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国际基因组学杂志
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国际基因组学杂志/2016年/文章
特殊的问题

农业基因组学的承诺

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2016年 |文章的ID 2095195 | https://doi.org/10.1155/2016/2095195

彭,Liantai苏、爱民Lv盛银Wang Bingru黄元一个, ”基因表达分析,对苜蓿幼苗应对Acid-Aluminum”,国际基因组学杂志, 卷。2016年, 文章的ID2095195, 13 页面, 2016年。 https://doi.org/10.1155/2016/2095195

基因表达分析,对苜蓿幼苗应对Acid-Aluminum

彭周,1 Liantai苏,1 爱民Lv,1 盛银王,1 Bingru黄,2 和 元一个1,3

1农业与生物学院,上海交通大学,200240年上海,中国

2植物生物学和病理学、罗格斯大学、美国08901年新泽西州新不伦瑞克

3城市农业重点实验室(南),农业部,201101年上海,中国

学术编辑器:Wenwei熊
收到了 2016年7月27日
接受 2016年10月12日
发表 2016年12月15日

文摘

Acid-Aluminum (Al)是有毒的植物和极大地影响全球作物生产。理解植物酸性土壤和铝毒性的反应,我们对全球使用微阵列基因表达数据与治疗acid-Aluminum苜蓿幼苗。3926个基因被识别显著上升或下调反应3 +离子与pH值4.5治疗,其中66.33%被发现的根源。其功能分类主要是参与植物激素调节、活性氧和转运蛋白。基因本体论(去)浓缩和KEGG分析表明phenylpropanoid生物合成,苯丙氨酸代谢,类黄酮生物合成中起到了至关重要的作用在防守在苜蓿铝压力。此外,我们发现,诸如MYB转录因子和家庭WRKY蛋白质可能也参与调节活性氧反应和类黄酮的生物合成。因此,全球基因表达谱的发现提供了洞察acid-Al压力的植物防御机制在紫花苜蓿。理解的关键调控基因和通路将有利改善作物生产不仅在苜蓿还在其他作物acid-Aluminum压力。

1。介绍

铝(Al)结合酸的主要因素是限制植物生长和作物生产在全球范围内(1]。艾尔在土壤可溶性离子形式,特别是当土壤pH值下降到低于5。根是植物acid-Al毒性的主要目标。几项研究已经报道Al细胞伸长和抑制细胞分裂在植物根部2- - - - - -4]。根顶点(特别是根的远端过渡区)已被证明是一个重要的铝毒害的看法(5]。周et al。6]报道了铝离子的存在在细胞壁,细胞内的膜,紫花苜蓿的根细胞中细胞核的中心。此外,大量研究表明3 +改变生理过程(即。、胞质钙2 +体内平衡和细胞骨架动力学)和修改的内源性一氧化氮水平根技巧(7- - - - - -9]。

Al-induced高亲和力的毒性是由各种细胞外和细胞内的物质。大多数报告表明,有机酸(OAs)中扮演重要角色的机制植物容忍Al压力(10]。植物也有其他机制来应对压力。酚类化合物如类黄酮、生物碱、萜类化合物和苷形成强大的复合物与铝离子,这些化合物与内部Al解毒茶树和其他Al-accumulating物种(11,12]。基德et al。13)报道,微分耐铝玉米基因型表现出更好的率相关性Al-stimulated根分泌的类黄酮(儿茶素和槲皮素)与Al-activated美洲国家组织的分泌。其他研究表明,诱导antiperoxidation酶可以改善铝引起的氧化损伤应力和导致各种植物耐铝表型(14,15]。

提出了许多基因和信号通路参与植物的应激反应(16- - - - - -19]。一群Al-induced基因,如wali1-5小麦(小麦),Sali5-4a和Sali3-2在大豆(大豆),ALS3在拟南芥,已确定和特点20.- - - - - -22]。紫花苜蓿l .(紫花苜蓿)酸和铝离子很敏感。酸性土壤的紫花苜蓿产量抑制由于减少固氮和破坏共生菌(23]。然而,铝药害的底层机制在分子水平上对根增长尚不清楚。在这里,我们使用微阵列分析来考察全基因组转录分析和生物信息学数据挖掘研究丰富基因本体和代谢途径。所确定的基因,这是艾尔应力下的差异表达,一起代谢途径从微阵列分析,所获得的信息将提供一个信息平台,培养Al-tolerant物种在未来改善农艺特性。

