在人类高档星形细胞瘤基因表达分析

文摘

弥漫性星形细胞瘤(二级)倾向于进步自发间变性星形细胞瘤(三级)和/或胶质母细胞瘤(四年级)。然而,星形细胞瘤的分子基础发展仍知之甚少。在当前的研究中,一个重要的最初的一步,这一目标是建立分类的肿瘤基因表达谱的基础上。我们使用基因表达分析和调控的(等级集群(HCL)和主成分分析(PCA)和监督(微阵列(PAM)预测分析)学习方法,证明星形细胞瘤的存在三个不同的基因表达特征(ACMs系统),它对应于扩散或低度恶性星形细胞瘤(二级)、间变性星形细胞瘤(三级)和多形性成胶质细胞瘤(四年级)。我们也证明171年的一项基于基因的分类器,描述这些病理/星形细胞瘤的分子子集之间的区别。这些结果进一步定义星形细胞瘤的分子亚型和可能被用来定义潜在的治疗目标和进一步细化分层方法。此外,这项研究表明基因表达分析结合详细的注释通路和基因本体论(去)类别资源应用于高纯度人口正常和肿瘤;它可以产生一个对星形细胞瘤的关键生物机制的理解。

1。介绍

星形细胞瘤(ACMs系统)的大脑癌症起源于星形以及星形胶质细胞;ACMs系统占大约75%的神经上皮的肿瘤。无数的评分系统,设计,ACMs系统最常用的系统是世界卫生组织(世卫组织)分级系统(1]。世卫组织系统分配一个从我到四年级,我是最积极和IV是最积极的2]。ACM收集标本的数量与其他肿瘤集合,相比相对较低,很少有报道使用微阵列技术的深入报道。这项研究的ACM基因转录谱为基本病变的背后机制的进一步发现ACM,这将有助于确定诊断和治疗干预的目标。原始数据被存入基因表达综合(地理;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/),这样其他研究人员访问。我们的分析提供了新的见解正常和恶性肿瘤组织之间的差异,可用于评估对ACM细胞治疗的影响。因为我年级ACM通常发生在儿童,本研究主要集中在一般成人ACM。独立系列15 ACMs系统包括五个样品每个等级II, III和IV。在当前的研究中,一个重要的最初的一步,这一目标是建立分类的肿瘤基因表达谱的基础上。我们旨在识别区分三组星形胶质瘤的表达谱:等级II, III和IV。在小说基因选择方法中,我们结合无监督统计分析与层次聚类(HCL) [3),一个监督方法称为PAM (4],适用于最近的萎缩质心分析来识别相关组织的基因区分各种肿瘤的亚型。在这里,我们表明,ACMs系统可以根据他们的基因表达谱分离。通过使用最丰富的表达数据分离基因簇,我们成功构建一个几乎完美的肿瘤集群模型。类预测是由使用excel的微阵列分析预测方案,适用于最近的萎缩质心分析(4)来确定37个预测基因,实现最优样本预测精度分类。与此同时,我们也应用了基因集系统性途径分析和识别分子通路和网络提供ACM和正常组织之间的关系。基于这种方法,功能富集分析基于BioCarta和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)途径5,6)可以用来说明基因(基因产物)之间的因果关系。虽然基因本体论(去)7)被组织成层次的上下文中注释正常的细胞功能,BioCarta和KEGG数据库组织基因(基因产物)途径反应地图和功能复合体,包括一些针对疾病的途径。我们的研究提供了有价值的信息,制药筛查项目和未来的癌症研究。

2。材料和方法

病人的平均年龄为48.6岁(范围、18 - 64)。15人病理ACM和相应的正常脑组织标本样本来自精神外科切除组织的上海长征医院(上海,中国)在2004年和2006年之间。正常的大脑控制样本获得皮层在常规切除的深度intercerebral转移。所有协议和同意书是医院的机构审查委员会批准的,并从所有患者知情同意了。标本的病理诊断证实了两名高级clinic-pathological专家,“张和宜昌Yu的病理学、华山医院,傅丹大学(上海,中国)RNA提取之前执行。标本在液氮快速冻结并存储在−80°C。肿瘤样本的组织学特征和临床疾病阶段,五个二级,III, IV ACMs系统和一个汇集和三个额外的法线,如表所示1。

