CRISPR-Cas9-Induced基因组编辑的力量加快育种速度

文摘

基因组编辑与设计核酸酶使定点序列修改熊一个先进的植物育种和作物保护潜力巨大。值得注意的是,RNA-guided酶技术(RGEN)定期根据集群空间短回文的重复序列(CRISPR)和CRISPR-associated蛋白9 (Cas9)是一个非常强大和简单的工具,来革新基础研究和植物育种。在这里,我们审查的主要技术进步和最近的应用程序CRISPR-Cas9操纵系统模型和作物的植物基因组中。我们还讨论这项技术在分子植物育种的前景。

1。介绍

人口快速增长的压力下,气候变化,和农业害虫和疾病,下一个绿色发展新技术需要解决并提供新颖的遗传变异提高产量、质量,和阻力在植物对生物和非生物压力。在过去的二十年里一些作物的基因组已经被引入一个或多个外源基因改变的农艺值来克服传统育种技术的局限性。承诺等批评转基因作物一直在集中讨论其他评论(例如,1- - - - - -3]),超出了本文的范围。或者更强大,基因组编辑允许精确的、可预测的变化对作物遗传材料,目前这不作物育种(例如,4- - - - - -7])。

基因组编辑与特定场地核酸酶介绍DNA双链断裂(双边带)在目标站点,刺激细胞DNA修复机制,随后导致各种类型的基因修改等有针对性的突变,基因插入,或基因替换。真核细胞中的两个主要的双边带修复途径nonhomologous end-joining (NHEJ)和同源重组(人力资源)。NHEJ常常会导致插入或删除,有可能产生一个基因敲除。当修复模板(区域的同源序列周围争端解决机构)可用,可以招募人力资源机制实现精确的修改(homology-directed修理,HDR),如基因置换或基因插入(图1)。显然,NHEJ是最普遍采用双边带修复机制在许多生物体,包括高等植物(8,9]。

基因组编辑CRISPR-Cas最新突破性的技术系统,它的灵感来自于细菌适应性免疫对抗入侵的噬菌体。2012年8月,集团的詹妮弗·a . Doudna加州大学,伯克利分校和Emmanuelle贝纳在瑞典于默奥大学(现在在柏林感染的马克斯普朗克研究所生物学)(10)首次显示,单体的DNA核酸内切酶,称为Cas9,酿脓链球菌能被电脑减少特定基因组双链DNA序列使用互补的碱基配对single-guide RNA (sgRNA,图吗1)。可能利用这个简单的系统在真核基因组编辑系统(人类、老鼠)的工作了几个月后,冯张集团在麻省理工学院(MIT)11哈佛大学)和乔治·教会的组织(12]。在这些研究中,只有一个表达式的构建Cas9核酸酶和专门设计的sgRNA需要转换。自那时起,由于其易于实现和鲁棒性基因组工程CRISPR-Cas9系统已经广泛应用在不同的生物体,包括植物(13- - - - - -15],昆虫[16)、鱼(17,兔子18)、猪(19],老鼠[20.],猴子[21),和人类细胞22,23]。大量的出版物使用CRISPR-Cas9技术来快速自第一报告和提升系统的理解和应用。我们审查的主要植物基因组编辑技术的进步使用Cas9 RNA-guided核酸内切酶(RGEN)并讨论其应用以及分子植物育种的前景。

2。基因组编辑CRISPR-Cas9系统的概述

CRISPR-Cas9技术的巨大的多功能性基因组领域的编辑是由于它的简单性、效率和鲁棒性。基本上,CRISPR-Cas9工具由两个主要组件,交付一个质粒(图1(一)):细菌Cas9核酸内切酶蛋白和一个包含20个基点的专门sgRNA目标DNA序列同源(称为protospacer)。目标DNA的乳沟的先决条件是一个序列的存在5′-NGG-3′(10)或5′-NAG-3′(24]随着守恒protospacer-adjacent主题(PAM)。重要的是,它已经表明,多个sgRNA针对不同基因位点可以同时实现高效利用多路复用基因组工程不需要额外Cas9蛋白(11,12]。此外,一些最初的体外和体内的证据表明Cas9核酸内切酶活性不受DNA CpG甲基化的影响(24]。然而,sgRNA优先结合开放的染色质区域包括非目标网站(25,26]。进一步改善我们的理解的影响染色质目标站点的可访问性和表观遗传环境的效率CRISPR-Cas9系统是必要的。