2。材料和方法

2.1。植物材料和治疗

紫花苜蓿(wl - 525),这是一个Al-tolerant品种(24,25),获得了国家种子公司(印度新德里)。健康的种子均匀大小surface-sterilized 0.5% (v / v)次氯酸钠溶液用重蒸馏的水反复清洗。干燥后用吸墨纸,种子放在两层滤纸的培养皿中。滤纸是浸泡在CaCl 2毫升的0.2毫米2解决方案包含0 (pH值6.0),0 (pH值4.5),0.8 (pH值4.5)或3.2 (pH值4.5)毫米间变性大细胞淋巴瘤引起3。pH值调整的1 M盐酸。环境控制增长的实验房间14 h / 27°C和10 h / 25°C昼夜周期,480年的光强度μ摩尔·米2·年代−1、相对湿度 %。发芽后60 h,绿色的幼苗子叶和形成根源被定义为成功发芽并幸存下来。苗没有绿色子叶或形成根被认为是死亡和失败的萌发。然后我们计算根据这些定义萌发和存活率。所有的实验都重复三次。整个幼苗(根,茎,叶)发芽的0 (pH值6.0),0 (pH值4.5),0.8 (pH值4.5),和3.2 (pH值4.5)毫米间变性大细胞淋巴瘤引起的3收集,在液态氮冷冻7分钟,然后储存在微阵列分析−80°C。

2.2。微阵列分析

种子发芽的0 (pH值6.0),0 (pH值4.5),0.8 (pH值4.5)或3.2 (pH值4.5)毫米间变性大细胞淋巴瘤引起的3收集了60 h和用于微阵列分析。总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)从发芽苜蓿样本。总RNA进行评估的质量和完整性安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦科技有限公司(Santa Clara) ( / 和RIN≥9.0)。核糖核酸纯化、根据一种颜色芯片微阵列杂交进行基因表达分析协议。RNA样本(3μg)提取每个池形成四组(称为苗发芽在0 (pH值6.0),0 (pH值4.5),0.8 (pH值4.5)或3.2 (pH值4.5)毫米间变性大细胞淋巴瘤引起360 h)的解决方案。互补的RNA池被用作模板准备。互补脱氧核糖核酸进一步转录成cRNA double-labeled使用安捷伦低RNA荧光线性放大输入设备(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。然后,0.5μg标记cRNA样品的纯化,混合杂交缓冲,杂化寡核苷酸微阵列(Medicago基因表达4×44 k;美国安捷伦科技公司,圣克拉拉,CA;http://www.genomics.agilent.com/在65°C) 17小时。微阵列设计基于RefSeq(32)发布,UniGene(构建33),TIGR植物转录程序集(版本2),和TIGR基因指标(版本9)和包含43803寡核苷酸探针(60米)。杂交后,使用基因表达载玻片被清洗缓冲工具包(安捷伦)和扫描Genepix 400 b(轴突仪器,福斯特城、钙、美国)。荧光强度是计算使用特征提取软件9.5版本(安捷伦)和数据进行了分析与GeneSpring GX软件11.0版本(安捷伦)。整个实验生物学重复三次,和微阵列数据被GeneSpring GX 11.0归一化。

成绩单有超过两个差异Al压力下的幼苗生长在指定统计截止(褶皱(FC)≥2.0和改变 根据 测试)被定义为差异表达基因。

2.3。实时定量rt - pcr (qPCR)

