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国际基因组学杂志
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国际基因组学杂志/2016年/文章
特殊的问题

高通量测序分析的最新进展

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2016年 |文章的ID 6762731 | https://doi.org/10.1155/2016/6762731

易,华阴Li Fengde Wang Jingjuan Li汇,呆在王健胃高, ”比较转录组分析揭示了外生血色素对花青素生物合成的影响在草莓果实成熟”,国际基因组学杂志, 卷。2016年, 文章的ID6762731, 14 页面, 2016年。 https://doi.org/10.1155/2016/6762731

比较转录组分析揭示了外生血色素对花青素生物合成的影响在草莓果实成熟

易李,1,2 华阴李,1 Fengde王,1 Jingjuan李,1 张易汇,1 呆在王,2 和 健胃高1

1蔬菜和花卉研究所、山东农业科学院、山东重点实验室温室蔬菜的生物学和国家蔬菜改良中心,山东分公司250100年济南,中国

2南京农业大学园艺学院,南京210095年,中国

学术编辑器:Quanhu盛
收到了 2016年7月15日
修改后的 2016年9月30日
接受 2016年10月25日
发表 2016年12月15日

文摘

花青素在草莓果实着色有积极影响。在这项研究中,外源性血色素的作用对花青素生物合成研究。我们的结果表明,草莓的白色阶段治疗外源性血色素花青素含量较高,与对照组相比。在所有治疗,5μM的血色素是促进颜色发展最优条件。为了探索果实着色的分子机制由血色素,转录组血色素和non-hematin-treated水果进行了分析。大量的差异表达基因(度)被确定在调节花青素合成,包括花青素生物合成所涉及的度、激素信号转导,光敏色素信号、淀粉和蔗糖降解,转录途径。这些监管网络可能发挥重要的作用在调节颜色的草莓血色素处理过程。总之,外生血色素可以促进果实着色通过增加花青素含量的白色阶段草莓。此外,转录组分析表明hematin-promoted水果颜色发生通过多个相关的代谢途径,为管理提供有价值的信息通过花青素生物合成在草莓果实的颜色。

1。介绍

草莓(草莓属×ananassa杜赫)是最受欢迎的水果之一,与全球经济的重要性(1]。因为它有吸引力的红色着色和丰富的营养,草莓是高度追求的消费者(2,3]。这些品质是部分由于草莓花青素含量较高。花青素具有较高的抗氧化活性(4]。研究表明,花青素有潜在的健康益处的各种条件,包括心血管疾病、先进age-induced氧化应激、炎症反应(5),和多样化的退化性疾病6,7]。草莓增加花青素含量一直是近年来相关的研究课题。

花青素的生物合成是一个复杂的生物过程受基因影响,发展,和环境因素8]。在过去的几年中,大多数的结构基因编码酶花青素生物合成途径已经被分离出来并表现为草莓。第一组的结构基因在这些途径包括苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、查耳酮合酶(CHS),黄烷酮3-hydroxylase (F3H) dihydroflavonol-4-reductase (DFR) leucoanthocyanidin还原酶(政治)/花青素合成酶(ANS)和UDP-glucose黄酮类3-O-glucosyltransferase (UFGT)。这些结构性的基因组成花青素的合成所需的路径(9]。这些基因调控主要由Myb / bHLH WD40 (MBW)复杂在许多植物10,11]。

它已经表明,花青素合成之后迅速增加草莓(白色的阶段12]。激素脱落酸(ABA)、细胞分裂素(CTK)和乙烯甲基jasmonate (JA)也发挥着重要的作用在调节草莓的颜色开发过程增加花青素积累(12,13]。生长素和赤霉素(气)已知减少花青素生物合成在颜色开发水果(8]。

光的一个最重要的环境因素调节花青素生物合成(14]。植物色素作为感光细胞,发挥重要作用在光刺激的发展草莓(15]。光敏色素是homodimeric色素蛋白,其中每个holophytochrome由光敏色素蛋白共价绑定到一个线性四吡咯发色团phytochromobilin (PΦB)。PΦB作为光敏色素的光接收天线。PΦB质体中合成的血红素催化血红素加氧酶(HO)和随后phytochromobilin合酶(16]。血红素加氧酶1 (HO1)是至关重要的这一过程,作为病原反应酶的生物合成PΦB。HO1催化一氧化碳血红素的氧化,铁2 +和胆绿素(BV)在植物17]。此外,HO1已被证明在花青素积累在植物中发挥重要作用。例如,西红柿(18,19),拟南芥(20.- - - - - -22]HO1有缺陷的突变体,不能合成光敏色素发色团,主要花青素积累减少。