RNA是使用试剂盒提取试剂,进一步纯化使用试剂盒RNeasy迷你工具根据制造商的指示。RNA质量评估量化了甲醛琼脂糖凝胶电泳和分光光度法。样本杂化的人类基因组Affymetrix U133 Plus2.0 GeneChip阵列根据Affymetrix协议。数组与GeneChip扫描仪扫描3000。扫描阵列图像处理与GeneChip操作软件(GCOS v1.3),玻璃纸提取文件进行进一步分析。原始数据被存入基因表达综合(地理,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/),加入序列号GSE19728,由17个不同等级的肿瘤样本+ 4正常脑组织样品,和GSE21354包括三个额外的正常脑组织标本地理样本名称见表1。

玻璃纸文件从所有的数据集(从15 ACMs系统新生成的数组数据,其中5人II, 5第三,第四第五和无与伦比的池正常3附加正常样本)被导入到R统计软件(v2.10.1。) [8)使用Bioconductor (v2.5.11) [9]。预先安装两个关键包后,hgu133plus2cdf(v.2.5.0)和hgu133plus2probe(v.2.5.0),在R环境中,Affymetrix数组的质量控制(Affymetrix Hu133plus2.0)首次使用计划执行affy(v 1.24.2)和simpleaffy(v 2.22.0)原始玻璃纸文件。RNA降解是评估使用函数AffyRNAdeg()的affy包中。我们检查的结果质量控制实施;数组的所有品质非常满意(见补充图1在网上补充材料doi: 10.1155 / 2011/245137),然后使用包原始数据的规范化gcRMA(10]。我们使用的“亲和力”模型gcRMA使用不匹配探测器-控制探针来估计非特异性结合的探针序列。的归一化值表达式log2规模,而变弱异常值的影响。有/没有调用提供的统计测量的记录在生物样品进行测试。计算的细节中可以找到Affymetrix微阵列套件用户指南(11]。的绝对检测记录(是否存在调用),我们使用的方法(12]替换所有MM探测值的阈值基于均值gcRMA后值(转换)的探针集,很有可能缺席目标记录。这消除了影响探针序列的亲和力和结果在更好的性能比MAS 5算法(13]。在目前的研究中,命令mas5callsBioconductor()是用于生成MAS 5.0调用。产生的输出只存在/没有调用被提取,然后映射到表达式值的输出gcRMA [14]。然后,我们拯救了归一化值和相应的表达式值在一个矩阵。这个矩阵被视为数据源在TIGR兆电子伏版本4-6-01软件工具(http://www.tm4.org/)[15]。兆电子伏的过滤操作平台(a)我们首先移除一组探测器,用于质量控制;(b)一个矩阵是由每个探针ID、表达价值,及其相应的示例调用(调用:、现在;缺席,、中);下面的公式是用来过滤冗余的探针, 在哪里, , 站的数量, , ,分别;如果该值≤10%,相应的探针ID将被排除在外。简单地说,调查被删除。

方差分析(方差分析)16)是一种评估的技术是否一组从两个或两个以上的实验测量团体表示,鉴于观测方差,群体是不同的。微阵列的测量是一个记录的表达水平,和组对应于实验样本组。方差分析的最基本类型是一个单向方差分析。在单向方差分析,样本组分层以及单个实验变量。目前,只有单向方差分析中实现TIGR兆电子伏(4-6-01 V)软件工具。最初需要输入用户群体的数量在我们的研究中,这些数字设置为4 (ACMs系统II, III, IV和法线)。然后我们适用单向方差分析模型,它们分别意味着对于每个四组。标准Bonferroni调整计算为每个基因,基因被认为是重要的如果价值与标准Bonferroni调整小于临界值(0.01)。目前,仅从标准Bonferroni调整值计算。我们执行的标准Bonferroni调整为每个零假设的方法的平均强度四组都是平等的;备择假设是,至少有一个的意思是不同的。单向方差分析处理后,意义探针集(保存为新的原始数据源)进行了盐酸TIGR兆电子伏软件工具和主成分分析(PCA) (17)使用R函数prcomp(…、规模= TRUE) Bioconductor 2.2版。盐酸进行使用欧氏距离和平均连接算法。

