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国际基因组学杂志
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国际基因组学杂志/2011年/文章

研究文章|开放获取

体积 2011年 |文章的ID 876064年 | https://doi.org/10.1155/2011/876064

张赛,Yunmin徐,羌族傅,凌家,Zhonghuai香,他Ningjia, ”从蚕幼虫中肠(蛋白质组学分析家蚕)”,国际基因组学杂志, 卷。2011年, 文章的ID876064年, 13 页面, 2011年。 https://doi.org/10.1155/2011/876064

从蚕幼虫中肠(蛋白质组学分析家蚕)

张赛,1 Yunmin徐,1 羌族傅,1 凌贾,1 Zhonghuai香,1 和 Ningjia他1

1农业部的重点养蚕的实验室,生物技术学院,西南政法大学,贝贝,400715年重庆,中国

学术编辑器:g . Pesole
收到了 2010年9月3日
修改后的 2011年1月14日
接受 2011年3月07
发表 2011年5月18日

文摘

中肠主要器官对食物的消化,营养吸收和对外国物质也是一个障碍。5 th-instar蚕幼虫阶段幼虫增长是非常重要的,开发和丝绸生产。在目前的研究中,我们使用2 de和matrix-assisted激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析中肠蛋白5 th-instar幼虫中肠蛋白在饥饿条件下。共有96个蛋白质被确定在本研究;,其中,69年首次在中肠蛋白。我们还发现,蚕幼虫中肠应对饥饿通过生产10 kDa热休克蛋白和滞育激素前体。

1。介绍

蚕,家蚕,是丝绸生产的驯化的昆虫。lab-reared动物,其相对大尺寸允许蚕是一个重要的模型在结构和分子遗传学和功能基因组学(1]。此外,蚕也是一个食植物的昆虫,因此代表鳞翅类昆虫害虫。

蚕,完全变态的昆虫,有四个明显不同的发育阶段:卵、幼虫、蛹、蛾。的幼虫是唯一阶段动物饲料和排泄在整个生命周期。这个阶段,尤其是5日龄,是非常重要的,因为幼虫有足够的营养成长,发展,丝绸生产。的形成幼虫中肠上皮细胞组成的单层柱状,杯状,干细胞(2]。柱状细胞主要负责食物消化和营养吸收。消化控制通常是通过在肠道消化酶和依赖于定位(3]。柱状细胞的顶端膜的特点是高度发达的刷状缘(4]。肠道杯状细胞参与离子调节,负责更新和再生细胞上皮细胞在变形(5]。

中肠也是一个障碍在食物消化外来物质。人们已经发现,某些蛋白质如脂肪酶(6和sp 27在中肠有抗病毒活性家蚕核多角体病病毒(BmNPV)。此外,中肠早期被认为是害虫控制的一个重要目标。一个成功的范例是转基因作物生产b基因水晶δ木糖醇。这些毒素结合受体,然后形成一个prepore低聚物的结构单元通过内容泄漏导致昆虫的死亡(8]。另一种方法更具体的控制昆虫的沉默基因的表达通过RNA干扰(RNAi)中肠(9]。

为了理解营养消化和midgut-derived防御的分子机制,姚明et al。(10)和Kajiwara et al。11)分别报道了蚕幼虫中肠的蛋白质组学分析。前者分析只执行在5 th-instar第三天蚕幼虫和后来的工作集中在中肠蛋白从5 th-instar第二天幼虫。众所周知,生化代谢的发展极大地改变了在5日龄幼虫中肠。在我们目前的研究中,我们感兴趣的是确定蛋白质参与倒数第二龄幼虫中肠发展。此外,当饥饿行动在动物,动物将暴力应对饥饿引发紧急蛋白质代谢的变化(12,13]。这些也可以揭示了蛋白质组学分析。

在目前的研究中,我们使用两种结合MALDI-TOF-MS分析5 th-instar幼虫的中肠蛋白在正常和饥饿条件。结果,96蛋白被发现在这项研究中,其中69蛋白质被首次发现。研究结果还表明,饥饿蚕幼虫产生10 kDa热休克蛋白和滞育激素前体来响应这个不利条件。