血色素(C34H33O5N4铁),原卟啉复杂,是一种诱导物和基质HO1在动物和植物17,23]。外生血色素了缓解mercury-induced氧化损伤的根源紫花苜蓿(17),诱导不定根数和根黄瓜的长度(24),调节芸苔属植物黑质纳米银粒子的压力下种子萌发,缓解黄化小麦幼苗的叶子在完全黑暗(25,26]。这些影响可能来自一个血色素诱导HO1酶反应产物。

在这项研究中,外源性血色素的影响在白色的舞台上草莓研究通过比较hematin-treated果实中的花青素含量和对照组。为了了解底层的分子机制调节果实着色的血色素治疗,mRNA表达谱的分析都使用高通量测序。结果表明,外源血色素可以促进果实着色。比较转录组分析可以给我们一个更好的理解在草莓果实着色过程的机制。

2。材料和方法

2.1。植物材料,生长条件,和血色素治疗

草莓(草莓属×ananassa杜赫简历。一个octoploid Benihoppe), ( )的物种,是标准的文化条件下种植在温室(30/15°C, h日夜14/10,相对湿度50 - 80%)。温室内的最大光强是55300勒克斯。草莓果实的发育阶段划分为七个视觉阶段:绿色的小(SG),绿色(BG)、degreening (DG)、白(Wt),最初的红色(IR),偏红(PR)、全红(FR) [12]。草莓植物在白色的阶段(开花后约25 d)选择研究血色素在果实着色的影响研究。研究不同浓度的血色素的影响在水果的颜色,白色阶段草莓植物( 为每个治疗)喷洒0,1,10或100μM血色素(H3281 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),分别为(26]。草莓水果( 为每个治疗)时收获水果进入公关阶段(治疗后48小时)。水果是立即在液态氮冷冻和储存在−80°C进行进一步分析。我们找到了10μM hematin-treated草莓最花青素积累在所有治疗(图S1,在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/6762731)。通过使用相同的方法来治疗0的水果,5、10、15 -μ5 M血色素,我们发现治疗μM血色素的增加花青素生产的最优条件草莓(图1)( )。治疗5μ血色素是用于后续分析。三个独立复制准备每个治疗。

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(一)
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(b)
图1
果实着色和草莓果实中的花青素含量。的颜色5μM hematin-treated草莓西瓜红比对照(CK)治疗后48 h (a)。草莓果实中的花青素含量测定治疗后与不同浓度的血色素(0、5、10和15μ米)(b)。竖线代表标准错误;值和不同的字母是明显不同的 。
2.2。花青素含量测定

草莓的总花青素含量是决定使用方法之前报道[6]。吸光度是记录在贝克曼DU640B分光光度计(富勒顿、钙、美国)在510年和700 nm花青素解决方案在一个缓冲酸碱1.0和4.5,分别。根据获得的吸光度是计算

摩尔消光系数是26900中描述的其他研究(例如,6])。花青素浓度表示在毫克每克鲜重cyanidin-3-galactoside当量。每个处理三个独立进行了复制。

2.3。BV的准备和分析

草莓水果(1 g)在Potter-Elvehjem均质机均质使用1.2毫升冰冷的0.25米蔗糖溶液包含1毫米phenylmethyl磺酰氟,EDTA 0.2毫米和50毫米磷酸钾缓冲(pH值7.4)。匀浆在20000×g离心20分钟和叶绿体被用于活动的决心。BV是化验如前所述[27]。BV的浓度估计使用650 nm的摩尔吸光系数6.25毫米−1厘米−1在0.1 M HEPES-NaOH缓冲区(pH值7.2)。每个处理三个独立进行了复制。

2.4。RNA隔离和cDNA图书馆建设

总RNA进行隔离(如前所述)(28]。下面的过程介绍。草莓果实被磨成粉和混合比例为0.5 g粉20毫升提取缓冲(200毫米Tris-HCl (pH值8.2),100毫米氯化锂,50 mMη,1.5% SDS, 2% PVP(σ,PCP40), 2% BSA(σ),和10毫米德勤(σ))。总共有200μL 10毫克/毫升蛋白酶K(默克公司,达姆施塔特,德国)添加到去除污染的蛋白质。总RNA提取用酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)醋酸钠和乙醇混合物和沉淀。DEPC-treated resuspended在一个适当的混合体积的蒸馏水,然后储存在为下一步−80°C。的质量和数量的总RNA是使用NanoDrop nd - 1000分光光度计测量的(美国NanoDrop威尔明顿·德·)。只有样品符合标准的1.8≤OD260/280≤D2.0和OD260/230≥1.8和浓度≥200 ng /μL用于测序。RNA样本30草莓水果收获在同一治疗组汇集在一起为后续实验。

