小分子核糖核酸的孢子体和配子体之间的比较分析Porphyra yezoensis

文摘

Porphyra yezoensis建筑师是一个潮间带的海洋红藻,受到越来越多的关注作为一个生物模型由于其重要的生物学作用研究和农业产业。两代人的Porphyra yezoensis孢子体和配子体,有相同的基因组,但显示巨大的差异在很多方面,包括结构特点、栖息地,和基因表达。识别microrna及其可能的作用p . yezoensis发展,我们构建的小RNA和测序库p . yezoensis孢子体和配子体。测序数据进行了分析,确定了14个microrna,只有一个共同的这两个样本。我们的结果表明,p . yezoensis有一个复杂的小RNA处理系统包含小说没有可识别的microrna同族体在其他生物。这些microrna可能重要的监管角色不同代的发展p . yezoensis。

1。介绍

Porphyra yezoensis建筑师是一个潮间带的海洋红藻,受到越来越多的关注作为一个生物模型由于其重要的生物学作用研究和农业产业1]。p . yezoensis是世界上最有价值的海洋作物之一,栽培广泛在亚洲,尤其是在日本,中国,韩国2]。红藻,其与其他群体的关系绝不是肯定的,p . yezoensis有许多特征较低的真核生物,包括小亚基二磷酸核酮糖羧化酶的位置在叶绿体基因组中(3),相同的辅助色素蓝藻(4),和高之间的相似程度,它的许多基因和细菌的同系物。由于这些特性,红藻类被认为是原始或退化的真核生物(5]。

p . yezoensis有一个独特的双晶的生命周期由两代人组成,微观上二倍体丝状孢子体和宏观单倍体生叶配子体,用完全不同的形态6]。孢子体和配子体有相同的基因组,但显示巨大的差异在很多方面,包括结构特点、栖息地,和基因表达。孢子体密集簇,单列的细丝,而配子体是单层的。孢子体输入和发芽后壳,而配子体生活在潮间带的静态基质,遇到强光造成的压力,高温和干燥在低潮7- - - - - -9]。分析表达序列标签(EST)组产生的孢子体和配子体p . yezoensis发现,只有22.5%的组织通常发生在两代,说明伟大的基因表达的差异导致两代人之间的形态差异(10]。这些特点促使我们假设基因表达监管机构(如小分子核糖核酸(microrna))的两代人可能显示不同的特异性。

microrna是重要的非编码小分子rna (srna)会影响数量的输出目标在真核生物基因mrna平移镇压或劈理(11- - - - - -13]。最近microrna只有被广泛研究,但他们吸引了大量的关注,正在研究在许多生物体。microrna被认为存在于动物、植物和病毒具有高度的保护在每一王国14,15]。microrna的表达有一个时空模式(11,12,16- - - - - -18),和他们每个人影响特定基因的转录和翻译15]。microrna是简单的结构和各工序(在基因调控有重要作用15),包括发育模式,肿瘤细胞增殖,代19)、压力电阻(19],生长素响应[20.,21)、脂肪代谢和microrna的生源论(22,23]。microrna已经被广泛的研究在高等植物和动物,和梁等。24)确定的micrornap . yezoensis孢子体的可能角色microrna在不同代的发展p . yezoensis仍然未知。

在目前的研究中,我们建立sRNA库的孢子体和配子体p . yezoensis然后使用高通量技术Solexa深深序列srna。测序数据分析,microrna两样本识别研究。这项研究提供了洞察小沉默rna的表达和功能p . yezoensis。

2。材料和方法

2.1。文化的孢子体和配子体p . yezoensis

的p . yezoensis孢子体和配子体p . yezoensis在我们的实验室。都被不断曝气培养Provasoli浓缩海水(PES)培养基用蒸汽灭菌当地海水无机营养和维生素补充(过滤消毒),每周更新的培养基。孢子体和配子体生长在不同条件下,培养他们在不同温度和不同光照强度下。孢子体生长在15°C下50的光照强度μ摩尔光子米⁻²年代⁻¹与一个12 h黑暗/ 12 h光线光周期。从conchocelis配子体是诱导;基本上,一个shellp . yezoensisconchocelis培养在26°C与PES介质500毫升玻璃烧杯的光照强度下20μ摩尔光子米⁻²年代⁻¹与一个12 h黑暗/ 12 h光线光周期。几周后,壳放在22°C和一些纤维放在conchospores的附件。纤维与conchospores培养10°C下50的光照强度μ摩尔m照片⁻²年代⁻¹与一个12 h黑暗/ 12 h光线光周期。叶片随机选择进行进一步的文化1升玻璃烧杯。

