)。第三,这种解决方案应用于色谱柱包含D101大孔树脂和允许站20分钟。第四,纯水用于冲洗的大孔树脂的材料,而萃取溶剂(乙醇含有50%的纯净水)被用来去除皂甙的形式列。第五,皂甙的溶剂是带来了5.0毫升和处理由香草醛显色反应。然后我们发现溶剂的吸光度(颜色反应后),紫外可见分光光度计波长584纳米。最后,我们使用Panaxadiol (C_30.H₅₂O₃)作为标准样品来计算样品中皂甙的实际内容标准曲线的方法。

3所示。结果

3.1。测序和组装的概述

信使核糖核酸的g . pentaphyllum被分割成许多小段构造cDNA文库。测序后cDNA文库,我们获得352999296原始读取。然而,这集的原始读取也包含了大量的适配器和低质量的序列,所以103500643读被过滤掉,留下了249488643清洁读高质量的。接下来,1119964重叠群装配了249488543个基点的总长度重叠的原始读取和我们使用这些重叠群恢复转录组序列。在下一步中,我们收获159858904转录组序列和爆炸(基本局部比对搜索工具)用于NR数据库中的所有转录组序列。转录组序列与得分最高的爆炸是保存和转录组序列相同的gi归类为来自同一unigene数量。最后,我们获得了50654708 unigenes平均长度为755个基点。提出了序列表的概述1。

3.2。注释的结果

我们用五个数据库、NR, KEGG,蛋酒,和Swiss-Port注释unigenes函数(图S6-S9)。注释是列在表的概述2。每个注释的结果是提供的支持文件。一般来说,蛋酒显示标识率为96.57%和KEGG显示最低的标识率为8.77%时比较unigenes与参考序列。根据unigenes注释,是基于不同的功能分为不同的类别,苗条显示有关unigenes分布的一般特性。然后,我们使用了蛋酒数据库详细探索蛋白质的生物功能,因为蛋酒分类不同的蛋白质序列到更详细的目录中。同样,Swiss-Port也用于注释的蛋白质序列,Swiss-Port基于蛋酒和提供更详细的结构蛋白质的信息。最后,最后但最重要的是数据库KEGG我们用来标注酶,自从KEGG通路注释表明分子间反应的网络。这允许测定的酶位于三萜皂苷的合成途径。

3.3。表达Unigenes

RPKM是归一化法计算基因表达和我们使用的密度分布RPKM unigenes的表达。密度分布的地图显示我们unigenes表达符合标准因为unigenes中档表达占据大多数的AUC(曲线下的面积)和unigenes较低或高表达式是AUC的少数民族(图2)。纤维根密度分布,unigenes显示表达远高于茎和叶。尽管茎和叶显示类似unigene表达式,茎unigene表达稍微高于树叶。我们分析的结果表达式的unigenes FPS, SS, SE,β——(beta-amyrin合成酶)表3。明显,unigenes FPS编码,SS, SE,β——显示最高的表达在纤维根叶子和最低的表达式。unigene表达β——,树叶几乎表达式比纤维根高出125倍。FPS的unigenes SS、SE和β——显示,茎高表达比纤维的根源。基于这一测序数据,我们发现使用软件DESeq unigenes的微分表达式。我们得到了调节和表达下调unigenes数据之间的两两比较的纤维状的根,茎,叶(表4)。我们也决定了unigenes微分表达式显示在所有样本。我们用维恩图解软件R函数来描述的一般分布unigenes与微分表达式(图3)。结合表中的数据4和图3,我们得出的结论是,10832 unigenes显示微分表达式。此外,699 unigenes显示在所有样本的差异表达,而6512年unigenes微分表达式的两两比较显示样本。

图2

RPKM的密度分布。注意:GPG:纤维根;GPJ:茎;玉米:叶子;RPKM:每百万读取每个碱基读取。

图3

维恩图解unigenes的微分表达式。

3.4。皂甙的含量分布g . pentaphyllum

用紫外可见分光光度计检测皂甙的含量分布g . pentaphyllum。叶含量最高(3.189%)的所有样本的皂甙(表5),茎中皂甙的含量(0.365%)或纤维状根(0.172%)远低于树叶。相关系数()0.996标准曲线表明,我们的结果是准确和可靠的(图S10)。

3.5。酶的表达常用药用的合成途径

基于KEGG通路,更详细的结果对常用药用合成的酶的表达。我们分类相关的酶为三个部分根据常用药用的合成途径:(1)酶参与的合成IPP或DMAPP,(2)酶参与合成角鲨烯环化,和(3)酶的角鲨烯功能化反应(图1)。我们专注于FPS, SS, SE,因为这三个酶中扮演重要角色的合成和环合常用药用(图4)[17- - - - - -19]。结果如表所示6和图5。我们发现三个明显的结果。首先,在FPS的比较,只有一个纤维的根和叶被发现之间的比较。叶子显示高FPS的表情相比,纤维根。其次,在党卫军的比较,发现两个比较,结果表明,叶的表达高于纤维根和茎。第三,在SE的比较,叶子显示表达高于茎和根纤维。纤维根SE的表达高于茎。

图4

FPS、SS和SE合成途径的常用药用。注意:IPP: isopentenyl-PP;伊迪:isopentenyl-diphosphate delta-isomerase;DMAPP: dimethylallyl-PP;全球定位系统(GPS): geranyl-diphosphate合成酶;gpp: geranylgeranyl二磷酸合酶;GPP: geranylgeranyl二磷酸;FPS:通过二磷酸合酶;GGPPS: geranylgeranyl二磷酸合酶;GGPP: geranylgeranyl二磷酸; SS: squalene synthase; and SE: squalene epoxidase.

