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国际基因组学杂志
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国际基因组学杂志/<一个class="sc-htpNat bUhGXt link sc-eitiEO jXeALb breadCrumb" href="//www.newsama.com/journals/ijg/contents/year/2011/" aria-label="2011">2011年/文章

研究文章|开放获取

体积 2011年 |文章的ID 256038年 | https://doi.org/10.1155/2011/256038

彩霞谢、Shanliang徐,灵灵,可中和Jubin兴,俊威,小玲锣,Liuxiong徐,保宝隆, ”信使rna / microRNA概要文件在橄榄比目鱼的变质阶段(Paralichthys olivaceus)”,国际基因组学杂志, 卷。2011年, 文章的ID256038年, 12 页面, 2011年。 https://doi.org/10.1155/2011/256038

信使rna / microRNA概要文件在橄榄比目鱼的变质阶段(Paralichthys olivaceus)

彩霞谢,1 Shanliang徐,2 灵灵阳,1 中和柯,1 Jubin兴,1 俊威丐帮,1 小玲龚,1 Liuxiong徐,3 和 宝隆宝1

1重点实验室的探索和利用水生遗传资源,上海海洋大学,教育部,201306年上海,中国

2海洋生物技术重点实验室、宁波大学、宁波315211年,中国

3海洋渔业资源的可持续开发重点实验室,上海海洋大学,教育部,201306年上海,中国

学术编辑器:保罗·丹尼
收到了 2010年10月13日
接受 2011年2月16日
发表 2011年4月19日

文摘

比目鱼是著名的不对称转换在蜕变。不对称发展背后的分子机制已经猜测一个多世纪,至今仍不清楚。到目前为止,没有一个在比目鱼metamorphosis-related基因已被确认。作为屏幕metamorphosis-related基因的第一步,我们构建了一个全身cDNA图书馆和全身microrna的图书馆在本研究中,发现了1051独特的est序列,23日独特的microrna,和4 snorna premetamorphosing prometamorphosingParalichthys olivaceus。1005的est序列的小说,这表明有一个特殊的基因表达谱在变质阶段。四个microrna (pol-miR-20c,pol-miR-23c,波尔- mir - 130 d,波尔- mir - 181 e)小说p . olivaceus;他们发表microrna保存的特点是高度同源性,而且至少有一个核苷酸不同。代表24 mrna和23个microrna是量化的蜕变p . olivaceus利用定量RT PCR或茎环结构qRT PCR。我们的研究结果显示,20的mrna可能与早期变质事件有关,十mrna可能与后变质事件,和16个microrna可能参与调节的蜕变。本研究提供的数据将有利于进一步识别metamorphosis-related基因p . olivaceus。

1。介绍

比目鱼是著名的不对称转换在蜕变,尤其是一只眼睛迁移到另一边。其他变形事件包括颅骨变形、不对称的色素,90度旋转的姿态生活方式从远洋过渡到底栖生物。形态学左/右不对称的分子机制橄榄挣扎,Paralichthys olivaceus,被认为是不同于内部器官的不对称在脊椎动物<一个href="#B1">1]。甲状腺激素(TH)提出了控制变形的比目鱼(<一个href="#B2">2- - - - - -<一个href="#B5">5]。的核受体,甲状腺激素受体(TR)应该参与TH-inducing信号通路。空间TR基因的表达被调查凝望橄榄比目鱼(<一个href="#B6">6];但是,它仍然不能确定哪些蜕变事件是由TR比目鱼。TH-TR信号通路的下游基因在未来不可避免地会调查。到目前为止,很少有基因研究在凝望比目鱼(<一个href="#B6">6- - - - - -<一个href="#B9">9]。尽管不同组织类型的互补脱氧核糖核酸数据库p . olivaceus了,特别是几种组织(<一个href="#B10">10),凝望的基因表达谱p . olivaceus还是不可用。

表达序列标签(est)”来形容转录组分析是一种有效的方法。大规模EST测序项目作为基因组计划的一部分进行了几个硬骨鱼类的物种,如salmonid和鲶鱼(<一个href="#B11">11- - - - - -<一个href="#B13">13]。小规模est分析也进行了一些水产养殖硬骨鱼类的<一个href="#B10">10,<一个href="#B14">14- - - - - -<一个href="#B16">16]。在这项研究中,我们试图丰富est数据并通过互补脱氧核糖核酸库随机调查了基因表达谱测序premetamorphosing和prometamorphosingp . olivaceus。此外,约翰斯顿和Hobert报道,一个microRNA称为lsy-6控制神经元左/右不对称化学感应受体的表达秀丽隐杆线虫(<一个href="#B17">17]。因此,小分子核糖核酸在调节的可能角色蜕变的比目鱼不应被忽视。这是我们构建了一个microRNA库和其在凝望的表达谱分析p . olivaceus在这个研究。