2。材料和方法

2.1。昆虫和蛋白质制备

蚕应变p50(选用)用于本研究提供的养蚕和系统生物学研究所中国的西南政法大学。幼虫饲养在新鲜的桑叶25°C到第五天龄3。然后,幼虫被随机分为两组。组我仍然被饲养的幼虫在新鲜的桑叶,而在第二组中被饿死,直到徘徊阶段(约240 h)。幼虫从每组随机抽样解剖在24小时的时间间隔,和中肠0.75%氯化钠溶液清洗和储存在−20°C。幼虫中肠是磨成粉用研钵和研杵在液态氮。从蚕中肠蛋白提取1毫升裂解缓冲(8 M尿素,4% (M / v) 3 ((3-cholamidopropyl) dimethylammonio] 1-propane磺酸盐(Sangon皮套裤,中国上海)和4% (M / v)二硫苏糖醇(DDT、BBI、加拿大))在4°C 40分钟。在12000克15分钟使离心两次后,收集上层清液的蛋白质组学分析。蛋白质的浓度是衡量布拉德福德装备制造商的指示所述(TIANGEN,北京)。

2.2。二维凝胶电泳

中肠蛋白是由二维电泳分离根据制造商的指示(美国通用电气医疗集团)。短暂,蛋白质溶解在补液(8 M尿素,2%的皮套裤,DDT的0.28%,和1% IPG缓冲区pH值3 - 10)。蛋白质溶液被加载到一个固定化PH梯度带(IPG地带,18厘米,线,PH值3 - 10,通用电气医疗集团,瑞典)。等电点聚焦(IEF)进行如下:50 V 12 h, 1 h 100 V, 200 V 1 h, 30分钟500 V, 1000 V 30分钟,30分钟3000 V, 8000 V 70000 Vhr(电压乘以时间)。当前没有超过50 mA /地带。能源论坛后合作,他们将平衡平衡缓冲我(50 mM Tris-HCl pH值8.8 6 mol / L尿素、30%甘油、2% SDS和1%德勤)15分钟,然后在第二缓冲区(iodacetamide取代1%德勤2.5%)15分钟。平衡凝胶地带SDS-polyacrylamide凝胶加载到12.5%。电泳是在一个Ettan DALTsix垂直电泳系统(Amersham生物科学、瑞典)10 mA /凝胶大约1 h,然后切换到40 mA /凝胶直到溴酚蓝达到凝胶的底部。蛋白质被银染色可视化。

2.3。凝胶图像分析

结果二维凝胶是由图像扫描器扫描III(美国通用电气医疗集团)与LabScan 6.0软件(美国通用电气医疗集团)光学300 dpi的分辨率。分析了扫描凝胶使用ImageMaster 2 d铂6.0(美国通用电气医疗集团)软件提供的制造商,和斑点检测的参数设置为光滑:2 - 5,minarea: 30 - 50,和特点:5 - 15。

2.4。为胶液消化和MALDI-TOF-MS分析

凝胶的蛋白质斑点切除切成小块(约1毫米3)和转移到0.5毫升埃普多夫管。为胶液消化是根据先前描述的是什么14]。总之,100年μL使脱色溶液(15 K更易/ L3[Fe (CN)6),50更易与L Na2年代2O3)被添加到每个管10分钟使脱色。然后,凝胶块与ddH洗2O为15分钟的三倍。这种凝胶脱水与100μL ACN直到凝胶块不透明的白色。雨是离心后丢弃。凝胶块在室温下干了40多分钟。50微克胰蛋白酶在25毫米NH(10毫克/毫升4HCO3美国,PH值8.0σ)被添加到每个管和孵化进行了37°C - h。30的胰蛋白酶的肽提取两次μL 50% ACN / 5%三氟乙酸(美国σ组织)。上层清液池,干在Centrivap冷阱(美国LABCONCO)。在质谱分析之前,肽被再溶解在3μL组织ACN 50% / 0.5%,同样与饱和混合α-cyano-4-hydroxycinamic酸(美国σCHCA)。的质谱肽被记录在“航行者”号DE PRO MALDI-TOF-MS(美国应用生物系统公司)。数据库用于分析蛋白质序列包含两部分:6642蚕蛋白质序列从NCBI下载(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的关键字以下物质蚕和14623序列生成的注释基因组序列(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/doc/download.html)。蛋白质的质谱分析和过程识别进行了根据一项研究[14]。

2.5。RNA提取和实时PCR

中肠组织的总RNA提取两组使用试剂盒试剂(美国表达载体)。RNA样本溶解在RNase-free水,使用分光光度计测量浓度(Amersham生物科学、瑞典)。根据协议,3μ克总rna被用来合成第一链cDNA 25μL(逆转录PCR系统lamv逆转录酶(美国Promega)。为实时PCR引物设计10 kDa小热休克蛋白基因5′-GTTCCTCTTCTGGACCGTG-3′(向前)和5′-GACCGACCGCTACTACTTCT-3′(反向),和滞育激素前体基因5′-GGAAATGTACCAACCTGACCC-3′(向前)和5′-AACGCTTCTGGCAACCCTAT-3′(反向)。实时PCR进行了一式三份,每个基因的兴趣20μL与逆转录反应产品,2×PCR缓冲,50×火箭参考染料,100海里的正向和反向引物,和自由ddH2O核糖核酸酶。PCR反应是ABI棱镜上执行7000序列检测系统(应用生物系统公司)使用以下程序:初始变性在95°C 10秒和40 95°C的周期5秒60°C 31秒。β-actin3作为内部控制。