主要的担忧关于CRISPR-Cas9基因组编辑系统的实现是偶尔脱靶的修改在一些研究报告(11,12,24,27- - - - - -29日]。尽管20基点识别序列sgRNA最初认为必要确定特异性,后来表明,7 - 12英国石油公司之间的完美匹配的3′末端sgRNA(称为种子区域)和等效目标DNA的地区带来目标站点识别和乳沟,而多个不匹配PAM-distal地区一般容忍(24,27- - - - - -29日]。几个策略也已经被开发出来,以控制CRISPR-Cas9的特异性,在sgRNA的设计被认为是一个重要且容易实现。的指导方针和在线工具已经开发促进独特的目标站点的选择高质量的生物全基因组序列是可用的(24,30.,31日]。截断sgRNA 17 bp的长度或细长sgRNA 2额外胍残留的5′端可以减少不属预定目标的突变(32,33]。低表达水平的Cas9核酸酶是另一种减少脱靶活动(29日,34]。

使用最广泛的Cas9核酸酶来源于II型(二班)CRISPR-Cas9系统酿脓链球菌(SpCas9)。然而,Cas9 orthologues从其他细菌物种也适用,可能提供当前CRIPSR-Cas9系统的进一步优化。例如,Cas9基因的金黄色葡萄球菌(SaCas9)比短1 kb链球菌,可能改善其稳定变换向量(35]。有趣的是,另一个截然不同的PAM SaCas9目标5′NNGGGT3′。另一方面,一个新的核酸内切酶的二班CRISPR-Cas系统,Cpf1 (CRISPR普氏菌和弗朗西斯氏菌属1),据报道需要T-rich PAM主题上游的目标站点和生成一个双边带悬臂5′(36]。找到进一步Cas9核酸酶需要不同PAM图案可能允许针对更多样的基因位置,使开发更复杂的应用程序通过使用组合这些Cas9基因组工程。

详细了解的分子结构CRISPR-Cas9系统指导我们理性地设计和定制Cas9酶的变异。晶体结构的SpCas9 SaCas9,弗朗西斯氏菌属novicidaCas9 (FnCas9),或Cpf1复杂sgRNA和双链dna(目标37- - - - - -41)是解决,揭示不同PAM RNA-guided DNA的识别和定位的机制Cas9核酸酶。几个工程CRISPR-Cas9变异增加生产Cas9特异性或改变PAM识别模式(42]。Cas9 nickase变体(Cas9-D10A或Cas9-H840A)包含一个不活跃的核酸酶领域坚持只有一个DNA链创建带着一长串打破在目标网站。一双诱发裂纹,一个在每个链和100 bp除了彼此,会导致双边带过剩。这种方法使用Cas9 nickase可以显著减少非目标突变速率(43,44]。此外,融合催化地活动Cas9 (Cas9-D10A-H840A dCas9)和FokI核酸酶,该功能只作为一个二聚体,显示比较结果指导下一双sgRNAs时(45,46]。有趣的是,dCas9可以利用不仅在基因组编辑,而且在许多其他应用程序,如修改基因表达的47],表观遗传编辑[48),和可视化的特定DNA序列在活细胞49]。

3所示。植物和作物基因组编辑技术的主要进步使用Cas9 RNA-Guided内切酶(RGENs)

CRISPR-Cas9系统能够精确切割DNA的任何生物基因工程提供了一个前所未有的工具。后不久证据表明CRISPR-Cas9系统的工作原理在动物模型中,三篇论文的表达和活动报道plant-codon-optimized CRISPR-Cas9植物种类的模型拟南芥(拟南芥)和烟草(烟草benthamiana)以及在水稻和小麦等农作物50- - - - - -52]。这第一组展示了通用性的技术通过使用不同的瞬态或稳定转换平台(原生质体转染、叶agroinfiltration和粒子轰击的愈伤组织),以生成小删除和/或插入,插入,和多路复用基因组的修改。此外,传染给后代和CRISPR-Cas9-induced孟德尔遗传变异使用农杆菌属调节生殖细胞系转化拟南芥(14,15,53,54和大米55- - - - - -58),这表明CRISPR-Cas9系统可以在作物基因组编辑成为一个强大的工具。后续工作报道高粱CRISPR-Cas9工具的成功应用(13)、小麦(59)、玉米(60],甜橙[61年,番茄62年),土豆63年),苔类Marchantia polymorphal . (64年)、大麦和芸苔属植物oleracea(65年,大豆66年],甜瓜[67年),和杨树68年]。总结的信息转换为CRISPR-Cas9-based应用程序/交付方法和表达系统在植物中可以找到最近的评论(69年,70年]。需要强调,这项技术传播的高度提升CRISPR研究社区,提供开放获取的质粒,web工具和活跃的讨论组(表1)。