2。材料和方法

2.1。鱼的维护和抽样

幼虫得到从中央实验台中国水产科学院(北戴河、河北,中国),然后送到实验室在上海海洋大学,上海,中国。幼虫被饲养在实验室根据提供的方法(<一个href="#B8">8]。喂养幼虫生活盐水虾(卤虫),无节幼虫到最后的蜕变。我们使用以下分类的变质阶段P。olivaceus在这项研究中(<一个href="#B18">18,<一个href="#B19">19]:Premetamorphosis(17哒,天后孵化),眼睛迁移的阶段开始之前;Prometamorphosis (DAH) 19日,从眼睛开始迁移之前的几个长背鳍射线的吸收;(DAH) 23日达到高潮,从一开始的吸收长背鳍射线直到完成鳍吸收和眼睛的迁移;Postclimax (DAH) 27日,完成后鳍吸收和眼睛的迁移。所有样本使用液态氮冷冻和储存在−80°C到总RNA进行隔离。

2.2。互补脱氧核糖核酸库建设和测序

总RNA隔绝premetamorphosing或prometamorphosing幼虫(17哒,哒19日)使用试剂盒试剂(美国表达载体,加州卡尔斯巴德)根据制造商的指示。等量的总RNA从premetamorphosing或prometamorphosing幼虫汇集。信使RNA是纯化使用Oligotex从总RNA信使RNA工具包(美国加州试剂盒,瓦伦西亚)根据制造商的指示。定向cDNA整个幼虫是构建图书馆使用pBlueScript II SK +矢量(Stratagene,加州拉霍亚,美国)。合成第一链cDNA根据协议上标二世的核糖核酸酶H-reverse转录酶(表达载体)。益生元(dT) 18个引物Xho我消化网站是用于第一个互补脱氧核糖核酸链的合成。第二个链合成使用DNA聚合酶I(美国威斯康星州麦迪逊Promega)。互补0.5 - 2 kb大小插入pBluescript II SK +矢量然后electroporated到主管细胞。超过5000个初级cDNA克隆得到平均插入> 1 kb的大小。效价的主要cDNA图书馆1×106,然后放大一次殖民地都测序(Biotecan、上海、中国)。向量序列修剪的EST序列使用向量NTI套件8.0(表达载体)。修剪序列进一步筛选使用向量中的ContigExpress NTI套件8.0。高质量的est序列被组装成簇的连续序列重叠群。向量NTI套件8.0用于重叠群装配使用严格的参数,即重叠长度截止100年和90年百分比的身份重叠。每个重叠群和单件的共识序列组成独特的序列被送往国家生物技术信息中心(NCBI)通过使用在线软件Blast2go [<一个href="#B20">20.)比较反对使用BLASTX nonredundant蛋白质数据库。创造价值截止是1 e−5。小说est序列也发现相比p . olivaceus使用BLASTN EST序列在NCBI数据库。所有已知的EST序列不确定为直接同源基因被指定为未知的克隆。

序列与BLASTX支安打映射和注释根据基因本体术语(去)朋友数据库(<一个href="http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/go.cgi" target="_blank">http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/go。cgi)。基因的分布在每一个主要的本体类别是检查,和独特的序列的比例在每个分配计算。的三个主要类别的,也就是说,生物过程,分子功能,细胞组件(<一个href="#B21">21),100%被认为是独特的序列有一个分配的总数术语。因此,在每一个主要类别,2级的百分比不加起来是100%,因为一些推断蛋白质有多个类别分配给他们(<一个href="#B22">22]。

