人性化:PCR引物从多个比对预测

文摘

设计引物和探针的聚合酶链反应(PCR)是一个初步的和关键的一步,需要确定在给定的一组序列高度保守的区域。这个任务可以挑战如果目标序列显示高水平的多样性,在微生物学的研究经常遇到。我们开发了diseases,自动、快速和易于使用的生物信息学工具和一个友好的用户界面设计引物和探针基于多序列对齐。这个工具可以用于实时和常规PCR的目的,可以有效地处理大型组序列的大小。

1。介绍

聚合酶链反应(PCR)已越来越多地应用在过去二十年中探测、量化,和/或从各种来源的核酸序列1,2]。出版物的数量在PubMed引用“PCR”已经从2846年的1990人增加到20426年2010年2000年和44231年。该方法具有广泛的应用,尤其是在微生物学领域的(3- - - - - -5)设计引物和探针通常旨在杂交的最大数量的基因组序列对于给定组病毒、细菌或寄生虫(5- - - - - -7]。然而,设计可以挑战如果引物和探针是为了杂交与大量的核苷酸序列多样性;的任务变得更加复杂的核苷酸多样性增加。因此,识别守恒的地区有针对性的核苷酸序列是一个关键的步骤,PCR引物设计(5- - - - - -9]。

有几个工具可以用来设计引物6- - - - - -14]。然而,这些工具经常在他们的能力来解析大量存在局限性和/或大序列,这是经常遇到的情况,或处理退化的立场,他们中的一些人没有能力在生物信息学不易使用。

这里,我们现在diseases,这意味着“找到”在古埃及,一个简单的、自动化的,快,和万能工具找到通用引物和探针在一组多个变量,和长序列。主要标准用来确定引物和探针diseases核苷酸的保护,但是我们的工具提供了分解温度()、长度和GC百分比在最后输出文件为每个选择引物或探针。应用程序执行直接在PC电脑和提供了一个简单的和用户友好的界面,允许轻松快速地设计引物。此外,就可以解析数百长(> 1千碱基)序列在几秒钟内。我们相信我们的工具可以特别有用的微生物学领域。

2。算法和方法

人性化的输入文件是一个多个FASTA文件保持一致。一旦上传程序,一个共识序列构造。中心还接受一个序列(可手动策划),并使用它作为一个共识。与其他项目,包括退化核苷酸的共识序列和遵循IUPAC-IUB命名系统[15)(见第一节补充文件中,也可用的补充材料在网上http://dx.doi.org/10.1155/2012/783138)。diseases然后搜索引物和探针通过滑动窗口的大小,选择对应于所需大小的PCR产物,沿着全身的共识序列。一步值的窗口滑动滑动值(部分2和3的补充文件,也)。

几个参数可以修改用户从主窗口中,虽然每个参数(图提供缺省值1)。这些参数包括滑动窗口的大小,滑动值退化头寸的数量,和大小的寡核苷酸(图2)。默认的滑动值是20。另一个默认值提出了识别适当的寡核苷酸是变量网站的数量是零3′末端位置的引物和探针。另一个标准是适当的寡核苷酸必须不包含三个以上变量/退化核苷酸位置。然而,可以选择更轻松的参数。

两个选项已经实现diseases识别潜在的寡核苷酸,可以选择定时框(图1)。第一个选项包括描述的核苷酸片段的大小将包含引物和探针杂交网站。一种可能性是选择一个短窗口大小来设计实时PCR引物或探针集,经典,< 150个核苷酸。这种可能性需要定时“探针搜索”框。另一种可能性是选择一个更大的窗口大小为桑格设计引物测序,经典,> 200个核苷酸。第二个选项包括使用就没有描述的核苷酸片段的大小将包含引物和探针杂交网站。这个选项将导致一个列表的生成所有可能的寡核苷酸的共识序列,不管他们各自的位置,开始和结束位置的寡核苷酸报道。后一种选择是特别方便确定引物在高度变量序列,当第一个选择失败,它允许用户手动选择的最佳组合提出寡核苷酸(图2和第3节的补充信息,也)。

无论选择选项,最终报告介绍了序列,长度,GC含量,,在每个低聚糖的共识序列上的立场。的估计使用小的寡核苷酸的华莱士规则分解温度(16,17]。时间管理,用于计算最近邻法相结合的熔化温度()[18]。在这里,计算使用方程(17]:°C * (# + # T) + 4°C * (# C + # G),在“#”是指的数量,Cs、Gs、或低聚糖的Ts。