3所示。结果

3.1。2 de的蚕幼虫中肠蛋白

蚕中肠蛋白提取的fifth-instar第四天(V4)第八天(V8)喂养的幼虫和fifth-instar第四天(V4N)第十三天(V13N) nonfeeding幼虫。总共15个拔牙被二维分离技术,如补充数据1和2所示在补充资料http://dx.doi.org/10.1155/2011/876064。蛋白质斑点被发现使用ImageMaster 2 d铂6.0软件。在凝胶V4 V8, 439, 461, 498, 606,和620个蛋白质斑点检测。和凝胶V4N V13N, 420, 455, 500, 610, 630, 635, 643, 640, 660,和684个蛋白质斑点检测。蛋白质点的数量逐渐增加,幼虫在两组的发展。如图1,V7凝胶的蛋白质斑点的数量和旅行者DE PRO MALDI-TOF-MS进一步分析。被GPMAW软件搜索后,蛋白质有超过五个匹配肽和多肽的覆盖率大于20%的人接受。研究结果总结在表1。共有96个蛋白质被确定。其中,蛋白质斑点。95年和96年只有在nonfeeding发现中肠。从先前的研究相比,获得的数据(10,11,15,16),69个蛋白质,占71%的蛋白质,在我们目前的研究第一次发现。基于分子功能和注释(见下文),这些96蛋白质被分为12类,包括:(1)8是营养储存、(2)三个细胞生长,(3)16个蛋白质代谢,(4)三个碳水化合物代谢,(5)九对脂质代谢,能量代谢(6)十八岁,三几种蛋白质(7),(8)两个抗氧化蛋白,(9)11肌肉蛋白质,五是激素代谢(10),(11)16其他功能,(12)两个未经蛋白质。确定蛋白已经被提交http://silkworm.swu.edu.cn/cgi-bin/wego/index.pl去(基因本体)注释。如图296蛋白质被分为三组细胞组件,包括分子包含绑定函数,催化,运输车,电子载体,和抗氧化剂,与生物过程参与代谢,细胞过程,和生物的监管。
蛋白质的分类 点不。 蛋白质的描述 加入数量 兆瓦(kDa) /理论π 报道
(%)		 V4 / V4N
(F / N)		 V5 / V5N
(F / N)		 V6 / VN
(F / N)		 V7 / V7N
(F / N)		 V8 / V8N
(F / N)		 V9N
(N)		 V10N
(N)		 V11N
(N)		 V12N
(N)		 V13N
(N)
营养储存 8 30 kDa蛋白(家蚕] ACO35750 29.83/5.90 23.8 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
37 30 K脂蛋白前体(家蚕] CAA30433 30.26/7.08 32.6 − / − + / − + / + − / − − / − − − − − −
38 21 g1precursor Low-molecular-mass 30 kDa脂蛋白(家蚕] CAA38531 32.98/6.19 26.5 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
57 Low-molecular-mass 30 kDa脂蛋白19 g1 (家蚕] CAA38533 32.41/9.58 65.5 − / − − / − − / − + / − + / + − − − − −
60 Low-molecular-mass 30 kDa脂蛋白21 g1前体(家蚕] Q00801 30.35/6.38 50.2 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
82年 低分子30 kDa脂蛋白PBMHPC-19前体(家蚕] NP_001095197 29.41/7.20 33.9 − / − − / − − / − + / + + + + / + + + + + +
85年 Low-molecular-mass 30 kDa脂蛋白19 g1 (家蚕] CAA38533 29.56/7.91 39.1 + / − − / + + / + + / + + / + + + + + +
90年 成熟30 K脂蛋白(家蚕] CAA30434 28.57/6.37 44.0 − / − − / − − / − + / + + / + + + + − +
细胞生长 45 成虫的磁盘生长因子(家蚕] BAF73623 48.39/7.79 28.3 − / − − / − − / − + + / + + + / + + + + + + + + + + + +
50 Actin-depolymerizing因子1 (家蚕] NP_001093278 17.23/6.19 41.2 + / + + / + + / + + / + − / + + + + + +
75年 转铁蛋白(家蚕] NP_001037014 77.20/6.84 27.5 − / − + / + + / + + / + + / + + + + + +
蛋白质代谢 3 60 kDa热休克蛋白、线粒体(黑腹果蝇] NP_511115 61.23/5.37 23.6 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
7 蛋白磷酸酶1催化亚基(家蚕] NP_001040480 32.28/5.80 40.5 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
18 Acireductone加双氧酶(埃及伊蚊] XP_001649899。 21.91/4.85 40.8 + / − + / − + / + + / + + / + + + + + +
28 乙醛酸还原酶/ hydroxypyruvate还原酶(这种致倦库蚊] XP_001865660 37.34/7.94 32.4 − / − + / − + / + + / + + / + + + + + +
40 蛋白二硫化物异构酶(埃及伊蚊] ABF18378 46.34/5.11 33.4 − / − − / − + / + + / + + / + + + + + +
43、44 DnaJ-like蛋白(家蚕] NP_001040185 59.96/7.32 29.9 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
46 Dihydrolipoamide脱氢酶(家蚕] AAM93255 52.94/8.90 27.8 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
47 天冬氨酸转氨酶(家蚕] ABF51214 40.32/5.87 32.3 − / − − / − − / − + / − + / + + + + + +
52 蛋白质disulfide-isomerase-like ERp57 [家蚕] NP_001036997 55.48/5.17 37.1 − / − + / + + / + + + + + / + + + / + + + + + + +
58 核糖体蛋白P0 [家蚕] NP_001037123 34.24/5.61 41.8 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
63年 泛素羧基末端水解酶(黑腹果蝇] NP_476940 25.52/4.87 29.6 + / + + / + + / + + / + − / + + + + + +
70年 核糖体蛋白P2 [家蚕] NP_001037213 21.20/5.79 38.3 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
74年 热休克蛋白70 (家蚕] NP_001036837 73.21/4.98 26.0 − / − + / + + / + + + / + + + / + + + + + + + + + +
87年 Peptidylprolyl异构酶B (家蚕] NP_001040479 22.39/8.91 42.9 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