对于各种数据挖掘算法,我们进行无监督数据挖掘包括盐酸;另一方面,监督采矿方法,我们选择预测分析微阵列(PAM) [4所有样本的类声明。过滤数据集在学习数据集包括两个正常样品分离,三个年级II, III, IV ACMs系统,和测试集,其中包含两个正常样本,两个年级II, III和IV ACMs系统使用10倍交叉验证。单向方差分析是实现定义的重要探测TIGR兆电子伏(V 4-6-01)软件工具所有的参数设置和表演指前面的描述。类预测10倍交叉验证使用PAM excel 996年重要的探测包执行从TIGR出口兆电子伏。(http://www-stat.stanford.edu/提波斯/ PAM /)(2.212版)(4]。在PAM操作中,阈值(Δ)为41.0,我们建立了一个分类器包含171调查了“零”误分类错误(参见补充图2);生成的分类器是应用于测试数据矩阵数据组成的提到的996年重要的探测和相应的表达式值的测试数据集。

差异表达基因(度)单向方差分析的输出性能。度都是首次分布式功能概要文件使用基因本体术语包括生物过程、细胞组件,和分子功能(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)[18),用超几何分布19和罗斯福校正参数设置20.]。三个category-annotated文件包含基因注释和类别的生物过程,细胞组件,大卫和分子功能,出口使用在线工具(20.]。在每个文件中,在每个注释术语类别与纠正值(扩大)< 0.05收集。未经基因被排除在外。去数据库被更新为7月1日,2009年。两个数据库,BioCarta和KEGG用于识别显著改变通路。Dys-regulated通路被确定使用大卫系统(18,21)通过单向方差分析所产生的度映射到BioCarta和KEGG数据库。一个值为每个通道使用超几何测试获得了描述Zhang et al。22]。

3所示。结果

我们分析了54676年调查的表达IDs使用Affymetrix胡锦涛- 133 + 2.0 GeneChip微阵列15 ACM组织样本组成的五个二级,III, IV肿瘤和正常组织四个标本。质量控制实施规范化后的原始数据。Affymetrix数组中包含的基本质量控制检查RNA降解和检查的表达式控制基因,缩放因子,目前基因的比例,平均背景。补充图1 (a)和1 (b)显示的总体质量控制统计和RNA降解所有数组;图1中的信息补充明确说明这些数组的质量是完全可以接受的。

3.1。盐酸和主成分分析

gcRMA规范化和过滤器后,剩余的32095探针进行使用单向方差分析,然后利用主成分分析法(PCA) 4015探针被处决,盐酸和类预测(见方法和材料)。系统树图和热图(数字1(一)和1 (b)、职责)从层次聚类和两个(2 d图图1 (c))和三(3 d图图1 (d))主要从PCA主成分分析说明ACMs系统和正常组织样本可以根据病理阶段几乎完全分离。

我们用盐酸和PCA算法研究ACMs在全基因组水平上的变化。合成数据如图1。在图1 (b),每一行代表一个特定基因的表达水平在所有样本,而每一列表示的所有基因的表达水平为每个样品测试。乍一看,我们的全基因组水平分析表明,ACM样本分组到一个集群,而正常的控制样本单独集群。这表明全基因组转录分析可以用来区分ACM与正常组织。此外,集群内的癌症,肿瘤从特定的病理或临床阶段年级也聚集可靠地与同年级的其他肿瘤或阶段,表明肿瘤之间存在重要的分子概要文件在一个特定的病理分类等级或临床阶段(数字1(一)和1 (b))。肿瘤组织集群包含两个支行,一个是只有二级集群和另一个包含谁III和IV集群。使用前两个(图多维标度1 (c))和三(图1 (d))主成分线性投影方法,减少了复杂的微阵列数据的维度创建一个可视化的三维图肿瘤之间的亲缘关系,被用来测试上述子集是否可以用来区分II, III, IV肿瘤和正常的大脑。这一分析显示一个清晰的分离的三组根据这些基因。一般来说,盐酸和PCA(图的分析1ACM)明确表明,分类的基础上,全基因组水平是完全符合临床阶段,这是一个令人鼓舞的结果。

3.2。ACM分类

我们应用一个监督分析使用“最近的萎缩的质心分类器”和PAM对excel包(版本2.212)。如图2所示,补充41.0的阈值(Δ)被选为论点,我们构建了一个包含171个基因使分类器误分类错误= 0(补充图2)。然后我们使用这个分类器预测肿瘤的亚型6和2正常样本分析在这项研究。如表2和图2显示,预测的结果与临床病理分类一致。为了获得不同病理级别的ACM的标记基因,我们进一步运行listgenes按钮与阈值= 41.0在PAM excel包。因此,12个二级基因,12个三级的基因,并为第四等级(表13个基因3)被选为标记来区分不同等级病理组织,不包括132个基因称为正常组织标记。