RNA样本两个生物复制用于cDNA图书馆建设和RNA-Seq北京基因组研究所(深圳华大基因研究院,中国)。总RNA样本DNase对待我(豆类、大连、中国)移除任何可能的DNA污染。信使rna是丰富利用低聚糖(dT)磁珠(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国),切成短片段(约200个基点)。使用上标合成第一链cDNA前置放大系统工具包(美国纽约Gibco-BRL,大岛)按照制造商的指示。益生元的双链cDNA纯化(dT)磁珠后,制造商的指示。终端执行维修和适配器绑定到这些片段结束。结扎产品使用TAE-agarose凝胶电泳纯化。PCR扩增的片段被浓缩,最初变性步骤30年代在98°C,紧随其后的是15周期放大(98°C 10年代,30年代,65°C和5分钟72°C)和最后一个扩展在72°C 5分钟。PCR产品然后使用低聚糖提纯(dT)磁珠。DNA的大小、纯度和浓度检查在安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦,圣克拉拉,CA)。

2.5。差异表达基因的RNA序列和识别

RNA序列进行了使用离子质子平台在北京基因组研究所。原始序列数据过滤获得清洁读作进一步分析通过删除短读(小于30 bp)和修剪适配器。适配器读取被修剪第一计算的平均质量15基地从3′端直到平均质量大于10,然后删除计算的基础。高质量的清洁读取映射与草莓的参考基因组(http://strawberry-garden.kazusa.or.jp/)使用离子激流的映射程序(TMAP 0.2.3版本;https://github.com/iontorrent/TMAP)。不超过两个不匹配被允许在序列比对。质量评估的读取,数据对齐,测序饱和度分析,随后进行了随机性评估来评估质量的测序。

基因表达水平的量化软件旗鱼[29日]。生数量外显子模型的规范化每千碱基读取每百万映射读取(RPKM)。微分表达式分析使用EBSeq包(30.]。 值< 0.05和 被设置为阈值识别显著差异表达的基因。在统计,假阳性错误校正进行了使用罗斯福统计[31日]。

2.6。基因本体论和通路富集分析差异表达基因

草莓是基因功能注释根据基因本体论(去)标准化条款分子功能,细胞组件,并使用Blast2GO生物过程(https://www.blast2go.com/)。基因功能注释使用以下数据库:NCBI nonredundant蛋白质序列,NCBI nonredundant核苷酸序列,蛋白质家族的直系同源蛋白质组,人工注释和综述了蛋白质序列数据库,KEGG数据库直接同源,和基因本体。去注释度后,我们去执行功能分类为度WEGO软件(32)和分析基因的分布函数。我们使用术语搜索工具(http://www.yeastgenome.org/help/analyze/go-term-finder)寻找重要的共享条款。 在哪里 是所有基因的数量和注释; 度的数量吗 ; 是所有基因注释的数量一定的条件;和 度的数量吗 。计算 价值受到Bonferroni调整(33]。修正后的 值< 0.05设置为阈值。方面去满足这个条件被定义为显著富集在度条件。通路富集分析使用KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/随后)进行研究鉴定差异表达基因的功能控制和hematin-treated草莓组。这个公式是一样的,在去分析。在这里 是所有基因的数量和KEGG注释, 度的数量吗 , 是所有基因注释的数量到特定的路径,然后呢 度的数量吗 。

2.7。定量实时聚合酶链反应分析

实时定量PCR(存在)进行了实验评估RNA-Seq数据的可靠性34]。11对特定基因引物设计来验证草莓果实的度(表S1)。草莓RNA从水果中提取根据之前详细的方法。总RNA与DNase消化我30分钟25°C DNA去除污染根据制造商的指示。执行中存在使用SYBR PCR反应混合液(豆类,大连,中国)Bio-Rad IQ-5热循环仪(美国Bio-Rad、费城、PA)。三个复制的每个样本进行计算的平均Ct值。的相对表达水平进行了计算比较 方法(35,36]。意义决定了SPSS软件(SPSS 17.0, IBM,芝加哥,美国)( )。

3所示。结果与讨论

3.1。外生血色素对花青素和胆绿素积累的影响

血色素是一种诱导物和基质HO1在动物和植物17,23]。在这项研究中,草莓在Wt阶段服用0μM(控制),5、10或15μM血色素。结果表明,花青素含量hematin-treated草莓超过48小时后的控制。治疗5μM血色素被发现增加花青素产量(图的最优条件1)( )。花青素含量在5μM hematin-treated草莓是在控制的2.5倍。这是第一个报告,血色素会增加花青素生产水果。我们测量的表达FaHO-1和胆绿素的内容(BV)这是血红素加氧酶的代谢产物。我们发现,血色素也可以显著增加的表达FaHO-1在草莓果实(图4),促进BV的积累(图2)。这些结果表明,血色素通过血红素代谢途径促进花青素的积累。


