差异蛋白表达在甘蔗,甘蔗Sporisorium scitamineum交互显示2 de和MALDI-TOF-TOF /女士

文摘

了解一个特定的植物-病原互作的分子基础,重要的是识别植物蛋白质,应对病原体攻击。两个甘蔗品种,NCo376和ya71 - 374,被用于这项研究。通过二维电泳(2 de)、甘蔗接种后的蛋白质表达谱Sporisorium scitamineum进行了分析。总共23个差异表达蛋白质被MALDI-TOF-TOF / MS鉴定。生物信息学分析显示,这20个差异蛋白的功能是与光合作用等功能,信号转导,和抗病性,而其余三种蛋白质的功能并不确定。从上面,我们可以假定蛋白质调控网络在甘蔗和之间的交互美国scitamineum是复杂的。这是第一个蛋白质组调查集中在强调蛋白质表达谱的变化在甘蔗暴露美国scitamineum,它提供了参考信息在甘蔗回应美国scitamineum压力在蛋白质水平。

1。介绍

甘蔗黑穗病,导致重大损失在甘蔗糖产量以及降低蔗糖含量,是一种真菌疾病所致Sporisorium scitamineum。感染后,甘蔗工厂经常舵柄与芽更丰富地细长的叶子更正直和狭窄(“像”外观)和“buggy-like鞭子从芽。不太常见的症状是叶和茎五倍子和增殖芽。甘蔗黑穗病的发展取决于环境、品种、病原体相互作用。

植物抗病性是复杂的,涉及到一个复杂的网络识别植物受体的非病原性因素,触发特定的信号转导通路,氧化破裂,积累pathogenesis-related(公关)蛋白质和植物抗毒素,和局部细胞死亡1]。理解病原体引起某种疾病的基础上在一个寄主植物而不是另一个一直感兴趣和动机的植物病理学家。直到最近,越来越多的受到关注的研究甘蔗和之间的交互美国scitamineum。研究报告主要集中在生理生化变化在甘蔗和之间的相互作用美国scitamineum,这应该有助于加速制定短期和长期的策略黑穗病疾病管理(2- - - - - -4]。此外,研究甘蔗-美国scitamineum相互作用在分子水平上也确认库存优先的候选基因表达过程中(5- - - - - -7),表明寄主植物的积极作用。

尽管我们已经学到了什么,对病原体和宿主之间的相互作用的蛋白质组学背景pathosystem。差异蛋白质组学的本质是发现造成的不同样本之间的差异蛋白表达一个特定的因素,是整个蛋白质组学研究的一个重要组成部分。差异表达蛋白质的识别在不同外源压力很可能能给的线索是什么样的防御机制和生化途径在特定情况下监管。从理论上讲,一旦获得足够的蛋白质差异信息,这些变化可以推断的基础;因此,差异蛋白质组学的研究提供了一个基础生命科学研究的有力工具。最近,显示方法研究蛋白质丰度的差异在不同的情况下,如2 de和MALDI-TOF-TOF /女士,已经开发出来。此外,许多植物在各种生物的蛋白质表达谱研究了应力差异蛋白质组学技术的应用,以及相关信息的响应机制差异蛋白在各种压力下获得了(8- - - - - -12]。因此,这一技术已被证明是一个优秀的工具来识别小说与植物抵抗某些病原体相关的蛋白质。

在目前的研究中,甘蔗品种NCo376和ya71 - 374,高度耐药和高度敏感美国scitamineum分别被用作植物材料,两种类型的差异蛋白质组学技术,2 de和MALDI-TOF-TOF /女士(基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱计),是应用于甘蔗-蛋白质差异表达分析美国scitamineum交互。预计这一研究获得的结果将帮助理解的分子响应甘蔗黑穗病抗性水平不同的品种美国scitamineum,它会因此甘蔗黑穗病抗性的基础上提供了一些信息在蛋白质水平。