来验证我们的芯片结果,总RNA提取苜蓿幼苗与不同浓度的AlCl发芽3解决方案使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。生成第一链cDNA RETROscript工具包(英杰公司)使用益生元(dT)引物和RETROscript RTase。然后,我们检查了17个基因不同,或表达下调后3 +治疗(FC≥2.0 t使用qPCR测试)。17基因主要是参与phenylpropanoid和类黄酮生物合成途径(基于AgriGO和KEGG分析)或转录因子(TFs)可能与代谢途径(26,27]。特定的引物用于qPCR被列在表中1。这些引物用于验证(FC≥2.0,差异表达基因 ;t从微阵列分析获得的测试)。简单地说,25μL qPCR放大混合物包含25 ng模板cDNA、12.5μL 2 x SYBR绿色我主人混合缓冲(应用生物系统公司),和300海里的每一个正向和反向引物。反应是运行在5700年ABI棱镜序列检测器(应用生物系统公司)。PCR协议如下:聚合酶激活和predenaturation 4分钟在94°C,紧随其后的是40周期在94°C 30年代,30年代58°C, 72°C 30年代。我们选择了三个基因(EF -α,18 s rRNA,泛素;引物中列出的表1,加入数字:XM_003618727基因库,DQ311983基因库,和TC174254丹娜-法伯癌症研究所(DFCI)职责。)作为内部控制。他们的几何平均数 被用来作为内生控制。每个qPCR反应是重复三次。所有PCR效率高于95%。结果序列检测软件(版本1.3,应用生物系统公司)导出为文本文件并导入到Microsoft Excel一样进行进一步分析。的平均变异系数(基于计算量)的重复样品是6%。
探针的名字 描述 提出了序列 相反的顺序 加入数量
A_27_P077456 过氧化物酶- 456 5′-AGGAAATCTAAGGTGGCAACTG-3′ 5′-TTTAGGTAAGCCAGGAATGTGG-3′ TC192119 (DFCI)
A_27_P091936 抵抗蛋白- 936 5′-ATCGTGGAATGGGAAAGACAAC-3′ 5′-CCAGGACCAAACCAATCAAGT-3′ TC181653 (DFCI)
A_27_P015415 WRKY 11 5′-TCATTTCCTCTGGCAAGCCT-3′ 5′-TCAGCGACCTTTGAACTTATCG-3′ TC175297 (DFCI)
A_27_P274912 CCCH29-LIKE 5′-CAAGAGGGAAGTAGATGAGAAGGA-3′ 5′-CAACAGCACAATGAAGAGCAG-3′ TC199223 (DFCI)
A_27_P133981 Myb-like 5′-AGAGGACAATGGGAAAGAAGAC-3′ 5′-CAGCACTTGATGCCTAAGACA-3′ TC183988 (DFCI)
A_27_P155316 Nbs-containing抵抗蛋白质 5′-AACGCTCTGAACAACGAGGA-3′ 5′-CACCGAAATCACACTCCGAG-3′ XM_003588950
A_27_P055706 Peroxiredoxin-chloroplastic-like 5′-GAATCCACCTTCTCCTACCTCG-3′ 5′-CTTCAAATCCTCCTTCCACGC-3′ TC185056 (DFCI)
A_27_P181166 MYB an2 5′-GGACATACGAGGAAGACAACTTAC-3′ 5′-CCTTCCAGCAATCAATGACCAT-3′ XM_003621524
A_27_P050191 Pathogenesis-related蛋白4 5′-TGGTTACGGGATGTCTCAAGG-3′ 5′-TTTGGTGTTGGTGTTGGTGC-3′ TC183745 (DFCI)
A_27_P162931 bHLH120 5′-TCAACCACCACCAACATCAC-3′ 5′-TGAAGGGTAGCCATTTCTTGTC-3′ TC190718 (DFCI)
A_27_P111336 过氧化物酶43-like 5′-GTCCAGGAGTGGTTTCTTGTG-3′ 5′-CTGTGAGACCCTTGTTTAGGAAC-3′ TC190043 (DFCI)
A_27_P036981 过氧化物酶12-like 5′-TTCCTCTGTTCTGGCTAATGGT-3′ 5′-AGCACCTGAAAGGGCAACTA-3′ TC196923 (DFCI)
A_27_P104616 bZIP60 5′-ATCCTTCTGTTTCCGTCGCA-3′ 5′-TCCCTGTTCCTCATCTGCCT-3′ TC180070 (DFCI)
A_27_P136211 WRKY 22 5′-CCCTAAAGAGCCTGAACAAGTC-3′ 5′-GCTTCGTGGATAAGGTGAACC-3′ TC196399 (DFCI)
A_27_P123906 DREF1 5′-CCTTCCTATTCCAGCAACTTCC-3′ 5′-CCTGTTCATCAACTTCCACACA-3′ TC182024 (DFCI)
A_27_P045576 花青素reductase-like 5′-CATTTACCGACCCTGCTGGT-3′ 5′-TCTCTGCCCTCATCTTGCCT-3′ TC186981 (DFCI)
A_27_P060501 83年P450 b1-like 5′-GTTTGTAGGACTGCGTTCGG-3′ 5′-TTCGTGTGGAGGCAACTTCT-3′ TC173827 (DFCI)
N EF -α 5′-GCACCAGTGCTCGATTGC-3′ 5′-TCGCCTGTCAATCTTGGTAACAA-3′ XM_003618727
N 18 s核糖体RNA基因 5′-TCAGAGGATGGCGACGAAG-3′ 5′-CCGTTGCCGAGAGTCATTCT-3′ DQ311983
N 泛素 5′-CTCACTGGAAAGACAATCACCC-3′ 5′-GAAGTCGCAACACAAGATGGA-3′ TC174254 (DFCI)
表1
引物序列用于qPCR。
2.4。浓缩和KEGG分析