图2
草莓果实的BV含量测定治疗后0和5μM血色素。竖线代表标准错误;值和不同的字母是明显不同的 。
3.2。序列组装、映射和功能注释

高通量测序技术是广泛应用于基因表达分析在许多生物体(37,38]。在这项研究中,大约10.8英镑的原始标签为每个库生成。消除适配器后,模棱两可的核苷酸,低质量的序列,共34618832年和45464123年清洁读150年和200年之间核苷酸长度(表获得1)。超过85%的清洁标签从每个库映射到参考基因少于2 bp不匹配。不到29%的清洁标签从每个图书馆不能对齐任何参考基因由于不完整的序列,这些标签被指定为未知。超过67.3%的清洁标签在每个库映射到单个基因,而映射到多个参考基因的不到4.7%。未知的标签和标签映射到利用过滤掉,和独特的清洁标签映射到单个基因保留了进一步度分析。
生物复制1 生物复制2
样本 控制 Hematin-treated 控制 Hematin-treated
干净的读取 17808924 26809908 19235452 26228671
基因组地图率(%) 96.58 96.52 96.65 96.74
基因地图率(%) 86.46 86.27 87.04 85.63
完美匹配(%) 4677273 (24.32%) 6510668 (24.28%) 4414050 (24.79%) 6149508 (23.45%)
独特的比赛(%) 15075148 (84.65%) 22628939 (84.41%) 16409557 (85.31%) 21986962 (83.83%)
表达基因 27976年 28713年 28999年 28211年
不匹配(%) 11321162 (63.57%) 17101590 (63.79%) 12456871 (64.76%) 16697280 (63.66%)
总未映射读取 645135例(3.35%) 932213例(3.48%) 608914例(3.42%) 856028例(3.26%)
表1
测序和组装的概述。

此外,完美的匹配率分别为24.32%,24.28%,24.79%,24.35%,控制,控制2、血色素1,分别和血色素2。

库的饱和度和没有血色素的治疗进行了分析。检测到基因的数量成为饱和200万读(图S2)。这表明读足以获得完整的转录组报道。RNA分散在四个库的随机性评估后续的生物信息学分析。结果表明,在每个位置读取参考基因的均匀分布,并演示了所有的图书馆都高度相似的倾向(图S3)。

3.3。基因不同的监管回应外生血色素

根据测序结果的四个信使rna库,大约有29000个基因(大约70%的参考基因octoploid草莓基因组)被发现在每个库。此外,基因之间的相关性之间基于RPKM生物复制进行了分析;相关系数( )高(0.93和0.95为控制和hematin-treated集团职责)。复制筛选基因表达。总共有28713、28999、27976和28211个基因(表1)表示在控制和hematin-treated样本。

揭示了分子通路调节草莓色素血色素,控制和hematin-treated水果之间的度进行了分析。我们比较控制和治疗之间的基因表达谱生物复制样品。度检测在生物复制筛选进行后续分析。1080(402——678年下调)基因的表达有差异5μM hematin-treated组与对照组相比。多基因表达下调hematin-treated组与对照组相比。

促进全球基因表达的分析,去分析是由每一个差异表达基因映射到记录的数据库。基因本体论(去)浓缩度的分析控制和hematin-treated组进行揭示血色素的可能机制促进花青素生物合成。去接受 中代表基因表达显著变化在一个给定的时间间隔。在这项研究中,只有三个方面包括解剖结构安排,分生组织的结构组织、径向模式形成明显富集在生物过程(补充表S2)。尽管大多数条款没有显著强化,他们可以为进一步研究提供参考。根据细胞成分,大量的度是主要分为细胞细胞器,如泡,细胞核,线粒体,质外体,叶绿体,质体,细胞质和细胞膜。特别是,许多度被分配给质体和叶绿体(图3),这表明血色素有着重要影响质体和叶绿体基因的表达。它可能是因为血红素加氧酶1是一种可溶性色素体蛋白(22]。根据分子功能,大量的度分为UDP-glucosyltransferase,蔗糖跨膜转运活动,核酸绑定和DNA结合花青素生物合成密切相关的条款。许多度被分为血红素结合,过氧化物酶活动,四吡咯绑定(图3)。这可能是因为血色素HO1可以增加活动,促进血红蛋白的降解17]。此外,在果实花青素积累密切相关激素(8和碳水化合物的生物合成9]。根据生物过程,大量的度分为调节激素水平,细胞分裂素代谢过程,对激素反应,对脱落酸反应,响应生长素,和对乙烯的反应条件,表明与荷尔蒙相关的度参与调节hematin-treated果实中的花青素生物合成。许多度被分为淀粉和蔗糖合成和转运过程和phenylpropanoid代谢过程,表明通过phenylpropanoid血色素能促进花青素积累代谢和碳水化合物的代谢。此外,许多度被分为光刺激反应的过程,表明血色素也可能参与光刺激系统。