2.3。MicroRNA图书馆建设和测序

RNA与premetamorphosing规模低于200元或凝望幼虫被隔离使用mirVana microrna的隔离设备(美国Ambion、奥斯汀、特克斯)与小制造商的指示后修改。总之,等量的上述RNA从premetamorphosing或prometamorphosing幼虫汇集。2μ腺苷酸在3 g汇集RNA′羟基末端通过使用保利(A)聚合酶(美国新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,质量)孵化为15分钟37°C。然后,DNA / RNA 5′连接器(5′-ACGGAAuuccucacuaaa-3′)被结扎的5′末端T4 RNA连接酶孵育1 h在37°C。这种混合物被MMLV然后反向转录逆转录酶(美国威斯康星州麦迪逊Promega)使用底漆补充3′链接器序列(5′-CTAGCTTGGTGCCTGGAATTCGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) 42°C 1 h,并使用正向引物PCR扩增(5′-CCAACCGGCACCACGGAATTCCTCACTAAA)和反向引物(5′-CTAGCTTGGTGCCTGGAATTCGCGGTTTTT)连接器。的反应是完成以下thermoprofiles: 95°C 15分钟为一个周期,然后样本放大35周期在94°C 1分钟,30年代58°C, 72°C 30年代。PCR的完成后,反应是孵化72°C的额外的10分钟。PCR产品分析电泳nondenaturing 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(页面)。乐队从235个基点,至245基点切除和净化。纯化PCR片段被结扎成pGEM-T简单向量(Promega)和转换为主管DH5α细胞。改变细菌细胞被镀,一夜之间长大。殖民地选择和排序(Biotecan)。小RNA序列数据分析爆破对miRBase搜索数据库(<一个href="http://www.mirbase.org/" target="_blank">http://www.mirbase.org/)。小分子核糖核酸被确定和命名基于序列同源性发表microrna根据通用术语(<一个href="#B23">23]。