去进行功能富集分析使用奇异富集分析AgriGO(海)(http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/)[26]。米加数据作为背景参考,和超几何测试被用于统计分析。去上可分为三类:生物过程,细胞组件,和分子的功能。所有重要去中学条款可以用来生成一个flash条形图显示过多的术语在所有三个类别。显著的基因去类别受到分层聚类分析使用《创世纪》和《京都议定书》(KEGG)基因和基因组分析的百科全书。

2.5。统计分析

所有结果中显示数据均值±SE的至少三个复制。之间的显著差异和治疗由方差分析统计评估使用SAS 9.0版(SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国)和统计学意义 。分析的226个基因之间的相关系数显著富集去使用SAS 9.0条款执行。TFs和代谢的基因之间的关系也进行了研究。相关系数的基因 或 (特别是基因编码TFs之间和metabolism-associated基因)进行了选择和分析(表3)。

3所示。结果

3.1。幼苗存活率

紫花苜蓿种子萌发的拒绝与增加的铝离子浓度从0毫米到1.6毫米,而幼苗存活率逐渐降低了从1.6到6.4毫米。然而,当铝离子的浓度增加到12.8毫米的pH值3.6,存活率下降到5% ( ;图1)。根据回归方程曲线如图1,铝浓度可以分为三个范围根据其存活率在苜蓿:浓度大幅下降引起的0 - 1.6毫米Al萌发和存活率;1.6 - -6.4毫米Al引起逐渐下降;6.4 - -12.8毫米Al导致大多数急剧下降。尽管我们试图代表我们的实验设计,每一个阶段是挑战性的足够的组织下6.4 - -12.8毫米。因此,紫花苜蓿种子发芽的治疗在0μ米艾尔3 +(pH值6.0),0μ米艾尔3 +(pH值4.5),800年μ米艾尔3 +(pH值4.5),和3.2毫米3 +(pH值4.5)被用于进一步的微阵列分析。


图1
存活率下紫花苜蓿的压力。回归方程和相关系数的平方。根据回归方程曲线,铝浓度影响苜蓿萌发可分为三个区域,我的急剧下降(地区);二世逐渐下降;三世突然下降(地区B)。
3.2。微阵列数据质量评估

使用两个测量数据质量评估。首先,相关性> 0.96获得了在三个生物复制所有的治疗进行了分析。主成分分析表明,幼苗处理或不3 +在pH值6.0或4.5(图分布在不同的组2)。数据点之间的区别来自不同样本治疗实验管道进行验证。其次,我们使用qPCR验证17基因的表达谱。结果高度一致的微阵列数据分析( ; )(图3)。综上所述,在本研究中获得的微阵列数据是可靠的进行进一步的研究。


图2
微阵列数据的主成分分析。主成分分析的完整基因微阵列探测到样品在不同职能治疗60 h。彩色图显示所有数据点投影在三维空间中由三坐标旋转。每个数据点代表一个独立的职能治疗,与红色的平方代表样本处理pH值6.0和0毫米,蓝色三角形代表样本处理pH值4.5和0毫米,棕色的圆代表样本处理pH值4.5和0.8毫米,灰色菱形代表样本处理pH值4.5和3.2毫米。样品相同的治疗是密切相关的,可以一起包围。