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图5

RPKM FPS, SS、SE和β——。注意:(a) RPKM FPS;(b) RPKM党卫军;(c) RPKM SE-1;(d) RPKMβ——;GPG:纤维根;GPJ:茎;玉米:叶子;RPKM:每百万读取每个碱基读取。

4所示。讨论

g . pentaphyllum是一个匍匐草本多年生药用价值用于中药。三萜皂苷的主要有效成分g . pentaphyllum,被广泛研究2- - - - - -13,23,24]。在这项研究中,我们使用RNA转录组信息测序,获得一种表现出更高的效率和更便宜的技术比DNA测序(38]。我们分析了协会unigene表达,酶(unigenes)的输出表达式,和皂甙的含量分布(输出)的酶功能注释(表2),RPKM计算(表3(表)、皂甙和测量内容5)。

我们发现unigenes和酶的表达与皂甙含量的分布呈正相关。一般来说,unigenes和酶表达(FPS、SS和SE)样品(纤维状的根,茎,叶)决心皂甙含量的分布。unigenes的高表达和酶(由unigenes编码)引起较高含量的酶的生产(皂甙),较低的表达unigenes酶和酶造成更少的生产。这个一致的结果可以促进其他次生代谢物的未来的研究g . pentaphyllum。自g . pentaphyllum健康和医学广泛应用,有必要确定二级代谢物与各种和至关重要的药用功能。

一个有趣的发现是观察到的差异和个人表达unigenes(图一般表达式2和表3)。一群特定unigenes (FPS、SS和SE)位于一个特殊通路等常用药用合成可能增加他们的表达更高的层次等特殊生理活动所需三萜合成。这种明显的差异表达可能导致转录调节的变化。目前研究的一个热门话题的微分表达式转录组和转录的调控植物对特殊环境的压力或其他遗传因素(57- - - - - -63年]。另一个有趣的观察是,转录组序列的g . pentaphyllum决定在我们的研究中显示相关的转录组序列的高度相似性,在黄瓜苦味报道之前(64年]。我们下载可用的信使rna序列相关的酶从那篇文章,抨击他们的unigene序列g . pentaphyllum。爆炸的结果是令人惊讶的,因为所有13个可用的序列相关的痛苦在那篇文章中表现出高度的相似的特定unigene序列g . pentaphyllum。这么高的相似性预测,生物合成相关的基因,监管和驯化黄瓜也可能出现在的痛苦g . pentaphyllum。g . pentaphyllum也有两个口味(甜、苦),这种差异的味道可能会引起如黄瓜。的味道g . pentaphyllum从苦到甜的预测g . pentaphyllum可能会改变在回应驯化和包含一个类似的突变。进一步探索遗传的驯化g . pentaphyllum可能提供的理解改变口味。

虽然这项研究并不是第一个转录组信息的报告g . pentaphyllum使用排序,我们纠正以往研究的局限性和丰富三萜合成的分析g . pentaphyllum。g . pentaphyllum用于分析在我们的研究是在自然环境中种植和三种常见类型的植物组织(纤维状的根,茎,叶)被用来为测序提供了组织样本。测序,一起探索的皂甙含量的分布进行确认分析的酶和unigenes。我们发现一个积极的协会unigene表达,酶表达,和皂甙的分布。我们的研究将促进更多的基因研究转录调节和改变的痛苦g . pentaphyllum。

5。结论

提供更完整和高质量的转录信息的自然g . pentaphyllum,我们使用RNA序列的转录组测序技术g . pentaphyllum。我们发现一个积极的协会unigene表达,酶表达,和皂甙的分布。我们的结果将使未来相关的研究g . pentaphyllum。

缩写

信息披露

Qicong陈是第一作者。

数据访问

中列出的数据和材料补充信息。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Yaosheng吴、马盛通Jieying钱准备的样品g . pentaphyllum广西中医药大学测序。所有作者一起分析测序数据但Qicong陈负责特定的测序数据的分析。吴Yaosheng提供了指导方针来检测中皂甙含量的分布g . pentaphyllum写这份报告和指导方针。陈Qicong检测中皂甙含量的分布g . pentaphyllum写这个手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。31260069)。作者感谢朱伊琳先生(广西中医药大学)识别的样本。

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