2.2。RNA提取,图书馆建设和测序

总RNA提取试剂盒试剂根据制造商的协议(美国表达载体)。srna 18-28 nt的尺寸范围是收集并测序。基本上,srna被在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,和碎片18-28 nt被凝胶净化恢复。一双适配器结扎顺序他们5′和3′末端,和结扎srna用作互补脱氧核糖核酸合成、模板使用上标二世逆转录工具包(美国表达载体)。PCR的互补dna被放大,产品直接与1 g Solexa基因组测序分析仪(图1)。

2.3。最初处理读取

一个perl脚本被用来完成读取的初始处理。低质量的标签被移除,3′适配器序列被修剪,适配器标签被污染,和标签小于18元被过滤掉。短的寡核苷酸分析软件包(SOAP) (25)被用来映射其余sRNA序列(清洁读取)p . yezoensisEST序列;所有打报告和不匹配是不允许的。所有的清洁读取都一致反对非编码RNA从Rfam (http://www.sanger.ac.uk/resources/databases/rfam.html)和基因库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)确定非编码rna(核糖体rna, tRNA,核内小rna和snoRNA)片段,使用blastn [26)和一个e截止值为0.01。所有清洁读取所有已知的植物相比microrna可以从miRBase (miRBase序列数据库版本15;http://www.mirbase.org/)来识别已知microrna的同源染色体与其他已知的microrna(≤2不匹配)。从清洁标签读取互相符合识别潜在的小干扰(siRNA)候选人;两个完美互补srna与悬臂2元3′端被认为是核。干净的阅读都是根据他们的身份与sRNA类别分类。如果一个sRNA被映射到多个类别,下面的优先级规则采用:rRNA等等(基因库> Rfam)已知microrna的小干扰rna (> >27]。

2.4。microrna的识别

microrna是被过滤结构。的基因组p . yezoensis没有排序,EST序列进行扫描识别潜在的发夹地区已知microrna的同系物和其余nonannotated srna(图1)。srna与多个读取和≤20完美匹配的EST序列折叠300元的上游和下游侧翼序列和检查二级结构的基础上识别出潜在的microrna在以下描述的标准。前体与最小自由能(MFE)≤−18千卡摩尔⁻¹检查由Mfold [28,29日),≥16 bp和≤4凸起或microrna的之间的不对称和microrna的*,microrna之间的空间和microrna *≤300元,成熟的序列长度nt年龄在18岁至25岁之间,和一个侧翼序列长度20元,被认为是潜在的p . yezoensispre-miRNAs。

2.5。microrna的目标预测

的基因组p . yezoensis没有被测序,EST序列被用来检测潜在的microrna的目标参数和条件根据标准建议(早些时候30.,31日]。基本上,≤4 sRNA和目标之间的不匹配;在位置1 - 12≤2.5不匹配;没有不匹配职位10或11;没有相邻的不匹配职位2(从5′端计数的microrna和gu基地0.5不匹配)。此外,MFE≥74%的MFE microrna的绑定到它的完美补充所需的microrna的双工/目标。

2.6。实验验证的表达p . yezoensismicrorna

采用RT PCR检测的表达p . yezoensismicrorna。互补脱氧核糖核酸合成使用NCode很microrna的互补脱氧核糖核酸合成装备(英杰公司)根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸是用于PCR扩增p . yezoensismicrorna。的引物设计根据每个microrna和反义底漆中提供的通用引物互补脱氧核糖核酸合成装备。

3所示。结果

3.1。图书馆建设、测序和初始处理读取

为了确定microrna及其可能的角色p . yezoensis发展,我们构造和测序sRNA库p . yezoensisPYF孢子体和配子体(所有)。这两个跑了一组26616981个总签名。过滤后低质量数据和消除污染适配器(图1),我们获得srna长度的分布从10到43元,与序列(图21 - nt的主要组件2)。microrna通常大于17元,所以我们移除序列小于18元,10896642年和11984694年获得总序列,代表3853350年和3025076年独一无二的,尽管有时部分重叠,分别清洁从PYF读取和所有(表1)。这些独特的序列,~(2879648)和75% ~ 74%(2235970)测序只有一次,表明不同sRNAp . yezoensis。

尽管许多srna表示p . yezoensis仍然不明,他们注释,分为非编码rna (Rfam基因库),同源染色体的植物microrna (miRBase),或siRNAs根据他们的身份与这些数据库的序列或核的特征。如果一些srna被映射到多个类别,下面的优先级规则采用:rRNA等等(基因库> Rfam)已知microrna的小干扰rna (> >27]。只有少数的srna注释;95% ~ 85%的总读和~独特的阅读仍然nonannotated。所有的注释srna, siRNAs是最丰富的序列的检索p . yezoensis独特sRNA池,阅读所有sRNA类别的频率最高的两种样品:所有PYF为4.15%和1.84%(表1)。然而,在总sRNA池,siRNA代表PYF(8.29%)的重要组成部分,而核糖体rna(5.88%)和tRNA(5.59%)是在所有重要的组件。同系物的已知植物microrna占~ 0.4% ~ 0.61%的独特序列PYF和所有的分别;而在总序列池,是2.69% ~ 0.96%,~在PYF和所有,分别表明同系物的microrna在PYF和所有可能表达不同。srna映射到核内小rna和snoRNA罕见,其余srna没有注释。共同和特定序列的分析显示,只有~ 6%的独特序列被两个样品(表共享2),表明存在一组不同的内生srnap . yezoensis。