2.4。定量实时逆转录聚合酶链反应

总RNA从整个幼虫在不同变质阶段孤立使用试剂盒试剂(表达载体)其次是DNase治疗。丰富的mRNA microrna的被存在量化或茎环结构中存在(<一个href="#B24">24),分别。2μg DNase-treated RNA被转换为互补使用MMLV逆转录酶(Promega)。为每个mRNA列出在表中存在引物<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/tab1/" target="_blank">1和microrna的表<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/tab2/" target="_blank">2。相对mRNA的表达和microrna的规范化使用β肌动蛋白mRNA和U6核内小rna控制,分别。存在或茎环结构中存在,thermocycler设定在95°C 15和55°C 60年代共有40个周期,每周期后跟95°C为1分钟,1分钟55°C。信使rna的相对变化或microrna的丰度量化使用 方法;β肌动蛋白mRNA和U6 RNA被用作参考扩增子数据归一化<一个href="#B25">25,<一个href="#B26">26]。
克隆的名字 基因名字 引物名称 引物(5′3′)
SFU-PO-DEV 0004 5-cytosolic二世(nt5c2) CY2F CGACCTACCTGCCAACATG
CY2R GTGCCAGACAACTGGTCC
SFU-PO-DEV 0125 cog1782: metal-dependent由金属-β-内酰胺酶域和一个rna结合kh域(我) MEF CTGACCAAACTGATCCGGC
海洋博物馆 CTGATCCAACATCGAGGTCG
SFU-PO-DEV 0133 肌酸激酶1 mRNA (对照) 位置 GAGACTCGTGACTCTGCTCAC
CKR CAGCCTAGTGGAGGCTGATC
SFU-PO-DEV 0137 角质层蛋白(cp) CP2F GTGGCTACAACGCCGATG
心肺复苏 CAGGTGCTTTGTATGCAGGAG
SFU-PO-DEV 0159 细胞色素c弗吉尼亚州亚基(cox5a) 脑脊液 GCAGCACTGAGAGCTTGTC
企业社会责任 GCTGCAGCTCTTGGATCAG
SFU-PO-DEV 0170 脱氧胞苷激酶(dck) DK2F GACTCCAAGCCCGGAACC
DK2R AGCTGAAGGCACAGCTAGTG
SFU-PO-DEV 0182 弹性蛋白酶2 (ela2a) EL2F GACCTGGCCAGTTGCAATG
EL2R GTAGTTGCAGCCCATGCTTG
SFU-PO-DEV 0200 真核翻译起始因子5 a (eif5a2) 交易所交易基金 CCATCGGCATCAAAGCCTTG
ETR GAGTAGCATTGACGAGGCAATG
SFU-PO-DEV 0213 肠脂肪酸结合蛋白(fabpi) FAPF CTATCAGGCTCGTGGACCATG
FAPR CTTTGCGTCCACACCTTCG
SFU-PO-DEV 0260 热休克蛋白70 (hsp71) HSPF GCTACCTCCTGAGAAAGTGCTC
HSPR GTGACTCACTGCTCACTGAGTC
SFU-PO-DEV 0283 鲐鱼类假设LOC562892 (沪元) HYF GCTGAGCTGCACTGATCAAG
HYR TGCTGCATGTGCACACTTG
SFU-PO-DEV 0295 Kiaa1872蛋白(atcay) KP2F CGTCTTCCAGGCGACAG
KP2R GTACGGCCTGATGACCTG
SFU-PO-DEV 0297 l-3-hydroxyacyl-coenzyme条短链(hadh) HCF CAGAGTGAGCTGCTGAACAAG
HCR TGAAGTTCGGACTTGTCCCTC
SFU-PO-DEV 0298 幼虫和non-ifm同种型(万立升) 生活 GCATGGATCCTGAAGATGACG
LI2R CAGGGTAAGGTCCAGCAATG
SFU-PO-DEV 0305 Lin-52同族体(lin52) LHF GTTCTTCAAGTGGCGGGAC
LHR GCTGCAGTTCACTGTCTGAG
SFU-PO-DEV 0341 中间单元(铁蛋白m) (hfe) FMF GATTGAGCCTGAAGGGACGAG
核磁共振 CGACACCAACACAACAGCTC
SFU-PO-DEV 0766 Nadh脱氢酶亚基4 l (mt-nd4l) NDF CTCAGCCAACTTCTCAGCTTC
NDR GCTTTGAAGTCGGTCGGTAC
SFU-PO-DEV 0788 Nonmetastatic细胞蛋白质表达同种型(nme1) NMC-2F GACTCCAAGCCCGGAACA
NMC-2R CAGTGGTCTCCGACCAGG
SFU-PO-DEV 0803 鸟氨酸脱羧酶antizyme小同种型(oaz) ODAF CGGGATCGCAATCTTTCAGC
ODAR GAGCAAGAAGCGCACTCTG
SFU-PO-DEV 0834 假定的细胞色素P450像蛋白质前体(cyp1a1) PCPF GTCAAGCTCAACAGGCTCTTC
PCPR TGACGCGCATGAATGGATG
SFU-PO-DEV 0914 核糖体蛋白s27 (rps27) RPF CGGTTGATATCAGCGCCTTG
弹性分组环 CGATCTGTCAACGCGAACAG
SFU-PO-DEV 0945 s-adenosylhomocysteine水解酶(ahcyl) SAHF GTACCTGGGTCTGCCCAG
SAHR CCAAACGCCAAACCCTTCTAG
SFU-PO-DEV 1002 内线粒体膜8同族体移位酶(timm8a) TIMMF TCCGAGGGCATGATGGAC
TIMMR GGACAGTTCTGCAACACTCAG