图3
微阵列和qPCR数据之间的关系。基于微阵列的每个基因的表达谱数据和qPCR日志10改变了。微阵列数据绘制qPCR数据。
3.3。表达基因的功能

所有的43803年由核糖核酸杂交探针集测量,43651被发现对幼苗处理在不同pH值。总数减少到大约65%的成绩单后,探针集与模糊信号和那些没有叫做“现在”至少在两个复制删除(见表S1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2095195)。其中,4146成绩单或表达下调与FC和至少两倍 成对的值为0.05 测试(表2)。
B和 C和 D和 C和B D和B D和C
表达下调 1126年 340年 566年 735年 1111年 595年
调节 1379年 1037年 912年 1381年 1893年 304年
总 4146年
所有映射到参考序列的基因和基因组序列进行差异表达在不同的库。数量的差异表达基因进行了分析在意义上记录使用阈值FC≥2。A, B, C, D代表发芽种子处理0 (pH值6.0),0 (pH值4.5),0.8 (pH值4.5),和3.2 (pH值4.5)毫米间变性大细胞淋巴瘤引起3分别解决方案60 h。
表2
在所有的差异表达基因治疗。
特遣部队 探针 基因与TF具有高度正相关系数 基因与TF具有显著的负相关
MYB 305 A_27_P172741(未知) A_27_P036981 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), , A_27_P042756(未知)(类黄酮3′单氧酶;电子商务:1.14.13.21), ,
A_27_P053551 (r和s)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P111336(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P003941 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
MYB apl A_27_P129206(未知) A_27_P077456(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P036981 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P241817 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P111336(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P170851(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P053691(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P003941 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P273952 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219), ,
MYB an2 A_27_P181166(未知) A_27_P241317 (r&s&l)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
MYB-like A_27_P133981 (sr) A_27_P053551 (r和s)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), , A_27_P149301(未知)(4-coumarate-CoA连接酶;电子商务:6.2.1.12), ,
A_27_P111336(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P273952 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219), ,
A_27_P045576 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA reducatase;dihydrokaempferol 4-reducatse;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219) ,
MYC2 A_27_P057826 (r&s&l) A_27_P273952 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219), ,
A_27_P045576 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219) ,
MYC2-like A_27_P348932 (r&s&l) A_27_P273952 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219), ,
OCS特遣部队 A_27_P065811 (sr) A_27_P077456(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), , A_27_P149301(未知)(4-coumarate-CoA连接酶;电子商务:6.2.1.12), ,
A_27_P036981 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P053551 (r和s)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P111336(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P170851(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P003941 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P273952 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219), ,
WRKY 40 A_27_P031021 (sr) A_27_P065476 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P045576 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219) ,
A_27_P273952 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219), ,
WRKY 11 A_27_P015415 (r&s&l) A_27_P065476 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P045576 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219) , 		A_27_P149301(未知)(4-coumarate-CoA连接酶;电子商务:6.2.1.12), ,
A_27_P263014 (r&s&l) (Shikimate O-hydroxycinnamoyl转移酶;电子商务:2.3.1.133), ,
A_27_P034176 (r和s) (3-hydroxyisobutyryl-hydrolase 1;电子商务:4.2.1.17), ,
ERF13 A_27_P008251 (sr) A_27_P077456(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P111336(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P065476 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P273952 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219), ,
A_27_P045576 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219), ,
bHLH35 A_27_P048601(未知) A_27_P036981 (sr)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), , A_27_P149301(未知)(4-coumarate-CoA连接酶;电子商务:6.2.1.12), ,
A_27_P053551 (r和s)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P111336(未知)(过氧化物酶;电子商务:1.11.1.7), ,
A_27_P273952 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219), ,
A_27_P045576 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219) ,
CCCH 29 A_27_P274912 (r&s&l) A_27_P045576 (r&s&l) (cinnamoyl-CoA还原酶;dihydrokaempferol 4-reductase;电子商务:1.2.1.44;1.1.1.219) , A_27_P149301(未知)(4-coumarate-CoA连接酶;电子商务:6.2.1.12), ,
A_27_P034176 (r和s) (3-hydroxyisobutyryl-hydrolase 1;电子商务:4.2.1.17), ,
表3
相关系数分析TFs的代谢途径的基因。

有1037和912个基因调节在800μM和3.2毫米3 +(pH值4.5)组,分别与相应的基因表达水平相比0μ米艾尔3 +(pH值6.0)组。在调节基因,747在两组(表是很常见的2)。340年和566年与800年基因治疗组中表达下调μM和3.2毫米3 +分别(pH值4.5)。在两组(表242个基因表达下调2)。此外,在比较与相应基因表达水平在0μ米艾尔3 +(pH值4.5)集团,1381年和1893年在800年的基因调节μM和3.2毫米3 +(pH值4.5)组,分别调节两组(表10522)。735和1111个基因表达下调在这两个组,分别在两组(表563个基因常见2)。因此,共有3926个基因被发现是上涨或下调后接触3 +(FC≥2.0;和 ,t以及)。

识别基因表达模式,EST在NCBI数据库(国家生物技术信息中心),结果表明3926个基因的表达模式(图被分成九个类型4)。在这九个类型中,最明显的模式包括sr(基因表达具体根源),rl(基因表达的根和叶),和r&s&l(基因表达的根,茎,叶),比例为29.98%,15.37%,和14.14%,分别。基因表达的根可以解释66.33%的基因,这表明,大多数基因表达诱导或抑制在根acid-Al压力。虽然美国东部时间可能不完整的基因活动的指示,全面的基因表达模式给我们提示了基因表达式Al压力反应主要发生在紫花苜蓿的根。在我们的研究中,基因表达的位置被显示在括号后调查ID。例如,A_27_P051336 (r&s&l)意思表达的基因A_27_P051336根、茎和叶。