图3
基因分类基于基因本体论(去)度的草莓被血色素。

图4
基于存在的验证RNA-Seq基因表达。值显示三个生物复制±SD的手段。星表明之间的表达水平明显不同hematin-treated和对照组( , )。

通路富集分析理解度的生物功能通过识别显著强化信号转导途径或代谢途径(39]。在这项研究中,大量的改变与血色素相关生物学途径治疗,和三个途径,包括RNA聚合酶,嘧啶代谢,和嘌呤代谢,明显丰富( 值< 0.05)(表2)。虽然大多数的途径方面没有显著富集,通路富集分析有助于我们进一步理解度的生物功能和分子机制调节果实着色的血色素治疗。这些途径方面包括代谢途径、次生代谢产物的生物合成,isoflavonoid生物合成,苯丙氨酸代谢,苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成,淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导、黄酮和黄酮醇的生物合成,phenylpropanoid生物合成(补充表S2)。
通路 度与通路注释(451) 所有与通路的基因注释(15877) 纠正 价值 价值 通路ID
RNA聚合酶 16 183年 0.0068107 ko03020
嘧啶代谢 20. 317年 0.0007651746 0.0320 ko00240
嘌呤代谢 21 347年 0.0009710371 0.032044224 ko00230
表2
通路富集分析差异表达基因。
3.4。度参与花青素生物合成的分析
3.4.1。转录因子

转录因子(TFs)蛋白质调节下游靶基因的表达。许多TFs,如v-myb禽成髓细胞瘤病毒致癌基因相同器官(MYB),基本helix-loop-helix (bHLH) WD40-repeats蛋白质(WD40),和MADS-box(尼),直接在花青素生物合成调节结构基因的表达从许多物种已确定8]。因此,关键的增强表现TFs可能调节花青素生物合成。在我们的研究中,一些花青素biosynthesis-related TFs被发现是唯一出现在hematin-treated度分析的水果,例如,MYB, bHLH, PIF3, MADs-box AP2-EREBP, ABI3 / VP1(表3)。花青素生物合成的基因调控,主要是由MBW转录因子,它是一个三元转录因子复杂(10,11]。大多数MYBs参与调节花青素生物合成是积极转录监管机构[8]。然而,MYBs也可以充当阻遏蛋白,如草莓FaMYB1和FaMYB9和小道消息VvMYB4,这可以显著抑制花青素和黄酮醇的生物合成40]。在这项研究中,三个unigenes属于MYB转录因子差异表达,和两个MYB转录因子有显著调节。其中,unigene”FANhyb_rscf00000146.1.g00007.1”MYB家族R2R3 MYB转录因子显著调节。此外,越来越多的证据表明,bHLHs促进花青素积累的表达在水果41]。在我们的研究中,所有的unigenes bHLH家族的表达下调,其中的表达水平unigene FANhyb_rscf00001292.1.g00003.1显著降低6250倍(表3)。FANhyb_rscf00002210.1.g00001.1编码预测MADS-box转录因子,它明显下调。有三个unigenes AP2-EREBP家庭,只有一个调节和其他人表达下调。这些结果表明,外生血色素参与发展花青素生物合成的转录调控。
注释转录因子 基因身份证 真正的叠化值 Upregulation / downregulation 罗斯福
预测:AP2-like ethylene-responsive AIL1-like转录因子 FANhyb_icon00006295_a.1.g00001.1 9.38 向上
预测:AP2-like ethylene-responsive AIL1-like转录因子 FANhyb_rscf00003155.1.g00001.1 4 下来
预测:AP2-like ethylene-responsive AIL5-like转录因子 FANhyb_rscf00000029.1.g00010.1 4 下来
MYBdomain蛋白质66 FANhyb_rscf00000146.1.g00007.1 6.54 向上
MYB-related蛋白质3 r-1-like部分 FANhyb_rscf00000141.1.g00016.1 2.82 向上
预测:转录因子GAMYB-like FANhyb_rscf00000649.1.g00006.1 3.03 下来
预测:可能WRKY转录因子53-like FANhyb_rscf00001973.1.g00002.1 2.17 下来
转录因子bHLH80-like FANhyb_rscf00001292.1.g00003.1 6250年 下来
转录因子bHLH70-like FANhyb_rscf00000295.1.g00003.1 5.26 下来
转录因子ICE1-like FANhyb_rscf00000170.1.g00006.1 2.44 下来
C2H2-like锌指蛋白 FANhyb_rscf00001143.1.g00002.1 2.82 向上
锌指蛋白MAGPIE-like FANhyb_rscf00003024.1.g00001.1 2.04 向上
预测:轴向监管机构淡水螯虾五喜欢 FANhyb_rscf00001667.1.g00001.1 4.17 下来
预测:轴向监管机构淡水螯虾一样 FANhyb_rscf00006899.1.g00001.1 3.57 下来
预测:景深锌指蛋白DOF3.7-like同种型1 FANhyb_rscf00006856.1.g00001.1 2.63 下来
ZF-HD同源框蛋白 FANhyb_rscf00000044.1.g00022.1 3.85 下来
ZF-HD同源框蛋白At4g24660-like FANhyb_rscf00005241.1.g00001.1 3.57 下来
预测:B3 REM14-like domain-containing蛋白质 FANhyb_rscf00001009.1.g00002.1 2.43 向上
预测:B3 domain-containing ABI3-like转录因子 FANhyb_rscf00001271.1.g00002.1 4.55 下来
生长调节因子6 FANhyb_rscf00000024.1.g00029.1 3.45 下来
生长调节因子5 FANhyb_icon00009704_a.1.g00001.1 2。7 下来
GATA型锌指转录因子家族的蛋白质 FANhyb_rscf00000393.1.g00013.1 11.11 下来
预测:锌指CCCH domain-containing蛋白质2 FANhyb_icon00006770_a.1.g00001.1 3.13 下来
预测:E2F转录因子以E2FE-like FANhyb_icon00002702_a.1.g00001.1 2.78 下来
预测:无特征蛋白 FANhyb_rscf00001066.1.g00001.1 2.63 下来
预测:核转录因子Y亚基A-3-like同种型1 FANhyb_rscf00000008.1.g00035.1 3.85 下来
预测:蛋白质ATHB-8-like homeobox-leucine拉链 FANhyb_rscf00000015.1.g00005.1 2.63 下来
预测:MADS-box 18-like转录因子 FANhyb_rscf00000323.1.g00016.1 2.43 下来
预测:像同种型锌指蛋白132 - 1 FANhyb_rscf00007015.1.g00001.1 2.43 下来
预测:转录因子PIF3-like FANhyb_rscf00000669.1.g00002.1 3.46 向上
表3
度作为转录因子在回应外生血色素。
3.4.2。度在花青素生物合成