2。材料和方法

2.1。植物材料和接种

甘蔗品种,NCo376(高度耐药美国scitamineum)和ya71 - 374(非常容易美国scitamineum),使用的来源美国scitamineum从甘蔗品种F134竞赛2剂收集。三十秸秆NCo376和ya71 - 374与选择和统一的强劲增长,切成two-bud茎,分为两组相等的部分。秸秆在热水治疗50°C 2小时消毒。一群沉浸在消毒秸秆美国scitamineum孢子悬液10分钟(治疗组),另一组接受消毒重蒸馏的水(对照组)。的浓度美国scitamineum孢子悬液用于接种孢子/毫升。接种后,秸秆在潮湿的条件下保持24小时25°C,然后在地里种植。对照组,茎治疗与治疗组相同的除外美国scitamineum孢子悬液被蒸馏水所取代。时的症状美国scitamineum感染出现,+ 1叶(1日叶肉质下乐队)的治疗和控制组织收集通过液氮冷冻和储存在−80°C到以后使用蛋白质提取。三个生物学重复应用于实验。

2.2。从甘蔗叶提取蛋白质

TCA-acetone(三氯乙酸和丙酮)沉淀蛋白质的提取方法采用小修改(13]。首先,1 g的新鲜甘蔗叶在液氮磨成粉末(PVP:样品1:10)的10毫升的10%柠檬酸(由丙酮,包含0.07%β巯基乙醇)。其次,混合液体沉淀在−1 h 20°C和离心机与30000克15分钟在4°C,然后是浮在表面的丢弃,包含0.07%的颗粒是re-suspended冷丙酮β巯基乙醇和一夜−20°C;之后,包含0.07%的颗粒与冷丙酮洗两次β巯基乙醇。第三,离心后15分钟与30000克,小球是resuspended 80%丙酮和1 h−20°C,然后再是离心机。最后,颗粒干燥成粉末了低温真空干燥和储存在−80°C到使用。

2.3。蛋白质的溶解和内容的决心

50毫克的蛋白质干粉添加到600年μL溶解产物(7 mol / L尿素2摩尔/ L柠檬酸、4% (m / v) 3 - ((3-cholamidopropyl) dimethylammonio-1-propanesulfonate(家伙),1% (m / v)两性电解质pH值为3.5 -10年和40更易与L二硫苏糖醇(DTT)),和细胞溶解在水中沐浴2 h在30°C,然后20000年gcentrifuged 20分钟。上层清液用于二维分析。显示总蛋白质含量测定方法由布拉德福德(1976)使用牛血清白蛋白作为标准(14]。

2.4。第一个维度等电点聚焦()

固定化pH梯度(IPG)地带(24厘米,pH值4 - 7,线性梯度;与first-dimensional Amersham应用生物科学公司)等电点聚焦(IEF) Amersham Ettan IPGphor II。使用前,蛋白质提取被允许在室温下解冻。积极进行补液,补液包含6 mol / L的尿素,2 mol / L的硫脲,2%的家伙,0.5% IPG缓冲区,德勤0.4%,0.002%溴酚蓝。样本总量是450μL,包含1000μg蛋白。样本添加到gel-holding坦克时,塑料保护膜剥离拍摄和带钢表面面临下行,带的两端粘在电极底部的槽。应注意正极和负极电极不逆转,泡沫的生成之间的地带和样品流体被避免。1.5毫升的矿物油是覆盖在加沙地带防止样品溶液的挥发。能源论坛的工作参数合作如下:20°C, 50μ/条,30 V, 12 h;500 V, 1 h;1000伏,2 h;3000 V, 1 h;8000 V, 7.5 h,总共有65,860 V小时。