图4
差异表达基因表达模式的百分比。3926年百分比表达模式的差异表达基因,饼图所示。基本上,他们被分成九个类型:(1)“老”意味着在根特别表达;(2)“sl”意味着在叶子特别表达;(3)“党卫军”意味着明确表达在茎;(4)“rl”表示基因表达在根和叶;(5)“r和s”表示基因表达在根和茎;(6)“储贷协会”表示基因表达的茎和叶;(7)“r&s&l”表示基因表达的根,茎,叶;(8)“其他”表示在其它植物组织基因表达; (9) “unknown” indicated genes which cannot identify their expression patterns in NCBI databases.

我们总结了基因列表植物激素的反应性,强调防守,和膜转运蛋白。总共26个基因与植物激素(即有关。,IAA, ABA, and ethylene) were found (Table S2), in which 9 genes were related to auxin, such as the auxin response protein genes, cationic peroxidase genes with IAA oxidase activity, and auxin conjugate hydrolase gene; 9 genes encoded ethylene responsive transcription factors; 2 genes were related to ABA; 2 genes were related to cytokinin; and 4 genes were related to gibberellin. A total of 28 genes were related to stress defense (Table S3), including an Aluminum sensitive protein, DREB (dehydration responsive element binding) protein, heat shock proteins, LEA (late embryogenesis abundant) proteins, and a universal stress protein. A total of 20 genes were membrane transporters (Table S4), including 8 ABC transporter genes, 6 nitrate transporter genes, peptide transporters, a potassium transporter, a sulfate transporter, a zinc transporter, and a mitochondrial phosphate transporter.

3.4。AgriGO功能富集分析的差异表达基因

去功能性浓缩了总共3926个差异表达基因。生物过程中的一类,调节生物过程的百分比(:0050789)在米加(12%),29.5%的生物调控(:0065007)在米加(14%),34%的细胞过程(:0009987)在米加(41.5%)63%,代谢过程(:0008152)在米加(36%),58%和对刺激的反应(:0050896)是53%在米加(17.5%)。在细胞组件类别,细胞的百分比(:0005623)在米加(52.5%)62.3%。在分子的功能类别,转录监管机构活动的百分比(:0030528)在米加(4%)21%(图5)。79去发现高度显著(从第三级别底部)的阈值 值< 0.001和错误发现率(罗斯福)< 0.05(表S5)。最丰富的条款包括代谢过程,对刺激的回应,和转录监管机构活动(图5)。最高的意义丰富去接受 值≤5×10−10与phenylpropanoid有关生物合成的过程(去:0009699),类黄酮代谢过程(去:0009812)和类黄酮生物合成的过程(去:0009813),显示phenylpropanoid和类黄酮代谢可能参与Al压力的响应(图S1)。


图5
Flash条形图过多的术语在所有三个类别。的y设在基因的比例是由术语映射和代表丰富的术语。输入列表的百分比计算基因映射到GO术语的数量除以总数量的基因在输入列表中。相同的计算应用于参考列表生成它的百分比。这两个列表是使用不同的颜色来表示。的 设在去术语的定义。
3.5。层次聚类分析

当所有的基因在79年显著富集条款相结合,得到了226个基因。集群方案生成的四个不同的集群根据基因表达模式(图6)。集群包括32个基因表达下调的酸处理。这个集群包含这些编码的基因TFs WRKY 22 (A_27_P136691(未知),MYB-like (A_27_P234867(未知),OCSB因子1 (A_27_P065811 (sr)),和MYC2 (A_27_P348932 (r&s&l))。集群B包括75个基因被Al-acid调节治疗,包括基因编码TFs MYB an2 (A_27_P181166(未知))和bHLH120 (A_27_P162931 (sr))和基因参与类黄酮生物合成(去:0009813),如dihydroflavonol 4-reductase (A_27_P258277(其他))和HCT (A_27_P263014 (r&s&l))。集群C包含3基因调节酸处理。集群D包含116个基因表达下调的Al-acid治疗,包括TFs WRKY基因编码11 (A_27_P015415 (r&s&l))和CCCH29-like (A_27_P274912 (r&s&l))和基因参与phenylpropanoid新陈代谢(:0009698)条款,如TT7 (A_27_P042756(未知))和cinnamoyl-CoA还原酶(A_27_P045576 (r&s&l))。比较基因表达在acid-Al治疗表明,差异表达基因集在每个压力治疗。