3.2。microrna在p . yezoensis

识别的一组不同的srnap . yezoensis促使我们检查他们是否确实功能。我们使用已知植物microrna的同系物,其余nonannotated srna识别候选人已知的和小说microrna的家庭p . yezoensis分别(图1)。最后,我们确定了14个候选人micrornap . yezoensis,包括两个成熟的microrna识别(早些时候24]。

每个microrna的一个前兆。pre-miRNA的长度范围从47 246元,平均135元(表3)。MFE范围是从135−−20千卡摩尔⁻¹,意味着−65千卡摩尔⁻¹,类似于计算预测的值拟南芥microrna的前体(−57千卡摩尔⁻¹),远低于tRNA(−27.3千卡摩尔⁻¹33)和核糖体rna(−千卡摩尔⁻¹)[32]。指定的14个microrna Pye-miR 1 - 14。终端变异序列分析表明,异质性长度的百分比是~ 14%的5′末端p . yezoensismicrorna和32%的3′末端3元删除或3元扩展(图3)。

3.3。的表达模式p . yezoensismicrorna的候选人在不同代

调查microrna的可能角色p . yezoensis发展,我们测序srnap . yezoensis孢子体和配子体。总共14个microrna被确定,其中只有1测序在这两个样品,7是专门从PYF测序,并从所有供试6只被测序。这表明,他们可能有一个重要的角色p . yezoensis发展。确定可能的调控基因,我们预测目标的基础上对这些microrna的规则植物microrna的目标预测暗示艾伦et al。30.]。大多数microrna发现没有或< 5目标,除了36个EST片段重叠群提出了作为Pye-miR4目标。然而,p . yezoensis基因组测序和大多数est序列没有注释,所以很难确定这些microrna的目标是否有功能的偏见。

3.4。核在p . yezoensis

确定核在p . yezoensis相比,我们从清洁标签读取。一双完美的互补与2 nt过剩srna 3′端被认为是核。发现潜在siRNAs表达p . yezoensis159904年(4.15%)和55752年(1.84%)独特的序列;和903198年(8.29%)和259369年(2.16%)总序列PYF和所有的分别。然而,由于缺乏p . yezoensis基因组信息,我们不能确定他们的位置。因此,我们不能确定它们是否分阶段相对于彼此在沉默或者他们有一个角色重复序列p . yezoensis至于其他生物。

3.5。已知植物microrna的同系物p . yezoensis

我们比较所有可用的干净的读取与所有已知的植物microrna从miRBase (miRBase序列数据库版本15;http://www.mirbase.org/)来识别已知microrna的同系物。如果一个p . yezoensissRNA展出的同源性与≤2不匹配与其他已知的microrna身份(或90%),它被认为是已知的microrna同系物这些可以分为449种已知microrna的家庭,允许一个或两个序列之间的不匹配(额外的数据文件1,看到网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2012/912843)。我们比较他们从34个microrna其他物种,包括拟南芥,栽培稻,高粱二色的,松果体taeda,Physcomitrella金属盘,衣藻reinhardtii(额外的数据文件1)。在这些同系物中,56中表达答:芥,37o .漂白亚麻纤维卷,23p .金属盘,只有4c . reinhardtii。

3.6。实验的验证p . yezoensismicrorna

我们用RT PCR检测的表达p . yezoensismicrorna和4被PCR扩增验证。PCR产品预期的大小(60 - 80个基点)(图而被放大4)、恢复和测序,增加对其表达的信心。一些大的PCR产品可能由于rna前体。

4所示。讨论

srna PYF 21元是最丰富的,符合早期报告(24),而在所有丰富srna的长度是22元。这是不同的情况答:芥,在24元srna代表一个主要部分(33,34]。先前的报告表明,p .金属盘和c . reinhardtii还缺少24元的浓缩srna [35- - - - - -37]。srna的长度是由物种的酶,参与处理。例如,DCL2 srna 24元,而DCL1产生srna 21元(37]。缺乏24 nt srna的浓缩p . yezoensis,c . reinhardtii和p .金属盘表明,RNA加工复合物在这些较低的光合生物可能不同于那些的答:芥。最丰富的大小从PYF srna是不同于所有,表明RNA加工酶和物种内的表达水平可能不同,甚至在不同的一代又一代的相同的有机体。