3.3。去类

同样,gcRMA规范化和过滤和单向方差分析程序后,4015年的探测器被映射到2649独特的基因符号,和这些基因被进一步分析使用大卫系统(参数设置,请参考方法和材料)(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)。明显的过多的术语(纠正值< 0.5,没有基因> 10)补充表1所示。在细胞组件类别,19条款明显,包括外在膜,endomembrane系统,细胞连接,核内腔,染色质重塑复杂,积分细胞器膜,细胞器膜内在,质膜的部分。这些丰富的“核心数据集”膜在相同的显著性水平。在分子的功能类别,17条款丰富,包括酶结合,金属离子绑定,锌离子结合,阳离子绑定,Ras GTPase绑定,过渡金属离子结合。主要条款相关的生物过程包括细胞内的信号级联,积极调控细胞凋亡,和积极的调控程序性细胞死亡。

3.4。提供途径

浓缩的意义从单向方差分析实现超几何计算的测试与微阵列类型Affymetrix HU-U133-PLUS-2。19通路与超过5度和特异表达< 0.01 Biocarta数据库和KEGG数据库被确定使用大卫(补充表2)。最重要的五个BioCarta通路首次多价核转录因子、FAS信号通路(CD95), p38 MAPK信号通路,控制骨胳肌细胞生成的HDAC和钙/ calmodulin-dependent激酶(CaMK), BRCA1基因的作用,BRCA2, ATR在癌症易感性。前五名重要的特异表达途径从KEGG数据库通路在癌症、增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路(图3),磷酸肌醇代谢,扩张型心肌病,粘着斑、钙信号通路。

4所示。讨论

虽然微阵列技术是目前许多研究人员,评估和解释方法的微阵列数据仍在发展。到目前为止,大多数微阵列研究集中在临床设置分类和/或模式识别不同肿瘤类型之间的歧视或子组。这里,我们生成使用HG-U133plus2.0 15肿瘤的表达谱芯片(Affymetrix)的星形细胞瘤转录组组成的临床阶段。我们专注于临床和生物分子定义子组和星形细胞瘤的分子transcription-level基因特征的识别。

我们使用盐酸和PCA算法来研究基因表达的变化在ACMs全基因组水平。因此,我们的分析显示一个清晰的分离的三组根据这些基因,这表明有可分类的差异基本转录水平的基因在组织类型分类的星形细胞瘤。幸运的是,我们是成功的准确分类ACMs分成三个子组,II, III, IV, PAM方法和检测标记基因针对ACM(表的不同病理阶段3)。比较有趣的是我们列出的37个基因与基因,目前被认为是诊断ACMs系统。在未来的研究中,将测量几个基因产物免疫染色和PCR区分他互相ACMs系统:12基因C12orf39特定调节基因包括二世;8调节基因和4表达下调基因特定III, IV和13是特定调节基因。数据显示在表中3为了展示他们的缺点相比,最近发现的基因萎缩的重心。

我们进一步分析了基因表达分析ACMs系统使用的类别和使用Biocarta和KEGG数据库路径。dys-regulated途径,涉及ACMs系统报告。dys-regulated通路与ACM,磷酸肌醇代谢被报道参与星形细胞瘤(23]。王等人。24]表明p125粘着斑激酶(p125FAK)是一种胞质酪氨酸激酶被激活在订婚的整合素受体细胞粘附和启动几个信号事件,调节细胞功能体外(24]。最近的一份报告表明,沟通途径得到了最大的关注,因为它是已知的星形钙信号可以诱导神经刺激,可以传达回神经元调节突触传递(25]目前的研究代表了第一个努力同时比较高纯度ACMs系统的转录概况和正常组织从不同的病人使用现代微阵列技术。ACM和正常组织的表达模式的对比增强我们的能力来识别基因和通路中断在ACM肿瘤组织。这种分析提供了重要的见解正常和恶性肿瘤组织种群之间的差异,可用于评估针对ACM的疗法。