2.5。第二个方面sds - page

能源论坛当合作完成,他们将孵化15分钟的平衡缓冲(6 mol / L的尿素,50更易与L Tris-HCl (pH值8.8),2% (m / v) SDS, 30% (m / v)甘油,0.002%溴酚蓝)含有1% (m / v)德勤,然后他们将reequilibrated 20分钟的平衡缓冲包含2.5%碘乙酰胺消除盈余德勤。second-dimensional均衡两次后,采用sds - page凝胶浓度为12.5% T和2.6% c,固化后的凝胶,他们将仔细放在玻璃板与凝胶具有良好的接触表面(避免泡沫的生成),和0.5%琼脂糖含有的微量溴酚蓝(由电泳缓冲)是用于凝胶密封,电泳开始,马参数被设置为15 /板。当溴酚蓝的前沿到达凝胶,电流增加到30 mA /板,电泳时停止溴酚蓝的前沿达到0.5厘米的位置远离凝胶的底部。一旦完成sds - page,凝胶取出和彩色Neuhoff胶体染色法(15]。凝胶图像被凝胶医生2000收购(Bio-Rad)图像扫描仪和现场检测,发现匹配,和定量强度分析进行了使用PD-Quest 7.20软件(Bio-Rad)。治疗和控制凝胶的图像通过强度归一化,规范化,只有这些蛋白质有明显调节表达式或显著下调表达和新感染后被认为是差异表达的蛋白质。

2.6。凝固态差异表达蛋白质的消化

蛋白质凝胶的兴趣被切除并放在96 - microtitre板。凝胶块被拘留15解决方案更易与L / L铁氰化钾和50更易与硫代硫酸钠(1:1),在室温下为20分钟。之后,他们用去离子水清洗两次,在乙腈(ACN)脱水萎缩了。样本然后肿消化缓冲区包含20更易ng / L碳酸氢铵和12.5μL胰蛋白酶在4°C。30分钟孵化后,凝胶是消化超过12 h在37°C。肽被提取使用50% ACN组织0.1%的两倍。提取干N的保护下₂。MALDI-TOF-TOF /女士,肽筛选了0.7到目标板μL矩阵解决方案(α-cyano-4-hydroxy-cinnamic酸在ACN组织0.1%和50%)。

2.7。MALDI-TOF-TOF /女士和数据分析

样本由4700蛋白质组学分析分析仪(MALDI-TOF / TOF TM)(美国应用生物系统公司),和操作如下。完全干燥的肽段溶解在0.7μL (0.5 g / L CHCA解决方案(ACN溶剂0.1%组织+ 50%)。整个解决方案是点到不锈钢MALDI目标板在室温下与空气干燥。然后执行质量光谱分析样品,和激光来自Nd: YAG激光波长为355 nm的加速电压20 kV。收集的数据是正离子和自动采集模式。及质量扫描的范围是从700 D - 3500 D,和系列质量光谱分析了5峰的最大强度。外部标准调整是由肌红蛋白的酶解肽段的光谱图。

数据搜查了GPS Explorer (GPS Explorer TM软件、应用生物系统公司、美国)使用吉祥物(矩阵科学、英国伦敦)作为搜索引擎。设置参数如下:数据库NCBI (nr);检索属被设置为;设置为数据采集方法相结合;最大缺失的削减网站允许设置为1;设置为胰蛋白酶酶。设置质量误差范围及0.3 D;MS / MS 0.4 D;胰液素自甘堕落峰以及污染物的峰被拒绝手工在数据库检索。

3所示。结果和分析

3.1。在甘蔗DE分析差异表达蛋白质美国scitamineum压力

由应用程序组地带(pH值3 - 10),结果表明,整个蛋白质从甘蔗主要集中亲之间的等电点和中立,而只有少数极酸性蛋白质等电点低于4和基本的蛋白质等电点以上8。从蛋白质2 de图谱的比较的高抗性品种NCo376和高度易感品种ya71 - 374接种前后,我们可以看到,抗性和敏感的甘蔗品种之间的蛋白表达提出了一些差异,这是同一品种接种前后的蛋白表达和蛋白表达之间的抗性和敏感品种不同。尽管甘蔗的π(等电点)蛋白主要集中在微酸性和中立,IPG地带与pH值3 - 10不能单独的甘蔗蛋白;因此IPG带窄酸度范围4 - 7进一步申请2 de分析。通过2 de和银染色,蛋白质2 de凝胶图谱并进行频谱分析得到蛋白质歧视软件。为了保证重现性,控制和2 de美国scitamineum强调甘蔗重复了三次。图像分析显示,这些二维图像高度可再生的,和二维模式控制和治疗组数据所示1和2。总共大约500到700可见蛋白斑点观察每2 de凝胶。