95年 10 kDa热休克蛋白、线粒体(Lepeophtheirus salmonis] ACO11796 11.18/7.68 49.5 − / − − / − − / − − / + − / + + + + + −
碳水化合物代谢 6 烯醇酶(家蚕] NP_001091831 47.19/5.55 41.6 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
13 Triosephosphate异构酶(家蚕] AAU34185 26.94/5.60 50.8 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
31日 Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(家蚕] NP_001037386 35.42/8.55 29.2 − / − + / − + / + + / + + / + + + + + +
脂质代谢 30. Enoyl-CoA水合酶前体1 (家蚕] ABD36107 32.13/8.33 45.9 − / − + / − + / + + / + + / + + + + + +
35 脂肪酸结合蛋白(家蚕] NP_001037574 15.01/5.08 24.2 + / + + / + + + / + + + / + + + / + + + + + + + + +
36 Apolipophorin-III前体(家蚕] AAB02852 20.82/9.53 43.0 + / + + / + + / + + / + − / + + + + + +
48 Acyl-coenzyme脱氢酶(家蚕] NP_001037672 47.53/7.16 22.7 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
54 Acyl-coenzyme脱氢酶(埃及伊蚊] EAT42766 35.81/7.18 44.5 − / − − / − − / − + / − + / + + + + + +
56 3-hydroxy酰coa脱氢酶(家蚕] NP_001040414 33.80/8.87 28.4 − / − − / − − / − + / + + / + + + + − +
65年 溶血磷脂酶(家蚕] NP_001040255 25.97/6.94 36.2 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
79年 Acetoacetyl-CoA硫解酶(家蚕] NP_001093296 40.00/7.56 42.6 − / − − / − − / − + / + − / + + + + + +
91年 2(磷脂酰乙醇胺结合蛋白对碘氧基苯甲醚家蚕] NP_001093267 21.92/5.94 47.7 − / − − / − − / − + / + + / + + + + − +
能量代谢 1 2 [H +运输ATP合酶β亚基对碘氧基苯甲醚家蚕] NP_001041705 54.89/5.20 37.8 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
5 1 [H +运输ATP合酶β亚基对碘氧基苯甲醚家蚕] NP_001040450 55.04/5.13 33.9 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
15 异常翼盘状蛋白质的叶绿体会(家蚕] NP_001093284 17.37/7.30 48.1 + + / + + + + / + + + + + / + + + + / + + + / + + + + + + + + + + + + + + +
20. 空泡的ATP合酶亚基F [家蚕] NP_001040448 13.92/5.92 50.0 + / − + / − + / + + / + + / + + + + + +
22 细胞色素c氧化酶亚基Va (家蚕] NP_001106742 17.24/5.59 31.8 + / + + / + + / + + / + + / + + + + − +
23 H +运输ATP合酶δ亚基(家蚕] NP_001093091 17.16/5.66 49.1 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
33 H +运输ATP合酶亚基d [家蚕] NP_001093279 20.20/5.49 39.7 + / + + / + + / + − / − − / − − − − − −
51 空泡的腺苷三磷酸酶B亚基(家蚕] ACE78271 55.19/5.20 38.1 − / − − / − + / + + + + / + + + / + + + + + + +
53 Ubiquinol-cytochrome c还原酶(家蚕] ABF60225 29.43/8.52 23.1 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
55 空泡的ATP合酶催化亚基(家蚕] NP_001091829 68.60/5.13 38.7 − / − + / + + / + + + + / + + + / + + + + + + + + + + + +
64年 ATP合酶亚基α(家蚕] BAA03725 28.66/8.43 41.9 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
66年 ATP合酶亚基α(家蚕] BAA03725 28.66/8.43 41.9 − / − − / − − / − + + / + + + / + + + + + + + +
71年 4-Hydroxybutyrate CoA-transferase,公认的埃及伊蚊] EAT44921 43.62/6.61 28.1 − / − − / − − / − + + + / + + + / + + + + + + + + + + + +
76年 精氨酸激酶(家蚕] ACI01048 40.33/5.84 36.9 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
77年 Ubiquinol-cytochrome c核心蛋白还原酶II (家蚕] NP_001106225 46.18/9.55 22.4 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
86年 ATP合酶亚基α(家蚕] Q07405 28.66/8.43 41.9 − / − − / − − / − + / + + / + − − − + +
88年 ATP合酶亚基α(家蚕] Q07405 28.66/8.43 41.9 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
92年 NADH脱氢酶(辅酶q) Fe-S蛋白8 (家蚕] NP_001040316 25.49/6.14 31.2 − / − − / − − / − + / + + / + + + + − +
免疫相关的 4 几种Hdd13 [Hyphantria cunea] AAD09281 28.38/6.86 60.8 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
16 还有(家蚕] NP_001037301 18.10/7.97 73.9 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
17 还有(家蚕] ABA54173 18.12/7.97 62.4 + / + + / + + / + + / − − / − − − − − −
抗氧化作用 34 谷胱甘肽S-transferase 10 [家蚕] NP_001108466 24.47/8.11 26.7 − / − + / − − / − − / − − / − − − − − −