识别潜在的已知的micrornap . yezoensis,我们比较所有srna所有已知植物microrna miRBase同源染色体,发现数量;然而,这些都不符合我们的标准用于microrna的前体过滤。最直接的解释是基因组信息的缺乏p . yezoensis,尽管场景p . yezoensis包含小说没有可识别的同系物的microrna在其他生物的可能性不能排除。的单细胞绿藻c . reinhardtii缺乏相应的microrna与其他生物,甚至与其他绿藻(37]。因此,我们建议p . yezoensis有小说microrna与他人没有序列同源性,至于吗c . reinhardtii。我们用剩下的nonannotated srna识别潜在的小说micrornap . yezoensis。总之,14 microrna被确定,表明p . yezoensis有小说microrna缺乏与其他已知的microrna序列同源性。

两个成熟的microrna Pye-miR2 Pye-miR13,早被确定和指定m0001 m0005 [24),分别。尽管,Pye-miR2的前体的长度是不同于m0001,指定的梁等。24]。有趣的是,Pye-miR13,孢子体的测序p . yezoensis梁和指定m0005 et al。24),在配子体但不是孢子体被发现p . yezoensis在这项研究中。这表明,p . yezoensis可能含有更多的microrna,无法确定有效的高通量测序。

一些已知的microrna同系物的高度表达。例如,miR3445同源染色体的测序21384次PYF miR1442同系物,miR1154,和miR1211测序144756年,41203年,分别在所有和22573次。miR3445只报道拟南芥lyrata甚至没有报道答:芥。在这项研究中,我们测序同系物在PYF miR3445近20000次,但只在所有9倍,表明在PYF其重要作用。有趣的是,同系物miR1442,测序只从salt-stressed但不是drought-stressed或未经处理的库o .漂白亚麻纤维卷(38),在所有最丰富的只有1 PYF读。就像前面提到的1在壳孢子体,进入和发芽,而生活在潮间带的静态基质配子体和经验压力从各种来源形式在低潮7- - - - - -9]。我们建议同系物miR1442可能有一个重要的角色在所有的盐胁迫。Talmor-Neiman et al。39)报道,miR1211表达在一个非常低的水平p .金属盘配子体,他们提出,它可能表示其他的发展阶段,比如在孢子体。然而,我们测序同系物在所有供试miR1211近20000次(配子体),但只有13次PYF(孢子体),表明其作用p . yezoensis可能是不同的p .金属盘。

建议microrna可能参与的性分化Porphyra(40]。在这项研究中,我们确定了14个micrornap . yezoensis只有1测序PYF和所有;其他人是专门从PYF或所有测序,表明不同的microrna的表达和调控基因表达的不同代之间p . yezoensis。这可能是一个两代人之间的差异的原因是(10]。此外,两代人有相同的基因组,但他们在很多方面不同,包括栖息地。住在贝壳和经验小孢子体改变的环境。相比之下,生活在潮间带的静态基质配子体和经验强光造成的压力,高温和干燥在低潮7- - - - - -9),这可能导致压力与响应相关的microrna的表达,如前所述miR1442同系物。一致的结果也出现在其他物种。miR2119同系物,这可能是干旱响应(41),在配子体Porphyra haitanensis1479099册。在的研究Phaeodactylum tricornutum,我们发现更多的microrna nitrogen-limited和silicon-limited样本(42]。这两代人的microrna的表达差异p . yezoensis可能导致他们不同的公差的各种压力。事实上,配子体非常宽容的强光造成的压力,高温、干燥,而孢子体。

我们旨在识别的具体功能p . yezoensismicrorna。已经提出不同的目标,但由于缺乏基因组序列,我们无法确定这些microrna的目标是否有功能的偏见。此外,我们使用标准植物microrna的预测来确定目标p . yezoensismicrorna的目标;所以一些善意的目标可能是错过了因为microrna的交互与mRNA在这较低的光合生物可能不同于高等植物。

5。结论

这项研究的结果表明p . yezoensis有复杂sRNA处理系统包含小说microrna在其他生物没有可识别的相同器官,可能有重要的监管机构的角色吗p . yezoensis发展。

缩写

PYF:	孢子体的Porphyra yezoensis
所有:	的配子体Porphyra yezoensis。

作者的贡献

l .他和黄同样导致了这项工作。

确认

支持的工作是由中国国家自然科学基金(41176134,41176134,30970302),973项目(2011 cb411908),非营利组织研究项目的国家海洋局(201105023 - 7)和青岛高新技术研究与发展计划(11-2-3-8 (5)-jch)。

补充材料

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