3所示。结果与讨论

我们开发中心提供的关键需求设计PCR引物和探针的一个易于使用的、快速和高效。其他几个工具设计的PCR系统之前描述(10]。尽管如此,一些限制可以指出这些工具(19- - - - - -33]。第一个限制是一些工具,比如Primer3在线和基于一个强大的工具来设计引物,短暂而保守序列,不能解析与简并碱基序列,我们可以通过diseases (19]。其他软件BatchPrimer3或Primaclade只接受一个序列(21,22]。其他工具存在,可以克服这个缺点29日- - - - - -33),如PrimerIdent,只接受8序列,其中一个被用作模板(29日]。GeneFisher可以解析多个序列但未能处理与简并碱基序列(30.]。基于web的工具格林SCPrimer设计简并引物从多个序列比对通过构建系统发育树,这是一个缓慢的过程32]。easyPAC工具可以设计简并引物,还执行映射到参考文件实时PCR,但它执行低于diseases引物和探针设计(33]。我们先前描述SVARAP序列分析的可变性和引物设计6],它可以分析最多100的最大长度4000个核苷酸序列。其他工具有特定的应用程序,比如PhiSiGns标识噬菌体基因组的基因签名(34]。此外,一些工具设计的PCR系统需要生物信息学技术,如“Prosig”[35]或PriMux包基于python脚本搜索引物和探针不结盟多个序列(7]。

现有工具经常寻找寡核苷酸通过考虑参数如GC-content,,或者二级结构的形成。然而,最关键的问题数pcr检测的识别是守恒的引物和探针杂交的地区,除了查询序列的长度和数量。这些问题尤其重要的微生物学领域的。此外,缺乏友好的用户界面和跨平台工具是生物学家的挑战性问题没有先验知识的编程工具。

就比其他工具(表有几个优点1)。它能够自动和快速预测许多长和可变序列PCR引物。此外,就可以用来设计PCR系统实时PCR和测序。此外,不需要生物信息学培训使用人性化,具有友好的用户界面。

PC上使用diseases 512 MB RAM,成功构建共识,确定引物和探针61对齐长篇丙型肝炎病毒基因组长度约10000个核苷酸在几秒钟(表1,第四节补充文件,也),而easyPAC未能找出任何底漆和格林SCPrimer几乎运行甚至设计引物序列较短。

一些高级选项,如二级结构的识别,和预测的发夹和引物二聚体的形成不是在这个版本;在未来版本的就可以解决这些问题。另外,预测发夹或二聚体的形成可能是由其他工具作为OligoCalc工具(36]。

4所示。可用性和实现

中心是一个跨平台的应用程序分布在gnu gpl许可是免费使用的,学术和研究目的。这个工具的便携式桌面版免费分配和使用便利。自由软件和文档供研究使用https://sourceforge.net/projects/gemi/。一个脚本版本的就可以。

该工具运行在Windows 7的没有任何初步的设施。旧版本的软件需要微软。净(Dot)框架2.0版,这是免费的从微软的网站。Ubuntu Linux, Mac OS X用户,请下载Mono运行的软件工具http://www.mono-project.com/或http://monodevelop.com/(见程序的用户指南)。

输入文件是一个标准的FASTA格式的文件,其中包含一个序列或多重序列比对,可以使用任何可用的对齐工具创建的。生成的输出文件列表的文本文件,可以使用任何文本处理程序很容易阅读和包含的PCR产物序列(如果选择),序列的引物和探针(如果选择),位置的寡核苷酸的共识,、退化核苷酸数量和GC含量(见补充文件和程序的用户指南)。

5。结论

我们提出了一个简单的、健壮的和快速的工具,人性化,满足常规要求生物学家设计引物和探针。我们相信,这个工具可以帮助研究或诊断为范围广泛的应用程序,包括检测、量化,在微生物的基因。

确认

作者感谢教授迪迪埃拉乌尔Heebal金教授他的建议和Fadi Bittar这博士和奥黛丽Ferretti有用的评论。h . Sobhy收到拨款Infectiopole Sud基金会(2011 - 2014)。

补充材料

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版权

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