分子和生物特征的中国Sacbrood病毒LN隔离

文摘

中国sacbrood病毒(CSBV)从患病的昆虫、纯化及其基因组克隆和测序。CSBV的基因组RNA是8863个核苷酸长度和包含一个大型开放阅读框编码319.614 kDa多元蛋白质。编码序列的陪同下是178 - 5′核苷酸nontranslated领袖序列和142核苷酸的3′nontranslated地区,是保利(a)的尾巴。四个主要的结构蛋白,VP1、VP2、VP3 VP4、预测的N-teminal多蛋白。c端多蛋白包含序列的一部分是一个典型的特征明显,小核糖核酸病毒非结构蛋白:一种RNA解旋酶,chymotrypsin-like 3 c蛋白酶,依赖RNA的RNA聚合酶。遗传分析表明,CSBV-LN 13-amino-acid删除在氨基酸位置710 - 719和727 - 729年相比,CSBV-GZ SBV-UK,和SBV-UK 7-amino-acid删除在2124 - 2132年相比,氨基酸位置CSBV-GZ CSBV-LN,和CSBV-GZ CSBV-LN在氨基酸位置6-amino-acid删除2143 - 2150与SBV-UK相比。系统发育分析使用RdRp选择picorna-like病毒表明CSBV / SBV和畸翅病毒(DWV)倾向于组在一起,拥有一个相似的大小和基因的RNA秩序。

1。介绍

病毒性疾病的科学兴趣的蜜蜂蜜蜂(l)大大增加在过去的几年里(1]。至少18个不同的病毒已经在蜜蜂发现了迄今为止。虽然通常不相关的临床症状,病毒在某些情况下可能导致严重甚至致命的疾病在单个蜜蜂或整个蜂群的崩溃。

Sacbrood病毒(越南)主要影响蜜蜂的窝和结果在幼虫死亡2]。受感染的幼虫化蛹,和皮肤蜕皮液聚集,形成了“囊”命名的疾病。感染的幼虫改变颜色从珍珠白色到淡黄色,和死后不久他们变干,形成一个深棕色gondola-shaped规模(3]。越南央行也可能影响成年蜜蜂,但在这种情况下疾病明显缺乏(4,5]。然而,这些蜜蜂可能有寿命减短5,6]。Sacbrood最常发生在春天,当种群增长最为迅速和大量的敏感幼虫和年轻人是可用的(5]。

SBV感染中国蜜蜂被任命为中国sacbrood病毒(CSBV)。CSBV广东第一次描述了中国在1972年和2008年出现在中国辽宁,造成致命的疾病在单个蜜蜂或整个蜂群的崩溃。

中国sacbrood病毒(CSBV)直径纳米26 - 30日,nonenveloped,圆的,毫无特色的外观和属于小RNA病毒科,引起。病毒的基因组+ ssRNA,有四种结构蛋白(30.5,31.5,37.8 kDa, 44.2 kDa)在其衣壳(7),但三种结构蛋白(25、28和31.5 kDa)已报告关于SBV8,9]。一个小VP4-like蛋白质(未发现10]。越南是第一个蜜蜂病毒已经完全测序及其基因组RNA长(8832核苷酸(nt))比典型的哺乳动物小核糖核酸病毒(约7500元),并包含一个大的开放阅读框编码2858个氨基酸的多蛋白(加入基因库。AF092924.1)。但CSBV基因组序列以外,8740个核苷酸的3′,5′末端,它包含一个大的开放阅读框编码2861个氨基酸的多蛋白(加入基因库。AF469603)。的基因组组织SBV / CSBV显然引起类似于典型的成员,与结构基因5′端和非结构基因3′端安排类似的订单。

但是我们最近特征CSBV来自中国辽宁。辽宁CSBV将称为CSBV-LN区别于原来的隔离,将称为CSBV-GZ(加入基因库没有。加入AF469603)和SBV-UK(基因库。AF092924.1)根据系统特点的分析和比较。