分析特定的细胞过程和途径在不同世代改变基因集补充表2所示。包含最高的路径列出了影响基因的数量。增殖作用的蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响在所有的改变基因集(图2)。MAPK信号是对大量的监管因素(26];MAPK信号通路在真核生物的进化,参与许多细胞过程,包括生长、分化、凋亡以及免疫反应(27]。这些通路功能守恒的下游信号级联的小gtpase Ras和ρ的家庭。级联由MAPK激酶激酶激酶磷酸化,激活MAPK激酶激酶,然后激活MAPK在刺和酪氨酸残基磷酸化守恒的主题位于激酶激活循环(27]。相当数量的研究表明MAPK信号在各种癌症的失调(28]。例如,Bakin et al。29日]显示MAP激酶激活与发展为晚期激素难治性疾病患者样本,稳定的循环Ras效应表达突变体,激活Ras / MAP激酶途径是充分降低雄激素的要求LNCaP前列腺癌细胞的增长,前列腺特异性抗原表达,和致瘤性29日]。最近的一份报告Zafon和Obiols30.)表明,MAPK信号通路的组成性激活是一个重大事件在乳头状甲状腺癌的进展30.]。沟口健二et al。31日)发现MAPK信号与恶性星形胶质瘤(31日]。我们分析的结果表明,这种途径在ACM特异表达,可能导致ACM的发病机理。

5。结论

有丰富的数据正常和ACM组织的基因表达谱。最近的几项研究发表,旨在检测分子标记来区分不同的年级ACMs系统。在我们的研究中,最近的萎缩的质心的方法成功地找到基因准确地预测类。37个基因的方法发现一套能够ACMs系统分配给三个类之一,II, III, IV ACMs系统,准确率达到了100%。我们成功的方法对于提高癌症的诊断有一定的意义。该方法有效地发现和排名基因可以区分不同类型的肿瘤。最终,它可能被用来寻找基因预测化疗反应。ACMs系统,预测基因是有吸引力的候选人适合提高抗体免疫染色。免疫组织化学的优势分析困难的标本,因为它允许病理学家本地化肿瘤细胞的染色。此外,我们的研究结果表明,RNA-based诊断测试可能很快变得可行,基于小型微阵列或定量PCR。

此外,我们进行了聚类和分类的类别和特异表达途径的基础上,基因表达在ACM与正常脑组织。根据microarray-wide基因水平,我们首先报道,使用盐酸ACMs系统分类的基因表达,PCA, PAM几乎完全符合临床病理阶段。这项研究为基础的基本机制的进一步发现患病的星形细胞瘤和将在目标有用的基因诊断和治疗干预。

比较ACM的表情特征从不同等级(ACM II、III和IV)患者的正常组织,我们确定了ACMs系统的度的基础上,去条款和特异表达途径与星形细胞瘤已确定和异形。补充表2总结了高层提供途径价值从KEGG BioCarta引用的数据库和显示的基因数量KEGG BioCarta通路和基因的数量被发现在我们的数据集通过单向方差分析分析。为每个KEGG或Biocarta通路,公正的系统性通路分析实现了大卫。的每个通路的价值反映了通路失调的重要性。这些途径,如MAPK信号,确定为重要。度是有效分类术语之间ACM和正常组织样本。

使用路径分析和分类去获得基因签名网络有几个优点。首先,它允许从生物功能在分子水平上更具全球性,疾病和生物过程的系统方法。第二,它确定了关键的监管者和转录因子可能不是被单独微阵列技术。第三,它允许进一步解释蛋白质的基因表达数据通过提供信息交互,代谢,信号和转录调控网络。本文因此提供了一个新颖的全局视图ACMs系统和正常组织之间的差异的转录水平。通过实验进一步研究和验证应针对已确定的过程扮演关键角色在ACM的代谢和信号通路。原始数据被存入地理(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/),这样其他研究人员可以访问这一重要资源。

利益冲突

所有作者声明没有利益冲突。

确认

作者想表达真诚的感谢编辑和审稿人的指导和可接受的建议。特别感谢由于评论家,其批判的眼光和开明的指导帮助和鼓舞人心的。通过修改论文指导评论家的评论,他们一直在学习丰富宝贵的知识,启发和鼓励他们在他们的研究生活。支持的项目是基于国家高新技术研究发展计划(863计划)主要在格兰特没有:2005 aa001070。

补充材料

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