SFU-PO-DEV 1017 肌钙蛋白c 2型(tnnc2) TNNCF CTACTGACCCCACTGTACCAC
TNNCR CCGTCTGTTGAGGATGTCAATG
表1
引物中存在的mrna。
微 引物名称 引物(5′3′)
通用修改底漆 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT
U6核内小rna U6RT 5′-GTCAGGCAGCGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGCTGCCTGACAAAAAT
U6F 5′-CGCAAGGATGACACGCAAATT
miR-1 1 rt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACATAC
1 f 5′-CGGCGGTGGAATGTAAAG
let-7a 7艺术 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT
7房颤 5′-CGGCGGTGAGGTAGTAGGTT
let-7e & miR-7f 7 efrt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTAT
7 eff 5′-CGGCGGTGAGGTAGTAGATT
let-7j 7 jrt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTGT
7摩根富林明 5′-CGGCGGTGAGGTAGTTGTTT
miR-9 * 9艺术 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTTTC
9房颤 5′-CGGCGGTAAAGCTAGATAA
miR-10b 10 brt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAT
10个男朋友 5′-CGGCGGTACCCTGTAGAACC
miR-20c 20艺术 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATACCT
20房颤 5′-CGGCGGTAAAGTGCTTATAGT
miR-21 21 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCAACA
21 f 5′-CGGCGGTAGCTTATCAGACT
miR-23a 23日艺术 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGGAAA
23房颤 5′-CGGCGGATCACATTGCCAGG
miR-23c 23 brt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATGGTA
23岁的男朋友 5′-CGGCGGATCACATTGCCAGGG
miR-26a 26日艺术 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCCTA
26房颤 5′-CGGCGGTTCAAGTAATCCAG
mir - 125 b 125年brt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCACAAG
125年的男朋友 5′-CGGCGGTCCCTGAGACCCT
mir - 128 128 rt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAGAG
华氏128度 5′-CGGCGGTCACAGTGAACCG
mir - 130 d 130年crt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCTTT
130年cf 5′-CGGCGGCAGTGCAATAT
mir - 145 145 rt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGATT
华氏145度 5′-CGGCGGGTCCAGTTTTCCCA
mir - 181 a 181艺术 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTCAC
181年房颤 5′-CGGCGGAACATTCAACGCTGT
mir - 181 e 181年a-1rt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA
181年a-1f 5′-CGGCGGAACATTCAACGCTGTC
mir - 181 f 181年frt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCC
181 ff 5′-CGGCGGAACATTCATTGCTGT
mir - 200 a 200艺术 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACATCG
200年房颤 5′-CGGCGGTAACACTGTCTGGT
mir - 221 221 rt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAAACC
华氏221度 5′-CGGCGGAGCTACATTGTCTGC
mir - 429 429 rt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGGCA
华氏429度 5′-CGGCGGTAATACTGTCTGGT
mir - 724 724 rt 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACAGT
华氏724度 5′-CGGCGGTTAAAGGGAATTTG
表2
引物的microrna茎环结构中存在。