由于植物基因组是大型的、复杂的,往往多倍体,不相干的突变可以发生在基因组工程。当引入gRNA-Cas9乳沟大米、谢和杨71年]报道1.6%的突变速率在一个非标靶序列,一个不匹配位置15 bp近端PAM。脱靶效应CRISPR-Cas9已经观察到在其他植物物种,包括大豆(72年)、玉米(73年),和大麦b . oleracea(65年]。相比之下,没有不相干的突变事件可以发现在研究公认的非目标网站拟南芥、烟草、小麦、大米、甜橙(14,50- - - - - -52,58,59,61年),即使使用全基因组测序(14]。值得注意的是,在植物育种问题不相干的事件是低于临床研究因为脱靶突变的突变可以隔离远离目标跨越突变体与野生型植物。然而,穿越过程可以费力、耗时,甚至可能多年生植物和作物超低温保存,如马铃薯、香蕉、木薯。日常问题可以通过优化sgRNA克服设计(74年,75年)或通过高保真CRISPR-Cas9方法更精确Cas9变体(如,[76年]),配对Cas9 nickas或dCas9: FokI融合。的应用Cas9-D10A nickase拟南芥表明非目标效应可能会避免通过使用一双nickas [15,77年]。

CRISPR-Cas9技术的主要应用在基因组编辑(或反向遗传学研究)是基因敲除,因为宿主细胞优先修复Cas9-induced双边带通过NHEJ途径“出错”往往导致短暂的插入或删除。这些修改和之间的比例的大小插入和删除可能影响进化基因组大小和直接基因组大小(78年,79年]。CRISPR-Cas9工具的灵活性使相邻站点的目标染色体特定删除不必要的DNA序列,从几kb拟南芥(52,53),烟草(30.),和西红柿62年]245 kb的大米58]。CRISPR-Cas9还可以利用基因敲除基因家族的多个基因在水稻80年]或部分同源的基因在六倍体小麦面包(81年,82年]。多路复用的CRISPR-Cas9工具箱等模式植物基因组编辑了拟南芥、烟草和水稻[83年]。为了执行高度复用基因操作,使用Cas9 CRISPR-Cas系统orthologues金黄色葡萄球菌(SaCas9)和乳酸链球菌(St1Cas9)改编的拟南芥(84年]。此外,修改Cas9变异使目标在水稻中的PAM网站(85年),提供一个广泛的基因组编辑。

的基因插入(“特征叠加”)或更换需要利用修复Cas9-induced双边带的人力资源途径。HDR事件需要与目标模板序列同源基因(图1,(8])。然而,HDR频率CRISPR-Cas9-mediated基因打靶大米所示(GT)相当低(50烟草(),52),在拟南芥(53,55]。通过使用大约670个基点同源性的突破,Schiml et al。77年]可以1.8 kb标志基因插入一个内源性基因的拟南芥频率为0.14%。为了克服目标基因操纵的HDR效率低在哺乳动物细胞中,组件NHEJ通路的抑制(86年]。同样,通过操纵DNA连接酶IV (NHEJ通路成员),CRISPR-Cas9-induced HDR-mediated GT可以在大米工作更有效率,从而导致biallelic植物(87年]。另外,设计合理的取向、极性和捐赠ssDNA匹配长度Cas9-DNA复杂的属性可能会增加HDR事件(88年]。理想情况下,HDR-mediated基因修改的效率将会提高提供足量的序列为HDR修复Cas9-targeted供体。转换方法使用核复制DNA病毒(89年)产生的多个副本捐赠者序列HDR植物细胞内最近演示了生成高频、茄(精确的基因修改90年]。