图6
表达谱的聚类分析。聚类分析的226个基因表达谱在高度显著富集条件。基因的聚类分析对每组进行了使用层次聚类和创世纪1.7.5平均链接和欧式距离测量。行代表差异表达基因,列代表不同的独立的治疗(A, B, C, D代表发芽种子处理0 (pH值6.0),0 (pH值4.5),0.8 (pH值4.5),和3.2 (pH值4.5)毫米间变性大细胞淋巴瘤引起3解决方案60 h,分别地;每个处理重复三次)。在顶部显示的颜色范围说明了基因的相对表达率在所有样本。四组的四个线图表右边所示。
3.6。京都基因和基因组的百科全书(KEGG)的分析途径

KEGG分析显示,phenylpropanoid生物合成,苯丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢是226年的三个主要途径acid-Al-responsive基因(表S6)。因此,我们关注的基因参与这些途径来展示这些数据在理解他们的特定功能的实用程序在苜蓿Al压力的反应。

因为phenylpropanoid生物合成、苯丙氨酸代谢和类黄酮生物合成途径在植物代谢密切相关,在这个分析他们组合在一起。结果表明17 -或表达下调的基因参与phenylpropanoid生物合成。他们编码6个关键酶。此外,14个差异表达基因编码3酶参与苯丙氨酸代谢,3和4基因编码酶参与了类黄酮的生物合成。完全,19 9基因编码酶参与了这三个途径(图S2)有关。11个基因编码氧化酵素,与活性氧(ROS)清除和木质素合成。基于相关系数分析,许多TFs,如MYB305 MYB ap1, WRKY 40岁和WRKY 11日被发现有很高的正相关系数与基因代谢途径(表3),表明这些MYB基因家族和WRKY基因家族的基因和其他显示在表3可能与代谢途径的监管。WRKY 11日,具体来说,MYB apl和WRKY 40高正相关系数与ROS清除和木质素类黄酮合成相关基因( , ;图7)。


图7
离子通道响应acid-Al基于KEGG分析。概述phenylpropanoid的组合生物合成的苯丙氨酸代谢,类黄酮生物合成途径在回应acid-Al离子基于KEGG分析。19基因差异表达,以应对acid-Al离子。层次聚类的相关系数分析的结果显示在右下角。分裂的组织是由不同形状和颜色标记图标,这也标志着在代谢途径。高正相关系数与基因附近的分裂组织显示的图像层次聚类分析和也是根据阴影区域的代谢途径。

最后,12 7基因编码的酶参与了淀粉和蔗糖代谢。大多数酶可以催化的二糖水解单糖(图S3)。然而,我们没有找到TFs高正相关系数与淀粉和蔗糖代谢基因。

4所示。讨论

4.1。全球基因表达分析苜蓿暴露在酸和高浓度的离子

全球使用安捷伦基因表达微阵列基因表达分析显示3926个基因的表达改变的酸和铝离子,可以检测到66.33%的根源包括那些专门表达在根占29.98%的基因。许多基因与激素和ROS-metabolism被确定的基因表达分析。陶工et al。28假设Al毒性可以诱导SIMR(应激地貌成因的响应)。有趣的是,激素和ROS生产是主要的监管控制应激的交互SIMR植物(28]。因此,基因与激素和ROS-metabolism可能参与SIMR后接触。在这项研究中,9基因的表达与生长素和9乙烯相关基因被发现,或表达下调,揭示响应生长素和乙烯的毒性。生长素和乙烯被发现起着重要的作用在调节Aluminum-induced抑制根系生长的6,29日,30.]。太阳et al。2)发现Al-induced乙烯可以作为一个信号改变生长素分布的根,从而抑制根伸长。12个基因编码过氧化物酶(去:0004601)可以消除活性氧的生产,导致植物形态变化引起的。

共有20个基因编码转运蛋白被发现在我们的安捷伦基因表达微阵列分析,8 ABC转运蛋白编码基因。ABC转运蛋白含有一种磷酸腺苷磁带(ABC)和直接参与跨膜运输的广泛的分子(31日]。ABC转运蛋白还参与运输激素生长素和脱落酸等,参与了解毒的有毒矿物质,如镉(Cd)、砷(as)和铝(Al) [32]。