89年 硫醇的酶类(家蚕] AAR15420 22.08/6.10 35.9 + / + + / + + / + + / + − / + + + + + +
肌肉相关 2 肌动蛋白A3 (家蚕] CAA28192 42.23/5.38 31.9 + / + + / + + + + / + + + + + + / + + + + / + + + + + + + + + + + + +
9 肌动蛋白,muscle-type A1 (家蚕] G 我 | 1 1 3 2 1 6 | 42.27/5.19 29.3 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
14 肌动蛋白,细胞质A4 (家蚕] NP_001119727 30.05/5.80 24.7 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
21 肌球蛋白轻链(1Lonomia斜] AAV91411 22.77/4.31 33.0 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
39 肌动蛋白,细胞质A4 (家蚕] NP_001119727 30.05/5.80 25.5 − / − − / − − / − + / − − / + + + + + +
59 Beta-tubulin [家蚕] NP_001036887 25.18/4.51 30.8 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
61年 肌球蛋白重链(家蚕] ACQ72825 96.12/4.98 20.2 − / − − / − − / − + / − + / − − − + + +
62年 肌球蛋白轻链2 (家蚕] ACF59735 22.04/4.52 32.8 − / − − / − − / − + / − − / + + + + + +
67年 肌肉蛋白质20 [家蚕] NP_001040476 20.30/8.81 45.7 − / − − / − − / − + / − + / − − − − + +
68年 Transgelin [家蚕] NP_001040372 20.91/8.40 85.0 − / − − / − − / + + / + + / + + + + + +
93年 肌球蛋白轻链2 (家蚕] NP_001091813 22.04/4.52 30.3 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
激素代谢 24日,25 保幼激素二醇激酶(家蚕] NP_001037080 20.79/4.42 39.5 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
83年 假定的farnesoic O-methyl酸转移酶(家蚕] NP_001091815 26.83/6.73 35.1 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
94年 假定的farnesoic O-methyl酸转移酶(家蚕] NP_001091815 24.26/5.03 28.7 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
96年 滞育激素前体(家蚕] BAA03755 22.39/9.44 60.9 − / − − / − − / + − / − − / + − − − + +
其他蛋白质 10 27 kDa糖蛋白,p27K [家蚕] Q8T113 25.58/4.95 25.1 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
11 细胞视黄酸结合蛋白(家蚕] NP_001037364 14.97/5.53 56.8 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
12 星尘,同种型B (黑腹果蝇] NP_572463 32.15/5.81 26.3 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
19 NADPH氧化酶(这种致倦库蚊] XP_001859059 30.17/8.35 35.1 + + / + + + / + + + / + + − / − − / − − − − − −
29日 类似于CG31790-PA [种有害castaneum] XP_971960 50.42/6.01 22.0 − / − + / − + / + + / − − / + + + + + +
32 Serpin-2 [家蚕] NP_001037021 41.86/4.72 21.1 − / − + / + + / + + / + − / + + + + + +
41 GE24263 [果蝇yakuba] EDW97530 47.04/5.95 29.3 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
42 预测:假想蛋白(Nasonia vitripennis]。 XP_001602573 51.08/5.68 28.5 − / − − / − + / + + / + + / + + + + + +
49 AGAP011050-PA [冈比亚疟蚊] EAA45511 34.16/6.09 39.7 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
69年 GI18783 [果蝇mojavensis] EDW09939 18.98/4.74 39.9 + / + + / + + / + + / + + / + + + + + +
72年 线粒体醛脱氢酶(家蚕] NP_001040475 56.24/7.55 29.6 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
73年 可溶性guanylyl环化酶beta 1亚基(Manduca sexta] AAC61264 36.77/5.55 20.1 − / − − / − − / − + / − + / − − − − − +
78年 假定的乙酰基转移酶(家蚕] BAH96561 42.01/7.84 31.0 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
80年 预测:类似于CG10122-PA (种有害castaneum] XP_970918 43.23/5.03 20.2 − / − − / − + / + + / + + / + − − + − +
81年 1 (Ef1alpha-like因素对碘氧基苯甲醚家蚕] NP_001040118 31.48/7.84 46.4 − / − − / − + / + + / + + / + + + + + +
84年 压敏电阻器anion-selective通道(黑腹果蝇] NP_001033899 30.13/7.45 35.5 − / − − / − − / − + / + + / + + + + + +
未经 26 未知(家蚕] BGIBMGA004116 12.80/4.49 43.1 + / + + / + + / + − / − − / − − − − − −
27 未知(家蚕] BGIBMGA013360 53.34/5.80 33.1 − / − + / − + / + + / + + / + + + + + +
总 96年 37/34 47/40 52/54 85/87 75/84 80年 80年 82年 78年 85年
“+”和“−”表明蛋白质有或没有表情,分别。“+”的数量意味着x-fold表达式与“+”。Vx是指fifth-instar x天幼虫,“F”意味着喂养,“N”意味着nonfeeding。
表1
列表中肠的蛋白质鉴定家蚕。