从数据1和2,分离效果组地带(pH值4 - 7)甘蔗蛋白质相对更好,我们可以看到,无论在抗病品种NCo376或敏感性极高品种ya71 - 374提供的蛋白表达显著差异接种前后的差异不仅出现在相同的蛋白质的表达能力,也在一些新诱导蛋白(礼物)或完全抑制(缺席)的蛋白质。同时,差异蛋白质的数量和空间分布在抗性和敏感品种不同,显示不同的分子反应美国scitamineum挑战。表明蛋白质的表达是由不同功能监管模式,导致抗性品种的抗性或易感品种黑穗病的易感性。

在目前的研究中,观察到23蛋白质的表达,16在ya71 NCo376和7 - 374,显然改变了之前和之后美国scitamineum接种。在这些蛋白质中,八个蛋白的表达量(没有。2,没有。3,没有。6,不。9日,没有。11日,没有。13日,没有。14,没有。19)和六个蛋白质(没有增加。 4, no. 5, no. 8, no. 18, no. 21, and no. 22) decreased plus two proteins newly induced after infection (no. 1, and no. 15) in NCo376, while in Ya71-374, the expression of three proteins (no. 7, no. 16, and no. 17) increased, the expression of three proteins (no. 12, no. 20, and no. 23) decreased, and one protein was newly induced after infection (no. 10) as shown in Figures1,2,3和表1。这些差异表达蛋白分别切除干净的小刀的后续MALDI-TOF-TOF / MS分析。

3.2。MALDI-TOF-TOF / MS分析差异表达蛋白质

23微分MALDI-TOF-TOF / MS分析的蛋白质,肽质量指纹和串联质谱的20蛋白质获得成功。公用事业高峰中没有检测到三种蛋白质编号为21日22日和23日,这可能是由于他们的低丰度或一些未知的因素在样品制备过程中,或由于峰值太低获得肽质量指纹图谱。对于其他20个差异蛋白,他们成功地识别MALDI-TOF-TOF / MS分析。生物信息学分析表明,这些蛋白质的功能是与光合作用等功能,信号转导和抗病性。其中,共有9个photosynthesis-related蛋白质构成了最大的比例,比例为45%;五是disease-resistance-related蛋白质占25%;一个signal-transduction-related蛋白质占5%,也有三个function-unknown蛋白质20识别蛋白质占总数的15%。数据4和5显示肽质量手指印刷,串联质谱,两种蛋白质同源的氨基酸序列(没有。9,没有。10)。

4所示。讨论

工厂发展的过程中,甘蔗是经常出没的病原体(包括细菌、真菌和病毒)是主要的生物压力。无论植物和病原体之间的交互是一种抗病(non-affinity交互)或敏感反应(亲和相互作用),这是由于寄主植物的抗病基因之间的相互作用和相应的非病原性病原体的基因,这可能引起的结果协调一系列防御基因的表达在寄主植物。然而,在亲和相互作用的反应或non-affinity交互,差异基因在空间分布有显著差异,表达率和表达强度(16]。因此,这些差异基因表达水平的直接出现在各种产生率、强度和空间分布的蛋白质在抗病和易感品种植物和病原体之间的交互(8,17]。

直到现在,植物蛋白质组学的研究主要集中在一些植物物种基因组测序完成,尤其是在模式植物等o .漂白亚麻纤维卷和答:芥。到目前为止,鉴定的蛋白质功能继续依赖功能基因组学研究在基因层面上,尤其是ETS功能的研究。甘蔗的实现和成功完成项目,大约290000个表达序列标签(EST)序列在甘蔗已经公布,但这些资产可能没有完全覆盖大基因组的甘蔗,和大多数EST序列获得的功能尚未阐明。因此,这些数据是远离蛋白质质谱鉴定的要求,而应用程序的蛋白质数据库相关的物种在相同或相似的压力(如真菌)可以提高相应的成功率(18]。然而,仍然有三种蛋白质在这项研究它的功能还没有注释。近年来,随着蛋白质表达谱的研究不同植物在不同的生理和生态条件下,尽管许多新的蛋白质与plant-microorganism交互被挖出来,几乎没有研究,旨在研究这些蛋白质的功能和模型。我们发现,只有李et al。(2004)利用蛋白质组学技术和确定一个calcium-dependent的根微粒体膜蛋白盐反应答:芥,通过反向遗传学方法的应用程序,他们证实,这种蛋白质能调解渗透压力和ABA信号转导通过calcium-dependent模式(19]。