4所示。未来的视角CRISPR-CAS的植物育种技术

CRISPR-Cas9技术革新基因组工程和装备科学家和育种者有能力精确修改植物的DNA。重要的是,CRISPR-Cas9使基因组修改也在潜在的农作物的基因操纵一直是一个挑战(如浮萍91年]),提供高质量的全基因组序列(92年,93年)和高效转换过程可用(94年]。本文不涉及伦理、法律和社会问题的革命性工具(等方面,请参阅[2- - - - - -4,95年])。在这种背景下,有必要注意,常见的白色蘑菇(双孢蘑菇)它已被修改为抵制布朗宁使用CRISPR-Cas9成为第一个CRISPR-edited有机体可以种植及销售我们没有进一步的监管法规(96年]。有趣的是,CRISPR-Cas9没有转基因作物的足迹的方法提供了遗传操作提供预装配的Cas9-sgRNA核糖核蛋白(97年)或通过体外转录的瞬时表达式Cas9-coding序列和sgRNA [82年),因此可能不是归类为转基因生物和受现有生物安全法规。

CRISPR / Cas9-induced基因组编辑的主要力量是为针对多个站点同时提供一个机会。这项技术的新应用程序授予多个病原体抗性作物。通过建立CRISPR-Cas9-like免疫系统、烟草和拟南芥是对甜菜严重卷曲的前病毒(98年),豆黄矮病毒(99年),分别和番茄黄卷叶病毒(One hundred.]。最近开发了CRISPR-Cas系统与可编程RNA识别和乳沟101年适用于植物]将是激动人心的,因为大多数植物病毒RNA病毒(102年]。然而,进一步的研究将需要监控的稳定电阻在一代又一代和在不同的栖息地103年]。

CRISPR-Cas9引发了创新应用在几个领域,包括农业。CRISPR-edited生物个体可能传播积极选择基因在野生种群在所谓的基因驱动过程。原则上,这样CRISPR-based基因驱动系统可以对人类是有益的,例如,可能通过防止疾病的传播,或支持农业,农药和除草剂抗性昆虫和杂草,和控制有害外来物种(104年]。基因驱动器只能在有性生殖的物种和传播明显只有在物种繁殖很快。基因驱动模型已经在酵母测试(105年)和第一CRISPR-Cas9-engineered蚊子最近开发抗击疟疾(106年]。然而,由于低效率的同源重组,基因驱动应用程序来消除或减少外来植物物种在一个给定的区域仍然是具有挑战性的。此外,因为这种技术可能对野生种群构成巨大的改变,生物安全预防措施和措施是必要的(更多细节,请参阅[107年,108年])。重要的是,CRISPR-Cas9-mediated基因驱动技术(称为诱变连锁反应(MCR) [109年)可以用来产生稳定的纯合子(biallelic)突变体行通过使用HDR-driven传播CRISPR-Cas9-cassette的同伴染色体。此外,这样的概念也可以申请编辑细胞器基因组(例如,叶绿体)为了克服基因组的高拷贝数和降级的突变110年]。

直到现在合成生物学仅限于细菌模型工程师全新的代谢途径。CRISPR-Cas9技术打开了一个更简单的方法使用合成生物学在更复杂的系统中,例如,在作物农艺性状(111年]。由于许多复杂的植物的代谢途径相互作用和控制由多个组织或development-specific监管机构、代谢工程在植物不仅可能需要多个基因打靶也可能微调多个基因表达水平在不同的组织或发育阶段。对于这样复杂的应用程序,修改或定制CRISPR-Cas9系统包括(1)特定Cas9——/ sgRNA表达启动子(例如,112年,113年),(2)修改Cas9基因表达的表观遗传变化(例如,(47,48),(3)不同Cas9变体的组合(例如,[35,36])扩大目标区间的基因组,和(4)高效技术提高HDR-driven精确基因替换将需要进一步开发或优化特定的细胞或生物体。CRISPR-Cas9技术的快速发展在过去的4年,下一个绿色革命的承诺与会议新作物长期代谢工程的要求(例如,植物可以解决自己的氮,有更好的营养价值,可以有效地用于生物燃料的生产,或显示增强光合能力(114年)可能会在不久的将来实现。

缩写

CRISPR:	集群定期中间短回文的重复序列
Cas9:	CRISPR-associated蛋白9
双边带:	DNA双链断裂
GT:	基因打靶
人力资源:	同源重组
NHEJ:	Nonhomologous end-joining
sgRNA:	Single-guide RNA
帕姆:	Protospacer-adjacent主题
RGEN:	RNA-guided核酸内切酶。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Ingo舒伯特的莱布尼茨植物遗传学和作物植物研究所(IPK)的批判阅读手稿。

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