图1
μ 1 中肠蛋白的二维剖面在fifth-instar第七天幼虫。总共有300g蛋白中肠的pH值应用到3 - 10 Immobiline dryStrip first-dimensional电泳(18厘米),然后12.5% sds - page分离。2 de的凝胶被银染色。蛋白质识别研究中表明,号码对应的表。

图2
去确定蛋白质的分类Wego软件。
3.2。蛋白质的变化模式发展的正常喂养蚕幼虫中肠

如图1和补充数据1,蚕中肠蛋白的组成不同于V4 V8。蛋白质点的数量,尤其是那些规模从30 kDa 90 kDa更高π地区,逐渐增加,幼虫的生长。表1显示,64中肠蛋白的丰度是不同的从V4到V8,主要包括那些参与营养储存、蛋白质/脂质/能量代谢和肌肉蛋白质。其中最著名的是十三个蛋白质超过双重的微分表达式。两位对应于一个保幼激素二醇激酶(JHDK)和fatty-acid-binding蛋白质从V4 V8在场,并显示最高的表达水平在V6(数字3(一)和3(b))。异常翼盘状蛋白质的叶绿体会有一个峰值在V7中(图3(c))。从数据3(d)3(我),一个可以看到十蛋白质其中两人low-molecular-mass 30 kDa脂蛋白19 g1和PBMHPC-19前体,三是ATP合酶亚基,和五个,分别蛋白质disulfide-isomerase-like (PDI) ERp57,烯醇酶,精氨酸激酶,Enoyl-CoA水合酶前体1和肌动蛋白表达在V8相对较高水平。从表1,我们还发现,6蛋白(现货没有。17日,19日,26日,33岁的34岁和37),30 K脂蛋白前体,H +运输ATP合酶亚基,还有,谷胱甘肽S-transferase10, NADPH氧化酶,和一个未知的蛋白质,几乎没有可检测在蜕变之前喂养幼虫。