据我们所知,这是第一个报告侧重于强调蛋白质表达谱的变化在甘蔗暴露美国scitamineum。甘蔗和之间的相互作用的蛋白质组学方面的调查美国scitamineum提供信息的最终目的,可能是有用的发展有效的甘蔗黑穗病疾病管理系统。在目前的研究中,蛋白质组学分析技术,2 de加上MALDI-TOF-TOF /女士,被用来分析差异表达蛋白在甘蔗,甘蔗美国scitamineum交互。这种方法使直接差异表达蛋白质的定性、定量分析疾病发展的时期。总共得到了23个差异表达的蛋白质,其中20人成功地识别MALDI-TOF-TOF / MS分析。根据质谱鉴定和生物信息学分析,这些蛋白参与多种代谢途径,如蛋白质合成、信号转导和光合作用。此外,还有5个蛋白在甘蔗和之间的交互中扮演了其他功能美国scitamineum,剩下的三个不确定的功能。这些蛋白质可以分为以下组。

4.1。Protein-Synthesis-Related蛋白质

HSP是一组特定蛋白质的生物(或孤立的文化细胞)可引起高盐、阿坝压力,重金属污染和发挥作用的分子伴侣’(20.]。Osmotins,其表达与抗旱性,盐宽容,和植物抗病性,是一种新合成的或增加蛋白质当植物面临渗透压力(21]。此外,osmotins的积累可能是一种基本的原始植物免疫反应,产生的免疫反应和osmotins甚至可能作为脱水储存蛋白也具有抗真菌活性(22]。从上面两种蛋白的表达增加,HSP(第15号)和osmotin(13号),可以保护细胞结构和修复中发挥作用的细胞功能障碍在甘蔗-美国scitamineum交互。

4.2。信号转导蛋白

Nucleotide-binding-site(国家统计局)电阻型蛋白质编码的产品国家统计局在植物抗病基因。激酶活性和扮演相同角色的信号因子和转录激活下游抗病基因的表达(23]。他们还可以激活激酶或G蛋白,参与蛋白质磷酸化,和植物抗病反应信号的放大,然后植物病原体产生过敏的反应,在植物抗病反应中扮演着很重要的角色(24,25]。在这项研究中,国家统计局的慷慨表现蛋白质称为No.19 high-smut-resistance甘蔗可能只是其抗病力强的基础。一方面,它可能smut-resistance直接发挥作用;另一方面,它也可以作为激酶,并激活下游抗病基因的表达和甘蔗smut-resistance。

4.3。Photosynthesis-Related蛋白质

光合作用是植物最重要的生理过程之一,起着决定性作用的增长率的植物,尤其是对C4作物。二磷酸核酮糖羧化酶是光合作用的一个关键酶。它可以调节光合作用和光呼吸并决定净光合作用[26]。先前的研究表明,二磷酸核酮糖羧化酶不仅有器官特异性,也可以引起许多外生因素如水杨酸治疗和盐和干旱胁迫(27]。出租车基因是一个重要的基因在植物光合系统,其编码并且/ b-binding蛋白质可以绑定与色素形成色素蛋白复合物,可以捕获光能,传输能量快速反应中心,推动光化学反应,从而发挥重要作用在光保护和适应不同环境28]。此外,Rieske Fe-S前体蛋白是人体不可或缺的组成叶绿素光合作用转移链。这种蛋白质的差异表达可能与累积H₂O₂体内叶绿素和叶绿素身体的氧化还原状态变化,这可能是一种反应ya71 - 374美国scitamineum压力在蛋白质水平。当smut-susceptible甘蔗品种、ya71 - 374,是感染美国scitamineum,树叶从绿色变成黑色和主茎和茎分支的形式源于黑穗病鞭笞,导致植物死亡。这表明,感染美国scitamineum影响植物叶绿素的正常功能。然而,当high-smut-resistance甘蔗品种、NCo376感染美国scitamineum,叶表面没有疾病症状,表明其光合作用没有显著影响。在这项研究中,九photosynthesis-related蛋白质的表达(2号,3号,6号,7号,9号,11号,14号,号,和十七)是调节,这很可能表明,在甘蔗和之间的交互美国scitamineum,为了捍卫病原体挑战,photosynthesis-related蛋白质的表达,这是有利于光合系统的保养和维修,是调节。此外,增长潜力,从而改善甘蔗植物的生长,并维持植物的健康状况,进而增加煤尘阻力。