2。材料和方法

2.1。样品净化

CSBV (CSBV-LN)从自然获得爆发在中国辽宁。受感染的幼虫或蛹存储冻结在−直到需要70°C。纯化的病毒,CSBV-infected幼虫均质在5毫升NT缓冲区(100毫米氯化钠,10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4)和浸渍澄清在1000克10分钟。上层清液的提取与同等体积的1,1,2-trichlorotrifluoroethane在水相在不连续中海分层梯度(1.5克/厘米³和1.2克/厘米³在270000克)和离心机1 h SW50转子。中海的材料界面是收获和调整5毫升(最终的体积密度1.38克/厘米³中海的解决方案和离心机在一夜之间270000克。两个光散射乐队成立单独收集和稀释NT缓冲区,和收集的病毒是沉积在270000 g 1 h。球团矿在NT resuspended缓冲区。

2.2。电镜和sds - page

整个病毒样本净化过程是通过低速离心(10分钟)8000克、100人μL上层清液的颗粒状直接到碳涂层Formvar铜网格超速离心法在82000 g(15分钟),贝克曼超高速气动。网格是负面沾2%磷钨酸钠在pH值为6.8 90秒和飞利浦CM10透射电子显微镜观察。

CSBV相隔的四个主要结构蛋白sds - page(图1)。结构蛋白是决定12% sds - page凝胶通过使用标准协议(12]。蛋白质被涂抹到PVDF膜。

2.3。放大的长篇CSBV-LN基因组

引物(表用于这项工作1)的基础上设计的核苷酸序列CSBV-GZ(加入基因库。加入AF469603)和SBV-UK(基因库。AF092924.1)。它们被设计用于生产的长篇单链cDNA CSBV-LN基因组。S1-S9底漆对选择CSBV-GZ序列的基础上,选择和S10底漆对基于SBV-UK基因组。

完整的病毒基因组RNA被TRIzol-LS提取纯化病毒制剂(表达载体)和retrotranscribed cDNA用lamv逆转录酶和随机寡核苷酸和益生元(dT) [13作为底漆)。放大了互补dna PCR 30周期,与退火50到55°C 30秒和72°C伸长50 - 60秒,根据引物设置表1。的3′端CSBV-LN基因组克隆的3′运动中技术(Clontech)。PCR扩增基因组克隆到pMD-18-T向量(豆类生物科技(大连)有限公司)。

2.4。序列和系统发育分析

核苷酸序列决定的自动DNA测序器的ALI377豆类生物科技(大连)有限公司,有限公司和组装Lasergene (DNASTAR),和假定的蛋白酶裂解网站利用NetPicoRNA预测1.0服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPicoRNA/(14]。

3所示。结果

3.1。病毒鉴定和分子鉴定

电子显微镜显示存在大量的空,二十面体病毒粒子直径约26海里的病毒从被感染的幼虫和蛹的准备工作(图1(一))缺席在控制准备健康的蜜蜂。

纯化的病毒粒子有四个主要的蛋白质,视群众为30.5,31.5,37.8,和44.2 kDa(图1 (b))。结果类似于CSBV-GZ [7]。

3.2。核苷酸序列分析

完整的病毒基因组序列长8863个核苷酸,浓缩在一个(30.06%)和U(29.52%)相比,G(24.40%)和C (16.02%)。基因组包含一个大的开放阅读框(ORF)编码2848个氨基酸和核苷酸178开始。还有一个在418年8月在坐标系密码子,但178年8月以来翻译起始位点可能与418年8月它发生在一个上下文(AUUAUGG)一样,许多无脊椎动物的初始密码子(ANNAUGG)。但是第二在坐标系AUG密码子的位置CSBV-LN(418核苷酸)是不同于SBV-UK,其中第二在坐标系AUG密码子是197 (10]。ORF以UAG终止密码子结束的8721核苷酸编码319613.75道尔顿的产物。(UTR) CSBV 3′端非翻译区(79个核苷酸)的大小与哺乳动物相似,小核糖核酸病毒(40 - 126核苷酸)。的5′UTR是CSBV-LN通过rt - pcr引物的基础上加入SBV-UK(基因库。AF092924.1),所以CSBV 5′UTR类似SBV-UK(177核苷酸)。的CSBV-LN ORF序列和推导的氨基酸GSBV-GZ相同的93.7%和96%,分别与SBV-UK相同,分别和90.5%和95.3%(图2)。