图3
局部放大的正常喂蚕中肠蛋白变化与发展。红色箭头指出目标蛋白质和他们的名字分别是显示在右边。Vx意味着fifth-instar x天幼虫。
3.3。中肠蛋白以应对饥饿

后与桑叶喂了三天奶,这些喂蚕幼虫分离的一部分饥饿治疗。饥饿的幼虫存活了10天。他们中的大多数都死了在饥饿。在13天(V13N),一些幼虫化蛹挣扎。中肠是精心收集在一天24小时间隔从饥饿幼虫到13 (V13N)。我们随后研究了这10个蛋白质样本V4N通过二维电泳V13N加上MALDI-TOF女士补充2的数据显示,蛋白质的V4N V5N非常相似,和两个凝胶上的蛋白质斑点的数量是随着饥饿时间的增加而减少,在V4和V5相比。然而,现货是活动增加V6N V5N相比。在V6N V12N凝胶,蛋白斑点的数量也增加,变化从610年到660年。的蛋白质分布模式V6N V12N与V5 V8,这表明饥饿幼虫可能原封不动地保留了自己的中肠和功能在一段时间内。同样重要的是要注意,在V13N现货数量增加,到684年,可能重合的显著改变匮乏幼虫阶段。

综述了饥饿的幼虫中肠的蛋白质鉴定表1。如表所示1,超过50%的识别蛋白质nonfeeding蚕幼虫有相似的变化趋势,在正常喂养的。相反,17个蛋白质延迟他们的演示与喂养组。此外,9个蛋白质(现货没有。29日,32岁的36,39岁,50岁,62年,63年,79年和89年)仍然存在在nonfeeding幼虫察觉在喂养幼虫的蜕变;代表数据,actin-depolymerizing因子1的表达模式是显示在图4(g)。


图4
部分扩大nonfeeding蚕中肠蛋白。红色箭头指出目标蛋白质和他们的名字分别是显示在右边。Vx意味着fifth-instar x天幼虫。

在数据4(一)和4(b), 10 kDa热休克蛋白和滞育激素前体只发现nonfeeding组。实时PCR进行披露的两个基因表达模式的改变编码10 kDa热休克蛋白和滞育激素前体。数据显示,这个小热休克蛋白基因表达在正常喂养和nonfeeding幼虫,但峰值信号能被探测到的九天后在饥饿3(补充数据)。如补充数据3 b所示,滞育激素前体基因对V5N和V13N表示只有在饥饿的幼虫。

除了这两个蛋白,谷胱甘肽S-transferase 10被确认在V5但没有找到从V4N V13N(图4(c))。ERp57 PDI-like蛋白质的表达和空泡的腺苷三磷酸酶B亚基在V6N调节和此后表达下调,回到喂蚕一样的水平(图4(d))。的H +运输ATP合酶2和成虫盘生长因子β亚基对碘氧基苯甲醚起初低nonfeeding幼虫但最终在喂养幼虫的水平增加(数据4(d)和4(e))。在图4(f),我们发现的异常翼盘状蛋白减少的叶绿体会与发展进展喂养幼虫,但是饥饿后,它保持稳定水平(图4(g))。

4所示。讨论

家养蚕,家蚕,是一种食草昆虫和鳞翅目的模式生物。中国和日本科学家努力完成整个蚕基因组的测序项目(17,18),提供以下物质研究人员使用蛋白质组学方法鉴定肽的机会。中肠,蚕体最大的消化器官,是重要的蛋白质组学研究[10,11]。除了表皮,蚕中肠是另一个大的内部之间的接口和额外的。是一个条目的病原体,毒素,和杀虫剂。因此,任何知识的蛋白质成分蚕中肠是必不可少的发展新的鳞翅类害虫防治策略。