4.4。其他功能的蛋白质

其中包括五个蛋白质(1号、5号、8号、10号和12路)。地图代表微管蛋白,非特异性结合核酸和蛋白质发挥助手作用在微管功能蛋白质的相互作用。他et al。(2006)发现,地图的形成发挥了重要作用纤维初生壁(29日]。这被认为在甘蔗新地图的诱导表达(1)有利于抵制的挑战美国scitamineum。细胞色素c过氧化物酶是植物抗毒素的合成过程中关键酶有抑制作用的疾病(30.]。在这项研究中,细胞色素c过氧化物酶称为10号刚刚感应感染后,作者认为hydrogen-peroxide-redox-type细胞色素c反应(2细胞色素c (Fe^{2 +})+ H₂O₂+ 2 h⁺ 2细胞色素c (Fe^{3 +})+ 2 h₂O)是调节细胞色素c的表达过氧化物酶的催化,这提高了增加植物抗毒素的合成和抑制的增长美国scitamineum因此减少的危害美国scitamineum。其他三个蛋白质(没有的功能。5、8号和12)还有待确认。

4.5。Function-Unknown蛋白质

总共包括三种蛋白质称为4号,18号和20号。

从上述所有,据推测,是一个复杂的蛋白质在甘蔗的互动——监管网络美国scitamineum。这些蛋白质可能只是管理网络如下:当挑战美国scitamineum、甘蔗NBS-type蛋白质接收和传输的压力信号,激活防御反应蛋白的表达,从而促进HSP的合成和osmotins;光合作用相关蛋白的微分表达式加速甘蔗的生长速度,以及其他功能抗性蛋白的表达。总之,一系列的差异表达蛋白质形成密切相关的监管网络的耦合各种内源信号分子和相关代谢途径,提高甘蔗的阻力美国scitamineum。

5。结论

本研究报告中的差异蛋白表达甘蔗在回应美国scitamineum感染了2 de和MALDI-TOF-TOF /女士。结果表明,蛋白质含量有显著差异2 de图谱抗性和敏感品种之间,以及接种和控制甘蔗。总共23蛋白质,包括11个调节,九个表达下调,和三个新诱导感染后,被MALDI-TOF-TOF / MS鉴定。相应的蛋白质肽质量指纹识别和串联质谱的20这些蛋白质获得成功。生物信息学分析显示,这些20的函数微分与光合作用有关的蛋白质,信号转导,抗病性,等等,而其余三种蛋白质的功能并不确定。从上面,这被认为是一个复杂的蛋白质调控网络在甘蔗和之间的交互美国scitamineum。这是第一个蛋白质组调查报告侧重于强调蛋白质表达谱的变化在甘蔗暴露美国scitamineum。本研究丰富了甘蔗的蛋白质基础响应的感染美国scitamineum从而为甘蔗反应提供参考信息美国scitamineum在蛋白质水平应力,但功能之间的相互关系在每个功能的蛋白质组和蛋白质组仍需进一步研究。此外,耗时需要努力,这样更差的蛋白质可以被识别和个体蛋白质追究在互动的持续时间,从开始到终止。

确认

这项研究是由现代农用工业技术研究专项基金系统(CARS-20)和中国国家高技术研究发展计划(863计划)项目(F2007AA100701)。作者感谢审稿人的所有想法和建设性的批评,特别是博士Thomas l .东奔西走,甘蔗研究中心研究遗传学家,USDA-ARS,霍拉,美国。

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