花青素生物合成途径已被深入研究。花青素的生物合成途径通过phenylpropanoid途径是众所周知的8]。在这项研究中,转录组数据显示在基因的表达显著增加花青素生物合成途径暴露在外生血色素。花青素生物合成的结构基因,包括DFR,守护神,UDP-glycosyltransferase,表现出显著的微分表达式的血色素治疗(表4)。例如,两个DFR基因和一个守护神基因显著调节(表达增加18 - 30 -,和三倍hematin-treated水果、职责)。此外,所有六个基因编码UDP-glycosyltransferase显著的调节。其中,一个基因的表达(Fanhy_icon15742070o.1.g00001.1)是调节18305倍。结果表明,外生血色素可能是一个重要的角色在促进花青素生物合成。
花青素生物合成的基因 基因身份证 真正的叠化值 监管水平 罗斯福
Dihydroflavonol-4-reductase FANhyb_icon00002410_a.1.g00001.1 30.91 向上
黄酮醇合成酶 FANhyb_icon00015354_a.1.g00001.1 3.45 下来
异黄酮还原酶同系物 FANhyb_icon20341135_s.1.g00001.1 3.34 向上
UDP-glycosyltransferase FANhyb_rscf00004969.1.g00001.1 3.07 向上
UDP-glycosyltransferase活动 FANhyb_icon15742070_o.1.g00001.1 18 305.63 向上
UDP-glycosyltransferase 73 c1 FANhyb_icon00027696_a.1.g00001.1 2.98 向上
UDP-glycosyltransferase活动 FANhyb_icon00008064_a.1.g00001.1 2.49 向上
预测:UDP-glucose黄酮类3-O-glucosyltransferase 7 FANhyb_rscf00005563.1.g00001.1 2.12 向上
预测:76年UDP-glycosyltransferase f1-like FANhyb_rscf00002177.1.g00003.1 2 向上
表4
监管的度花青素生物合成来响应外源血色素。
3.4.3。度在应对血色素的激素信号转导

生长素已表现出负调控花青素生物合成基因的表达(42]。在这项研究中,有三个unigenes参与生长素的信号通路,以及所有被下调,包括一个基因编码生长素流出载体组件1 (AUX1-like)和两个基因编码生长素响应因素(ARF)。这些结果表明,血色素促进花青素积累在着色过程中调节生长素的草莓。它已经表明,生长素抑制花青素生物合成红色果肉的苹果愈伤组织(43]。内源生长素的表达(44,45)被发现在草莓阻碍花青素积累。在另外,细胞分裂素也扮演着一个重要的角色在花青素生物合成。它表明提高花青素积累玉米文化和规范花青素产量和成分悬浮草莓细胞(46]。在这项研究中,两个unigenes有关细胞分裂素信号通路,以及他们表达下调。一个基因被确定为细胞分裂素脱氢酶催化的五喜欢不可逆的细胞分裂素的降解。这一结果表明,血色素促进花青素积累通过调节细胞分裂素信号通路。