3所示。结果和讨论

3.1。信使rna在Premetamorphosing Prometamorphosingp . olivaceus

2235年克隆选择随机从premetamorphosis和prometamorphosis cDNA文库测序。除了42空克隆2193 cDNA克隆被用来产生表达序列标签(est)和代表1051个独特的基因。1051个不同的基因(加入基因库GW882510-GW883514号、GT229367-GT229408 EU090804.1),只有46个独特的基因(4.4%)被确定为同源之前报道p . olivaceus基因,而1005例(95.6%)小说独特的基因被发现p . olivaceusest序列。因此,这是代表一个重要除了现有的集合p . olivaceus美国东部时间资源。新1005独特的基因,395(39.3%)仍未知的基因身份和其他人有大量BLASTX支安打鱼类,包括以外的比目鱼p . olivaceus(6.5%)和鱼类除了比目鱼(35.0%)(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig1/" target="_blank">1)。


图1
总结是分布在不同的组和基因的数量表示。固体酒吧数量的est序列,勾勒出酒吧是克隆的数量。

基因本体论(去)类别被分配到656独特的est序列使用朋友的数据库。基因本体术语的分布比例(2 nd-level条款)根据财团如图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig2/" target="_blank">2。细胞过程(87%)是最主要的2 nd-level项的455独特的序列注释生物过程的类别。其次是代谢过程代谢为71%。指出,9%被分配到的负调控生物过程。蛋白结合(60%)是最主要的467个est序列与重要蛋白质击中被分配到分子功能类别2级。其次是核酸绑定在20%。细胞(97%)是最主要的一部分474 est序列注释到蜂窝组件的类别。细胞内和细胞内部分占90%和89%,分别。est序列,在每个三个主要类别给出图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig2/" target="_blank">2。




图2
基因本体论(去)作业(2 nd-level去计算)1825带注释的est序列。est序列注释的总数量为每一个生物过程,主要类别有455 474 467分子功能,细胞成分。因为一个基因产物可以指派给一个以上的词,每个主要类别的百分比不加起来是100%。

与规范化cDNA图书馆相比,nonnormalized cDNA图书馆更多的冗余。2193年cDNA克隆从nonnormalized cDNA文库在这项研究中只生成1051个独特的基因。然而,nonnormalized cDNA图书馆可以提供原始信息的结构基因表达水平(<一个href="#B27">27]。在656年确定不同的已知基因在变质p . olivaceus在这项研究中,413个已知基因测序只有一次(63.0%),180个基因(27.4%)被测序2 - 5次,和63个基因(9.6%)被测序超过5次。绝大多数已知的基因测序只有一次;然而,少量的基因占较大比重的成绩单premetamorphosing prometamorphosingp . olivaceus(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig3/" target="_blank">3)。最大量表达基因是小清蛋白占3.88%的2193个克隆测序(表<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/tab3/" target="_blank">3)。表达基因beta-actin仅占0.05%。其他最丰富的表达基因包括细胞色素c氧化酶亚基二世(1.28%)、核糖体蛋白S2(1.23%),细胞色素c氧化酶亚基III(1.00%)、肌酸激酶1(1.00%)、肌球蛋白轻链3(1.00%)、40年代核糖体蛋白S8(1.00%)、核酸酶二磷酸激酶B(0.87%)、核糖体蛋白L18a(0.87%),和抗冻蛋白IV型(0.87%)。总共十个最丰富表达基因占据19.39%的克隆。
假定的识别 频率(%)
小清蛋白 3.88%
细胞色素c氧化酶亚基二世 1.28%
核糖体蛋白S2 1.23%
细胞色素c氧化酶亚基三世 1.00%
肌酸激酶1 1.00%
肌球蛋白轻链3 1.00%
40年代S8核糖体蛋白质 1.00%
核酸酶二磷酸激酶B 0.87%
核糖体蛋白L18a 0.87%
抗冻蛋白IV型 0.87%
表3
十大高表达基因在premetamorphosing和prometamorphosingp . olivaceus。