AgriGO和KEGG分析揭示了19 9 phenylpropanoid生物合成的关键酶基因编码,苯丙氨酸代谢,类黄酮生物合成代谢后的酸性pH值和高3 +浓度(图S2)。这些通路的激活也显示出他们与铝反应压力。Phenylpropanoid Phenylpropanoid产生的化合物和类黄酮生物合成代谢途径可能在植物防御扮演各种各样的角色33,34]。phenylpropanoid化合物与铝离子形成复合物,导致内部Al解毒Al-accumulating物种(11,12]。Kovačik et al。35)表明,酚类化合物也可能影响射击吸收。豆荚(EC 1.11.1.7) phenylpropanoid途径可以清除ROS由Al压力(36,37]。此外,phenylpropanoid产生的木质素生物合成下会影响细胞壁成分,SIMR Al压力(28,38]。

共有14个基因编码3酶(POD (EC 1.11.1.7), enoyl-CoA水合酶,和4-coumarate-CoA连接酶),参加了苯丙氨酸代谢途径的影响。铝诱导的基因表达的变化会影响合成琥珀酰辅酶,反过来又影响了OA的合成柠檬酸三羧酸循环。一个et al。10]研究基地可能会影响合成的美洲国家组织通过影响三羧酸循环,和琥珀酸的叶的应用可以提高有机酸的积累(包括草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸)和减轻毒性。

4.2。TFs调节代谢途径被激活Acid-Al压力

虽然phenylpropanoid和类黄酮生物合成途径在植物都已经被广泛地研究过了39),有限的信息可用于基因规定参与Al压力。许多研究探讨了phenylpropanoid转录调控和类黄酮生物合成途径(40]。基因调节phenylpropanoid途径之一是AmMYB308,被发现金鱼草majus(41]。AmMYB308压抑几个phenylpropanoid通路基因在转基因烟草中。金等。42)表明,AtMYB4可以抑制一般phenylpropanoid通路拟南芥。这个监管机构是第一个示例的MYB蛋白功能的转录阻遏phenylpropanoid通路拟南芥(43]。Hichri et al。40)提出了一个模型的phenylpropanoid和类黄酮生物合成途径MYB由一个复杂的控制,基本helix-loop-helix (bHLH)和WD40蛋白质。

在这项研究中,我们使用相关系数分析研究可能的TFs调节代谢途径激活Al压力。MYB家族基因如MYB 305, MYB an2,和MYB apl被发现有很高的正相关系数与phenylpropanoid和类黄酮生物合成途径的基因( , ;表3)。此外,MYB 305被发现有显著的负相关,TT7(类黄酮3′单氧酶,A_27_P042756(未知); 和 ),显示这个基因可能抑制TT7的表达。在拟南芥、家庭MYB基因PAP1同源MYB 305,可以抑制TT7的表达式;这个结果是符合我们的数据44]。许多先前的报道表明,bHLH MYB的可能是一个代数余子式40,45,46]。在我们的研究中,我们发现bHLH基因bHLH35高正相关系数与许多phenylpropanoid和类黄酮生物合成途径中的基因(表3)。WRKY基因的家庭(WRKY 40和WRKY 11)也发现有较高的正相关系数与木质素和类黄酮合成相关基因( , ),表示可能的监管角色WRKY 40和WRKY 11 phenylpropanoid和类黄酮生物合成途径。然而,没有研究讨论了WRKY家族之间的关系和phenylpropanoid生物合成途径。

5。结论

全球基因表达分析表明,acid-Al可能明显影响3926基因表达。事实上66.33%的差异表达基因从根证实acid-Al毒性的主要目标植物的根。去phenylpropanoid浓缩和KEGG研究表明,类黄酮生物合成,MYB转录因子和WRKY家庭主要涉及在苜蓿acid-Al压力的反应。理解的关键调控基因和通路将有利于对酸性土壤产生更好的作物产量和艾尔的压力不仅在苜蓿还在其他作物。

相互竞争的利益

没有利益冲突。

作者的贡献

彭周和苏Liantai贡献同样这项工作。

确认

作者感谢丽达Zhang博士(上海交通大学、上海)对生物信息学分析好的建议。本研究资助的中国自然科学基金一般项目(31272198和31272198号)。

补充材料

补充材料包括三个数据(图S1,分层树图过多的术语;图S2,概述phenylpropanoid组合生物合成的苯丙氨酸代谢,和类黄酮生物合成代谢途径;图S3,淀粉和蔗糖代谢通路)和六个表(表S1,微阵列探测器检测到的数量;表S2, acid-Al暴露后上升或下调基因与植物激素;表S3,上升或下调基因后接触acid-Al有关应激防御;表S4,上升或下调基因后接触acid-Al膜转运蛋白;表S5,显著高浓缩的术语列表详细信息;表S6, 226个基因的代谢途径列表属于重大浓缩条件)。

  1. 补充材料

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