大量研究表明,阿坝花青素生物合成的调控中起着重要的作用在nonclimacteric水果(47]。在这项研究中,总共五unigenes ABA信号通路相关,其中两个是调节和三个表达下调。两个基因,参与了脱落酸反应,调节。这两个unigenes编码9-cis-epoxycarotenoid加双氧酶1 (NCED1)和ABA过度敏感5 (ABO5),分别。ABA合成通过几类胡萝卜素酶反应的质体。这些反应是催化的病原反应一步9-cis-epoxycarotenoid加双氧酶1 (NCED1) [48]。突变FaNCED1基因导致无色草莓果实,成为彩色通过外源ABA的应用12]。另一个unigene识别编码8′脱落酸羟化酶1,脱落酸的氧化分解代谢的关键酶,它是表达下调。应用外源ABA调节氨苯丙氨酸裂解酶活性和增加草莓果实的酚醛和花青素含量(12,49]。我们的研究结果表明,血色素促进ABA的生物合成和抑制ABA解体hematin-treated水果。

在拟南芥通过互动,雅会影响花青素积累的负面监管者MBW复杂的转录因子参与花青素生物合成(50]。收获前的应用是“富士“苹果提高红颜色51]。JA蒸汽治疗也可以加强在草莓果实花青素(52]。在这项研究中,jasmonate O-methyltransferase-like表现出显著的微分表达式。Jasmonate O-methyltransferase-like也是jasmonate-regulated植物对刺激的反应的一个关键酶(53,54]。这些结果表明,增加血色素的活动JA-regulated花青素生物合成。

3.4.4。度的光敏色素信号通路来响应血色素

植物色素作为感光细胞发挥重要作用在花青素监管15]。光敏色素是homodimeric色素蛋白,其中每个holophytochrome由光敏色素蛋白(apophytochrome)共价绑定到一个线性四吡咯PΦB。HO1是至关重要的这一过程,作为病原反应酶的生物合成PΦB [55]。外生血色素也可以诱发HO-1表现在许多植物56,57]。在这项研究中,我们发现外生血色素明显增加的表达FaHO1(表5)。这个结果意味着血色素能促进PΦB生物合成。最近,据报道,血色素可能诱发的积累的红光对于光敏色素光敏色素的成绩单小麦幼苗黄化的叶子的植物色素(26]。然而,我们的研究表明,植物色素没有差异表达。这可能是因为hematin-treated草莓在实验中没有阴影,而光敏色素的功能是依赖光。此外,我们发现光敏色素的下游基因,PIF3 (FANhyb_rscf00000669.1.g00002.1)显著调节。PIF3被认为是一个积极监管机构的光敏色素B由依赖光信号转导(58]。这些结果表明,光敏色素花青素生物合成途径可能参与的血色素。
花青素biosynthesis-related通路 注释的基因 基因身份证 真正的叠化值 Upregulation / downregulation 罗斯福
钙离子结合 阳离子/钙换热器五喜欢 FANhyb_rscf00001906.1.g00001.1 2.03 向上
Calpain-type半胱氨酸蛋白酶家族 FANhyb_icon00011755_a.1.g00001.1 3.45 下来
钙结合蛋白PBP1-like FANhyb_rscf00000750.1.g00008.1 3.23 下来
Calpain-type半胱氨酸蛋白酶家族 FANhyb_icon00023658_a.1.g00001.1 2.33 下来
细胞分裂素 细胞分裂素脱氢酶五喜欢 FANhyb_iscf00325393_1_s.1.g00001.1 6.67 下来
细胞色素P450 714 a1 FANhyb_rscf00000592.1.g00003.1 2.17 下来
Jasmonate Jasmonate O-methyltransferase-like FANhyb_rscf00000004.1.g00013.1 2.01 向上
脱落酸 蛋白脱落ACID-INSENSITIVE五喜欢 FANhyb_rscf00002164.1.g00001.1 4 下来
阿坝5过于敏感 FANhyb_icon00051144_a.1.g00001.1 2.91 向上
9-cis-epoxycarotenoid加双氧酶NCED1 FANhyb_icon18399909_o.1.g00001.1 4.41 向上
脱落酸8′羟化酶1 FANhyb_icon00000938_a.1.g00001.1 2.56 下来
脱落酸受体PYR1-like FANhyb_icon00020426_a.1.g00001.1 2.08 下来
生长素 生长素流出载体组件一样 FANhyb_rscf00001008.1.g00003.1 3.84 下来
生长素响应因子8 FANhyb_rscf00001306.1.g00002.1 2.63 下来
生长素响应因子17-like FANhyb_rscf00006074.1.g00001.1 2.17 下来
淀粉和蔗糖 糖基转移酶、家庭35 FANhyb_rscf00000034.1.g00008.1 3.84 下来
可溶性淀粉合酶3 FANhyb_rscf00000045.1.g00004.1 2.32 下来
蔗糖转运蛋白SUC2-like FANhyb_icon00036727_a.1.g00001.1 4.55 下来
蔗糖转运蛋白SUC2-like FANhyb_rscf00000755.1.g00002.1 3.23 下来
可能的蔗糖磷酸合成酶4-like FANhyb_rscf00001350.1.g00002.1 2.13 下来
光敏色素 预测:转录因子PIF3-like FANhyb_rscf00000669.1.g00002.1 3.46 向上
光敏色素e FANhyb_rscf00000436.1.g00004.1 4 下来
血红素加氧酶1 FANhyb_icon00004395_a.1.g00001.1 2.58
表5
其他度确定花青素biosynthesis-related通路。
3.4.5。在淀粉和蔗糖降解度