图3
p . olivaceus 已知基因的表达谱和测序冗余premetamorphosing prometamorphosing。
3.2。在Premetamorphosing和Prometamorphosing microrna的概要文件p . olivaceus

小分子核糖核酸是小19-23-nucleotide非编码rna结合识别序列3′未翻译区(3′-UTRs)的mrna和目标降解或转化镇压。microrna发现斑马鱼发育中起着重要作用[<一个href="#B28">28,<一个href="#B29">29日]。microrna资源开发只在斑马鱼等几个硬骨鱼,河豚鱼雄鱼mykiss(<一个href="#B30">30.- - - - - -<一个href="#B32">32]。没有确定的microrna在比目鱼。在这项研究中,共计143克隆选择随机测序(表<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/tab4/" target="_blank">4)。序列分析发现29个microrna显示一样的至少一个microrna发表于《数据库(<一个href="http://www.mirbase.org/search.shtml" target="_blank">http://www.mirbase.org/search.shtml)。代表19独特的microrna如表所示<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/tab5/" target="_blank">5。四个序列没有发现有相同的序列,但他们与microrna发表在miRBase显示显著的相似之处。此外,还有四个序列确定为snoRNA通过搜索NCBI数据库。总体而言,23.08%的在图书馆小rna可能是小分子核糖核酸和2.80% snorna(表<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/tab4/" target="_blank">4)。的名字p . olivaceusmicrorna是基于克隆序列之间的同源性和microrna的序列(表发表<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/tab5/" target="_blank">5)。19独特的microrna是守恒的跨多个物种和隶属于15个亚科,其中9独特的microrna的(pol-let-7a,pol-miR-7f,pol-miR-26a,波尔- mir - 125 b,波尔- mir - 128,波尔- mir - 181 a,波尔- mir - 200 a,波尔- mir - 221,波尔- mir - 429)是守恒的高在10个或更多的物种。的波尔- mir - 125 b在43个物种是守恒的。虽然mirRNAs,pol-let-7j,pol-miR-21a,波尔- mir - 181 f,波尔- mir - 724在只有一个物种(表,是守恒的<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/tab5/" target="_blank">5)。四个microrna (pol-miR-20c,pol-miR-23c,波尔- mir - 130 d,波尔- mir - 181 e)是小说p . olivaceus具有高同源性特征由至少一个核苷酸microrna但不同出版。这四个microrna只观察到p . olivaceus的特殊利益团体,因为他们独特的序列,可能是独特的定位机制(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig4/" target="_blank">4)。Pol-miR-20c有U G miR-20的不匹配摘要,河鲀,和把或miR-20a的鲐鱼类,非洲爪蟾蜍tropicalis,背带吊裤带,科仕caballus,犬属的后裔,和智人(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig4/" target="_blank">4(一))。Pol-miR-23c有一个U C不匹配职位23miR-23b的牛,彭哥pygmaeus,一,黑猩猩。然而,23之间没有地位p . olivaceus和其他鱼类。miR-23b的大肠caballus和智人,23岁和22岁都没有(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig4/" target="_blank">4 (b))。波尔- mir - 130 d有10 G不匹配位置相比大肠caballus和智人,而没有在位置与nonmammals相比不匹配。相比之下,mir - 130其他物种,20日,21日和22日p . olivaceus缺席(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig4/" target="_blank">4 (c))。与其他物种相比,波尔- mir - 181 e有一个19 G U不匹配的位置。有趣的是,有一个基本没有在其他鱼类和位置23非洲爪蟾蜍光滑的的位置,而你是守恒的p . olivaceus和更高的脊椎动物(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig4/" target="_blank">4 (d))。
RNA的物种 出席人数 %的克隆
microrna见表<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/tab5/">5一个 29日 20.28%
小说microrna如图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig4/">4b 4 2.80%
核糖体rna 21 14.68%
snoRNA 4 2.80%
身份不明的c 45 31.47%
低质量或短序列d 40 27.97%
总 143年 100%
一个只有microrna的候选人匹配100% microrna在miRBase数据库之一。
bmicrorna的候选人没有100%匹配任何microrna在miRBase数据库中,但由于显著的相似性
c序列不匹配任何已知的microrna或其他小分子rna或mrna。
d低质量少于17核苷酸序列和序列没有进一步分析。
表4
克隆小rna的分类p . olivaceus。
microrna的家庭 microrna的名字 不。的克隆 序列(5′3′) 长度(bp) 保存在其他动物
pol-miR-1 pol-miR-1a 1 UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUA 21 ssc, cfa mmu-miR-1-2-as, mdo xtr, ppa, gga, cbr,玻璃纸
pol-let-7 pol-let-7a 3 UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 22 eca, bfl-let-7-1-as sko, lgi bfl, ptr, cfa, mml, mdo, bta, xtr, tni fru, dre, gga,优化,mmu, cbr, hsa,玻璃纸
pol-let-7e 2 UGAGGUAGUAGAUUGAAUAGUU 22 赶紧走吧,tni fru dre, gga
pol-miR-7f 1 UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 22 eca, ptr, cfa, mml,赶紧走吧,mdo, xtr, bta, ssc, dre, gga,优化,mmu,
pol-let-7j 1 UGAGGUAGUUGUUUGUACAGUU 22 衣服
pol-miR-9 * pol-miR-9 * 3 UAAAGCUAGAUAACCGAAAGU 21 mdo xtr, dre
pol-miR-10 pol-miR-10b 1 UACCCUGUAGAACCGAAUUUGU 22 赶紧走吧,xtr、ppa、外资、ggo gga,战略性
pol-miR-21 pol-miR-21a 1 UAGCUUAUCAGACUGGUGUUGG 22 战略性
pol-miR-23 pol-miR-23a 3 AUCACAUUGCCAGGGAUUUCCA 22 赶紧走吧,bta tni fru dre
pol-miR-26 pol-miR-26a 1 UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 22 eca, cfa, bta,赶紧走吧,tni fru, ppa, mml,外资,lla, ppy, ggo, ptr, ssc,衣服,汽车,mmu, hsa,战略性
波尔- mir - 125 波尔- mir - 125 b 1 UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 22 eca、bfl, spu, sko帽,bfl, dya,醉酒驾车,dvi, dsi,内镜下动态慢动作影像,dpe, dmo, dgr,火线,丹,柠檬酸,cfa,赶紧走吧,mdo,额外的,
bta, tni fru lca,外资,lla, sla, mml, ptr, ppy, ppa,年龄,ggo, ssc, dre, aga, dps, gga,优化,hsa,测距装置,
mmu
波尔- mir - 128 波尔- mir - 128 2 UCACAGUGAACCGGUCUCUUU 21 eca, cfa, mml,赶紧走吧,mdo, bta, ptr, gga,优化,hsa, ppa, mmu,战略性
波尔- mir - 145 波尔- mir - 145 1 GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCC 22 衣服,战略性
波尔- mir - 181 波尔- mir - 181 a 1 AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU 23 eca,赶紧走吧,mdo xtr, tni fru, lla, ppy,外资,sla, mml, ptr, ppa, ggo, dre, gga,优化,hsa, mmu,
战略性
波尔- mir - 181 f 1 AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUU 24 bta
波尔- mir - 200 波尔- mir - 200 a 1 UAACACUGUCUGGUAACGAUGU 22 eca, ptr mml, mdo xtr, tni fru, dre, gga,优化,hsa, mmu
波尔- mir - 221 波尔- mir - 221 1 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC 23 eca, ptr, mdo xtr, tni fru, ppa, ppy, ggo, mml, dre, gga,优化,mmu,奇闻奇事
波尔- mir - 429 波尔- mir - 429 3 UAAUACUGUCUGGUAAUGCCGU 22 bta,赶紧走吧,xtr gga, tni fru, dre, cfa,优化,mmu
波尔- mir - 724 波尔- mir - 724 1 UUAAAGGGAAUUUGCGACUGUU 22 衣服
表5
序列和守恒的microrna的特征p . olivaceus。
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(一)
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(b)
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(c)
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(d)
图4
p . olivaceus 小说的对齐microrna与高度保护其他物种的同源microrna。
3.3。在正代表基因的表达模式p . Olivaceus