3.3。氨基酸序列分析

域分析的多蛋白显示病毒蛋白质的顺序是相同的哺乳动物的小核糖核酸病毒(15),结构蛋白和非结构蛋白的氨基端部分多蛋白c端部分。的氨基酸序列推断CSBV多元蛋白的n端是与哺乳动物小核糖核酸病毒和昆虫picorna-like病毒结构基因。对齐(图3与SBV-UK)显示出类似的结果(9528 - 612),其残留CSBV表现出相似的结构蛋白VP3的哺乳动物小核糖核酸病毒口蹄疫病毒(FMDV,加入基因库。AY333431.1)、甲型肝炎病毒(HAV,加入基因库。加入AB279735)和脑心肌炎(EMCV基因库。M81861.1)。然而,前面这个区域被指定为VP1的软化病病毒(IFV,加入基因库没有感染。AB000906)。第二个地区身份被发现CSBV残留257年和419年之间,像VP2-like蛋白质FMDV的EMCV Kakugo病毒(KV,加入基因库没有。AB070959)和变形翼病毒(DWV,加入基因库没有。AJ489744), IFV VP3地区。但CSBV-GZ SBV-UK, CSBV-LN 13-amino酸在氨基酸位置删除710 - 719和727 - 729(图4)。蛋白质序列的氨基酸组成进行了分析使用ProtParam工具http://expasy.org/tools/protparam.html/(16]。

解旋酶域A、B和C (11)发现氨基酸之间的1357年和1477年(图5),包括完全守恒的假定的核苷triphosphate-binding残留^1368年GxxGxGKS^1378年和^1415年QX、₅DD^1422年在域A和B, C域出现但至少守恒的,只包含三个六残留可能与网站相关联。

3 c蛋白酶域跨度氨基酸半胱氨酸蛋白酶的主题2146年至2277年和保存^2254年GxCG^2257年和假定的底物结合残留物^2271年GxHxxG^2276年(GMHFAG)。C^2256年(17)是第三残留蛋白酶催化三分子,还包括组氨酸残基,一个天冬氨酸盐或谷氨酸残基18,19]。^2153年H和E^2193年最有可能的候选人之间的处理站点位置2133和半胱氨酸蛋白酶主题完成催化三分子与C^2256年。

氨基酸c端区域(2449 - 2818)RdRp CSBV多元蛋白类似于序列的病毒引起的(图6)。所有八个功能守恒的RdRp正链RNA病毒(11)也确定了在这一地区的CSBV基因组中,只有一个例外:第四主题包含一个甘氨酸(氨基酸2595)而共识表明,这是天冬氨酸残。

然而SBV-UK有7-amino酸在氨基酸位置删除2125 - 2131相比,CSBV-GZ CSBV-LN,和CSBV-GZ CSBV-LN 6-amino酸在氨基酸位置删除2144 - 2149与SBV-UK相比(图7)。