蛋白质组学方法显示,淀粉降解导致花青素积累的块茎状的根紫色甘薯品种(59]。淀粉和蔗糖合成对在草莓果实花青素积累很重要60]。在这项研究中,我们发现度参与淀粉和蔗糖合成hematin-treated水果都表达下调(表5)。例如,unigenes编码的表达可溶性淀粉合酶3,蔗糖运输蛋白质SUC2-like,和可能的蔗糖磷酸合成酶4-like酶下降2.3,4.6,3.2,和2倍。这表明,外生血色素调节的生物合成淀粉和蔗糖,因此影响果实着色。

3.4.6。度的钙通道响应血色素

钙还可以增加关键结构基因的转录水平F3H,DFR,蚂蚁,和UFGT在草莓的白色的阶段61年]。在这项研究中,我们发现三度钙生物合成和运输中表达下调hematin-treated水果(表5)。只有unigene编码预测阳离子/钙换热器五喜欢调节。unigenes编码calpain-type半胱氨酸蛋白酶和预测PBP1-like钙结合蛋白表达下调,分别。外源钙的应用能促进苹果着色(62年)除了花青素含量的变化(61年]。我们的研究结果表明,钙的生物合成和运输参与着色的发展hematin-treated草莓。

3.5。验证中存在的选择度

验证的表现度获得RNA-Seq,存在选择11度,包括结构基因(DFR和UDFGs),转录因子基因(MYB和bHLH)和光敏色素chromophore-related基因(HO-1)。补充表中列出所使用的引物中存在S1。存在结果符合RNA-Seq数据(图4),除了FANhyb_rscf00000141.1.g00016.1,更高的日志2比(hematin-treated /控制)转录组数据中存在。这些结果表明RNA-Seq草莓转录组的数据是可再生的和准确的。

4所示。结论

在这项研究中,草莓果实中的花青素含量升高是由外生血色素的应用。这是第一个报告,血色素会增加花青素生产水果。此外,我们探讨了影响外生血色素的代谢途径使用全基因组转录组分析。结果表明,花青素生物合成过程中所涉及的许多基因表达水平与血色素明显改变治疗。这表明,果实颜色的生理过程监管发展是通过花青素生物合成途径之间复杂的互动,植物激素信号转导途径,光敏色素信号转导途径,淀粉和糖代谢途径,钙通道和转录因子(图5)。这项研究增加了草莓果实着色过程的深入理解。


图5
基因和生物通路参与监管的花青素积累促进血色素。代表了细胞壁外层框。双层椭圆形代表质体。红棕色环和网络代表核和内质网,分别。红新月会代表液泡。原子核中的盒子代表转录因子(TFs)。黄MYB、绿色WD40,红bHLH代表三元复杂的转录因子,转录花青素生物合成基因。圆圈中的数字代表生物通路参与花青素积累的规定由血色素。①代表了光敏色素调节通路。②代表了淀粉和蔗糖通路。 ③, ④, ⑤, and ⑥ represent phytohormones ABA, JA, Auxin, and CTK regulation pathways, respectively. ⑦ represents the Ca2 +监管途径。再生能源代表了远红外的光敏色素。PIF3代表phytochrome-interacting因素。每个花青素生物合成调控通路相关基因在表5。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

健胃高和呆在王的构思和设计研究。易,华阴Li Fengde Wang Jingjuan李,张易汇进行实验。李易分析数据。易和李Fengde王写的手稿。所有作者阅读和批准了手稿。易李和李华阴贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了山东省现代农业产业技术体系的资金,中国(sdait - 02 - 022 - 04),中国农业研究系统(CARS-25),中国和美国国家科学基金会(31401820)。

补充材料

图S1。草莓果实中的花青素含量测定治疗后与不同浓度的血色素(0,1,10和100μm)。竖线代表标准错误;值和不同字母p < 0.01明显不同。图S2。饱和的分析控制,控制2、血色素1,血色素- 2 mRNA库。(TIFF);图S3。随机性评估控制,控制2,血色素1,血色素2 mRNA库。(TIFF); Table S1. Eleven pairs of gene specific primers of the DEGs in strawberry fruit. Table S2. Gene classification based on gene ontology and pathway terms for DEGs treated by hematin.

  1. 补充材料

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