在miRNAs-targeted序列在网上预测的RNA22 microrna的目标探测软件(<一个href="#B33">33),24基因表达被确认在premetamorphosing或正深陷泥潭中存在。只有基因atcay稳定表达在不同变质阶段,表明它不应该与变质事件(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5(一个))。四个基因异常atcay,oaz,ahcyl,ela2a从premetamorphosis表达稳定(DAH) 17日阶段E (DAH) 19日(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5(一个)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5 (d)),一个基因cyp1a1表达下降(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5 (e))和其他基因测试在这项研究中表达水平明显增加(数据<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5 (f)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5 (x)),表明这些基因可能参与早期变质事件。蜕变后(自19 DAH)发起的,oaz表达水平降低(图<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5 (b)),基因的表达水平ahcyl,ela2a,cyp1a1,elf5a2,nt5c2,cp,timm8a,tnnc2或对照波动在凝望阶段(数字<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5 (c)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5 (k)),这表明这些基因可能与后变质事件有关,而基因的表达水平cox5a,沪元,我,dck,mt-nd4l,hfe,hsp71,hadh,rps27,fabpi,lin52,nme1,或万立升在凝望阶段下降到premetamorphosis阶段(级别人物<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5(左)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig5/" target="_blank">5 (x)),这表明这些基因可能是重要为以后变质事件。

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图5
p . olivaceus β = 3 < 。 0 5 丰富多样的mrna在变质阶段。丰富的mrna被存在量化。肌动蛋白mRNA担任控制数据规范化。值意味着±SD,。意味着没有常见的字母不同,。

正理解microrna的角色p . olivaceus,我们量化23 microrna茎环结构中存在使用。自的顺序pol-miR-7e非常类似于pol-miR-7f,相同的一对引物被用来放大(表<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/tab2/" target="_blank">2)。所有23个microrna表达premetamorphosing或凝望比目鱼。小分子核糖核酸pol-miR-1,pol-miR-7a,pol-miR-7j,pol-miR-7e / 7 f,pol-miR-9 *,pol-miR-21a,pol-miR-20c,pol-miR-23c,波尔- mir - 125 b,波尔- mir - 128,波尔- mir - 181 a,波尔- mir - 181 e,或波尔- mir - 181 f是e前一组高度变形(DAH) 17日开始,而他们的表达下降后蜕变(从19哒哒27日),表明这些小分子核糖核酸可能不是与早期变质事件(相关数据<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig6/" target="_blank">6(一)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig6/" target="_blank">6 (m))。microrna的表达水平pol-miR-10b,pol-miR-23a,pol-miR-26a,波尔- mir - 130 d,波尔- mir - 145,波尔- mir - 200 a,波尔- mir - 429,波尔- mir - 221,或波尔- mir - 724波动在凝望阶段,这表明它们可能是与蜕变(相关数据<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig6/" target="_blank">6 (n)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig6/" target="_blank">6 (v))。小分子核糖核酸pol-miR-10b,pol-miR-23a,pol-miR-26a,波尔- mir - 130 d,波尔- mir - 145,波尔- mir - 200 a,波尔- mir - 429在23日表示最高层大刀,然后迅速下降(数据吗<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig6/" target="_blank">6 (n)- - - - - -<一个href="//www.newsama.com/journals/ijg/2011/256038/fig6/" target="_blank">6 (t)),这表明他们可能在这个阶段调节中扮演角色的蜕变。这些结果与以前的研究结果一致表明microrna在分化和发育的重要性<一个href="#B28">28,<一个href="#B30">30.]。

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图6
p . olivaceus = 3 < 。 0 5 丰富多样的microrna在变质阶段。丰富的microrna被茎环中存在量化。U6核内小rna作为控制数据规范化。值意味着±SD,。意味着没有常见的字母不同,。

4所示。结论

总之,我们生成的一组1051个独特的est序列,23个microrna独特,独特和4 snorna premetamorphosing prometamorphosingp . olivaceus。尽管到目前为止有3143个核苷酸,13869 est在NCBI数据库,1005年的小说《est序列被确定成功在这项研究中,表明特殊基因表达谱中存在变质阶段。代表24 mrna 1051独特的est序列被量化的蜕变p . olivaceus使用定量RT PCR,结果表明,20个基因可能与早期变质事件和10基因可能与后变质事件。此外,23个microrna的丰度量化使用茎环qRT PCR。9 microrna可能与蜕变,和7 microrna在变质高潮可能扮演的角色。本研究中提供的数据将有助于进一步metamorphosis-related基因的识别p . olivaceus。

确认

这项工作是支持的重点学科资助Y1101,海洋生物学资金J50701,和水生生物学资金S30701由上海市教育委员会重点学科建设项目和部分由中国国家自然科学基金支持的30771668,中国06 zz65和国家教育委员会。c·谢许和美国同样的贡献。

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