4所示。讨论

核苷酸序列(8863核苷酸)包含一个大型ORF编码2848个氨基酸。基因组组织引起CSBV明显类似于典型的5′末端的结构蛋白和非结构蛋白3′端安排类似的订单。DNASTAR软件被用来进行系统发育分析。RdRp氨基酸序列的系统发育分析表明,CSBV-LN CSBV-GZ, SBV-UK属于SBV DWV和KV集合(图8)。DWV的结构蛋白优先顺序已经确定,这是5′vp2 VP4 VP1 VP3-3′(20.]。所以类似的结构蛋白优先排序在CSBV预测,这是5′vp2 VP4 VP1 VP3-3′。假定的蛋白酶裂解网站预测基于结构蛋白的大小估计页面,并推导了结构蛋白的优先顺序使用NetPicoRNA 1.0服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPicoRNA/(14]。VP3蛋白酶站点(GAAQ问^1078年节目)符合经典模式病毒3 c蛋白酶切割后谷氨酸或谷氨酰胺(Q) (E) (17,21]。

使用这些残留的位置作为指南,我们发现几个公认的识别网站CSBV 3 c蛋白酶在多元蛋白质。所有网站都适当定位功能分离的病毒蛋白质的多蛋白,估计和预测之间的协议结构蛋白的分子量。最有趣的网站出现在氨基酸161 (KESI问^161年GD),392 (VPLT问^392年米D(六),428 (QSHN问^428年DKPK)和743 (LPRVQ^743年MDTG)。网站161年可能单独一个领导者从多元蛋白质多肽(蛋白质)。网站392年,N末端,VP1一起生成VP4,通常的前体蛋白VP1一起(VP0)。网站428年可能VP1与多元蛋白质分离。坐1655 (FVTTQ^1655年GDFA)可以从多元蛋白质分离解旋酶。网站2308 (QPVVQ^2308年LEDW)非常类似于VP3证实蛋白酶网站并将完全处理N末端的3 cd蛋白组成的3 c蛋白酶和依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp) [22]。

守恒的分析蛋白质域和蛋白水解处理网站识别蛋白(Lprotein) precedingVP2领导者,其次是一个假定的VP4、VP1、和VP3,解旋酶,VPg, 3 c蛋白酶、和RdRp辨认和守恒的蛋白酶网站在合适的地点进行处理。

的出现和再度出现病毒性传染病往往受到病毒的基因(21]。都观察到广泛的遗传变异,SBV隔离。CSBV-GZ与SBV-UK, CSBV-LN 13-amino酸在氨基酸位置删除710 - 719和727 - 729年,和与CSBV-GZ相比CSBV-LN, SBV-UK有7-amino酸在氨基酸位置删除2125 - 2131年,与SBV-UK相比,CSBV-GZ和CSBV-LN 6-amino-acid删除在氨基酸位置2144 - 2149。除此之外,第二个在坐标系AUG密码子的位置CSBV-LN SBV-UK不同,其中第二在坐标系AUG密码子是197 (10]。观察到的遗传异质性CSBV / SBV可能导致病毒毒力更强的选择和出现或新形式的CSBV / SBV再度出现。遗传变异可能显示CSBV / SBV基因型和包含几个系统集群。什么是遗传变异的原因CSBV / SBV吗?这可能是由于不同的地理起源,蜜蜂物种,或其他人,应进一步调查。