在这项研究中,我们使用二维电泳结合MALDI-TOF-MS分析中肠蛋白在正常fifth-instar蚕幼虫以及饥饿的幼虫。蛋白质在两组的数量逐渐增加从第三天幼虫的最后一天,这表明越来越多的中肠蛋白可能参与这个组织的成长和蜕变。96蛋白质鉴定的蛋白质组学分析,69蛋白没有被观察到在此之前的研究(10,11,15,16),和大多数的中肠蛋白检测显示发展的差异。例如,JHDK负责JH的退化。李等人发现JHDK mRNA的表达在4——5 th-instar幼虫以恒定的水平和分布在前肠、中肠(19]。JHDK蛋白质达到高峰时的6天5 th-instar幼虫,看起来可能是负责JH的效价降低。fatty-acid-binding蛋白参与脂肪酸运输。根据微阵列数据,fatty-acid-binding蛋白质的基因表达在5 th-instar蚕幼虫与一个更高的水平在4 - 5天,然后下降到一个恒定的水平。这种蛋白质的丰度最高的6天2 de的概要文件,表明活性脂质代谢。异常翼盘状蛋白检测的叶绿体会在第8天显著下降。它的核苷二磷酸激酶活性和参与上皮完整性(20.]。我们的观察表明,它是由激素。我们的分析也让我们找到一个转铁蛋白。转铁蛋白是一种多功能蛋白在铁绑定工作,运输、细胞生长、分化、和保护细胞通过抑制细胞凋亡(21]。

不同的昆虫有不同的应对饥饿。在一些昆虫Manduca sexta随后的发展他们的幼虫会延迟当饥饿22),但屎壳郎幼虫对食物的反应不足通过缩短的长度龄,早熟,蛹,eclosing早期小成人(23]。家蚕属于前者的类型。当5 th-instar蚕幼虫饥饿从第三天,幼虫阶段的持续时间将会延长。结果发现,在蜕变之前所需的阈值重量Psacothea hilaris(24]。这可能是一个原因大多数挨饿蚕幼虫不能化蛹。

我们的数据显示,9个蛋白质检测不到喂养幼虫在蜕变之前仍在nonfeeding发现蚕。这些蛋白质,actin-depolymerizing因子1在调节中扮演的角色构成的组织,在细胞和器官扩张(25]。更详细的分析将揭示其在蚕中肠的功能。蛋白质组学分析还允许我们识别中存在的两种蛋白质只有饿死了蚕幼虫中肠。一个是一个小热休克蛋白,另一个是滞育激素前体。小热休克蛋白作为分子伴侣’重新折叠多肽困在蛋白质总量和降低错误折叠的蛋白质(26]。据报道,小热休克蛋白调节细胞程序性死亡等附加功能和促进或抑制细胞凋亡来维持体内平衡(27- - - - - -31日]。这个小热休克蛋白在正常中无法喂养幼虫,但可以在饥饿中发现的,这表明它可能扮演一些角色在挨饿幼虫的生存。滞育激素相对滞育激素的合成前体,是另一个蛋白质饥饿中标识的幼虫。昆虫可以在极端条件下进行滞育。滞育激素前体基因编码表达的感应饥饿,暗示,当面临饥饿,幼虫就会停止发展反饥饿的生存。

有趣的是,饥饿JHDK幼虫产生比正常喂养的。JHDK越多,JH效价降低。倒数第二年底龄幼虫,蜕变的特征是JH急剧减少。然而,大多数的饥饿幼虫没有经历蜕变,表明低水平的JH效价与高水平的蜕化类固醇效价在营养状态对初始larval-to-pupal蜕变至关重要。

幼虫中肠是一个主要的地方通常发生由于消化酶消化行动。在这项研究中,我们发现,在饥饿情况下,幼虫中肠消化酶都没有消失。这些消化的酶如糖苷酶、淀粉酶和海藻糖酶合成,分泌,首次提出并被困到glycocalyx,桑托斯et al。32]。

由于化学农药引起严重的环境问题,为害虫防治新策略需要开发。到目前为止,已经有两个主要的害虫控制方法通过昆虫中肠(33]。一个是使用毒素从哭泣b基因作为生物防治剂溶解中肠上皮。另一种方法是使用RNAi技术。选择中肠的RNAi目标包括mrna编码空泡的腺苷三磷酸酶,核糖体蛋白S4,肌动蛋白α微管蛋白(33]。我们目前的研究提供了更多的目标来源于中肠的害虫管理。

确认

这项工作是支持的研究经费来自中国国家科学基金会(没有。30871825),中国国家高新技术研究发展计划(没有。2006 aa10a118),博士生创新基金(没有。西南大学的kb2009002)。作者感谢三个评论者的有用的评论这篇文章的早期版本。

补充材料

我们使用两种技术在蚕中肠蛋白分开喂养和没有订阅条件。本文确定的蛋白质是由数字表示使用图像主2 d铂6.0软件。

  1. 补充数据1
  2. 补充数据2
  3. 补充数据3

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