承认

这项工作是由中国国家自然科学基金支持的(没有。辽宁省(30972200)和教育部门。2009 a464)。

引用

1. m·艾伦和b球”的发病率和世界分布蜜蜂病毒,”蜜蜂的世界,卷77,不。3、141 - 162年,1996页。视图:谷歌学术搜索
2. w·里特Diagnostik和Bekampfung冯Bienenkrankheiten菲舍尔,古斯塔夫-耶拿,斯图加特,德国,1996年。
3. l·贝利,”最近的研究蜜蜂病毒。”蜜蜂的世界卷,56岁,55 - 64、1975页。视图:谷歌学术搜索
4. d·l·安德森和a·j·吉布斯“Transpuparial克什米尔蜜蜂病毒的传播和蜜蜂sacbrood病毒(Apismellifera)”应用生物学上的卷,114年,页1 - 7,1989。视图:谷歌学术搜索
5. l·贝利”sacbrood的乘法和传播病毒的蜜蜂,“应用生物学上的,卷63,不。3、483 - 491年,1969页。视图:谷歌学术搜索
6. 王d i f·e·穆勒,“劳动分工和王后出席nosema-infected工人蜜蜂的行为,”经济昆虫学杂志》卷,63年,第1541 - 1539页,1970年。视图:谷歌学术搜索
7. z秦奋,y翳风、l .余姚市l . Xinying和z . Jingqiang”结构的研究中国Sacbrood病毒'nucleic酸,”中国电子显微镜学会杂志》上,21卷,不。3、331 - 334年,2002页。视图:谷歌学术搜索
8. l·贝利”病毒攻击蜜蜂,“病毒研究进展,20卷,第304 - 271页,1976年。视图:谷歌学术搜索
9. l·贝利·j·m·卡彭特和r·d·伍兹,“从api cerana sacbrood株病毒,”无脊椎动物病理学杂志,39卷,不。2、264 - 265年,1982页。视图:谷歌学术搜索
10. r·c·戈什b . v .球,m . m . Willcocks和m . j .卡特“sacbrood病毒的核苷酸序列的蜜蜂:昆虫picorna-like病毒,”普通病毒学杂志,卷80,不。6,1541 - 1549年,1999页。视图:谷歌学术搜索
11. e . v . Koonin,诉诉Dolja正链RNA病毒的进化和分类:影响氨基酸序列的比较分析,“生物化学和分子生物学的关键评论,28卷,不。5,375 - 430年,1993页。视图:谷歌学术搜索
12. j . Sambrook e . f·弗里奇,t .则分子克隆:实验室手册冷泉港实验室,冷泉港,纽约,美国,第二版,1989年版。
13. j . Sambrook和d·w·罗素分子克隆:实验室手册冷泉港实验室,冷泉港,纽约,美国第3版,2001年版。
14. NetPicoRNA 1.0服务器,http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPicoRNA/。
15. 威默m . Gromeier大肠,a . e . Gorbalenya“遗传学、小核糖核酸病毒的发病机理和演变,”病毒的起源和演化e·多明戈,r·g·韦伯斯特和j·j·荷兰,Eds。学术出版社,页287 - 343年,伦敦,英国,1999年。视图:谷歌学术搜索
16. ProtParam工具,http://expasy.org/tools/protparam.html。
17. a . e . Gorbalenya a . p . Donchenko v . m . Blinov和e . v . Koonin“半胱氨酸蛋白酶的正链RNA病毒和chymotrypsin-like金丝雀蛋白酶:一种独特的蛋白质总科的常见结构褶皱,“2月的信,卷243,不。2、103 - 114年,1989页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. j·f·Bazan和r . j . Fletterick“病毒半胱氨酸蛋白酶是丝氨酸蛋白酶的同源trypsin-like家族:结构和功能影响,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷85,不。21日,第7876 - 7872页,1988年。视图:谷歌学术搜索
19. m·d·瑞恩和m·弗林特”病毒编码的小核糖核酸病毒蛋白酶超群,”普通病毒学杂志,卷78,不。4、699 - 723年,1997页。视图:谷歌学术搜索
20. g . Lanzi和j·r·德·米兰达”分子和生物特征的蜜蜂畸翅病毒。蜜蜂(L),“Jounal的病毒学,卷80,不。10日,4988 - 5009年,2006页。视图:谷歌学术搜索
21. e . a . Duarte i s中篇小说,s·韦弗et al .,“RNA病毒准物种:病毒性疾病和流行病学意义,”传染性病原体和疾病,3卷,不。4、201 - 214年,1994页。视图:谷歌学术搜索
22. t·m·辛顿:ross smith,美国华纳,g . j .波尔和b s Crabb”保护的L和3 c蛋白酶活动远亲口蹄疫病毒,”普通病毒学杂志,卷83,不。12日,第3121 - 3111页,2002年。视图:谷歌学术搜索

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