用于椰奶甘油三酯含量的快速测定丝网印刷电极生物传感器的发展

抽象

丝网印刷的电极生物传感器用于椰奶甘油三酯测定的发展。的生物传感器中加入脂肪酶，甘油-3-磷酸（GPO）的发展，和甘油激酶（GK），其被固定到明胶溶液中。甘油三酯浓度被发现是线性对所产生的电流。The developed screen-printed electrode biosensor showed the optimum response for pH 7.0, 45 mg amount of gelatin, 2.5% glutaraldehyde concentration solution. The developed biosensor was able to find triolein concentrations 0.1 to 1.5 mM. The correlation obtained between these two methods was 93% which was found to be good.

1.简介

食品质量是最重要的因素对于任何生产要求，因为食品从农场到工业生产过程中消耗经受污染。化学和微生物学分析被周期性地进行，以检查食品的质量，这就要求样品制备，需要预处理感和最昂贵的过程。因此，生物传感器可通过快速检查质量，并在前台或在待检测的质量需求的地方[解决这一切1]。最近在分析化学中的趋势是向显影电化学装置，其易于便携性，快速检测，成本效益，选择性，灵敏度，更小的空间需求，以及最小的功率[去2]。三电极系统已经开发找到甘油三酯含量[3，4]。The three-electrode system is difficult for portability and carrying to a measurement point because the three-electrode system contains three electrodes fabricated separately and needs 10 ml of sample to analyze the quantity of any compound present in the sample.

丝网印刷技术是一种成熟的制备电化学传感器的技术，具有高选择性和高灵敏度[五]。丝网印刷电极可以由刚性的物质被制成柔性材料，因为它可以在柔性PET膜作为物质进行打印。丝网印刷电极不仅降低制造成本，但也可以由多种电极材料，可以以高度可重复的方式测量[6]。电化学分析，如安培检测，由于样品制备时间短，检测量小，在食品质量检测中越来越受欢迎[7]。

椰奶是其在南方的美食和世界各行业，包括面包店，糖果，冰淇淋，饼干等行业，提升各种产品的口感和风味的各部分所用的世界各地的水溶液，这是从椰子的固体胚乳中提取[8，9]。椰奶是高度敏感的，通过氧化反应发生的化学和生化腐败由于在它高油含量的存在。氧化通过甘油三酯分解成甘油和游离脂肪酸，它是由脂肪酶催化的发生。一样会有甘油三酸酯击穿，存在增加椰奶游离脂肪酸含量。甘油三酯是总共三个脂肪酸和一个甘油分子[的由天然脂肪4，10]。因此，甘油三酯含量的量将有助于确定椰奶质量，甘油三酯分解，然后游离脂肪酸含量将增加[11]。在本研究工作中，丝网印刷的电极的生物传感器的开发是为了检测椰奶甘油三酯含量的存在量。

2.材料和方法

2.1。试剂和材料

All reagents were purchased from Sigma Aldrich-Merck (Bengaluru, India) of analytical grade: C. rugosa lipase (E.C.3.1.1.3), glycerol-3-phosphate oxidase (Aerococcus viridans) (E.C.1.1.3.21), glycerol kinase (Cellulomonas sp.) (E.C.2.7.1.30), triolein (Y0001113), Triton X-100 (9002-93-1), and ATP. Fresh coconut milk was extracted from fresh coconut meat [12]。磷酸钠缓冲溶液的制备，如所描述的[13]。

恒电位仪/恒电流仪/阻抗分析仪（PalmSens 4）从PalmSens（荷兰）购买。对于丝网印刷的电极，所述工作电极由碳制成，所述参考电极由银/银的Cl，和对置电极由没有表面改性的碳和支撑材料是氧化铝陶瓷，将其从类购一个系统（新德里，印度）和用于甘油三酯的安培检测。

2.2。方法论的丝网印刷电极生物传感器的发展

用于丝网印刷的电极的制备的方法在图进行说明1。

2.3。明胶膜的制备

Gelatin and BSA (30 mg) were added to 300 μl of 0.1 M sodium phosphate buffer solution, and then, 31.5 μ氯化镁l的₂加入到该混合物中。The prepared solution was kept in the atmosphere for 10 min, and it was homogenized. A mixture of lipase, GPO, and GK has been coimmobilized into gelatin membrane solution through glutaraldehyde cross-linking. Here, one –CHO group was bound to –NH₂BSA的基团和连接到另一个-NH -CHO基戊二醛₂一组酶[14]。

2.4。三油酸甘油酯溶液的制备

三油精用作酶脂肪酶，GPO，和GK的基板。The solution was prepared at nine different concentrations from initial concentration 0.1 mM to final concentration 20 Mm. The solution was prepared using a 0.1 M sodium phosphate buffer solution and stored at the refrigerated condition for further use [3]。

2.5。测定脂肪酶，GPO和GK的混合物

The enzyme solution of lipase, GK, and GPO was prepared by adding 1 mg of the enzyme into 1 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer solution. From this, 300 μ的脂肪酶溶液升，150 μ升GK和60 μl GPO were added in a ratio of 10 : 5 : 2 to form a mixed enzyme solution. The enzyme mixture also consists of ATP and MgCl₂，这是制备多达10个 μ升，并加入到所制备的酶混合物[4]。

2.6。丝网印刷电极生物传感器的结构

用于测量椰奶甘油三酯的电流计生物传感器，通过加入40构造 μ升的酶混合物，其包含脂肪酶，GPO，和GK的，用10混合 μl of gelatin solution, and the enzyme mixture solution was then poured onto the working electrode and kept at 4°C for 30 min. The screen-printed electrode was then taken out, and again, 2.5% glutaraldehyde solution was poured onto the working electrode for 5 min for cross-linking, and then, the screen-printed electrode surface was washed using distilled water as explained in the flowchart in Figure1。将构建的丝网印刷的电极的生物传感器被带到用于测量连接到恒电位反应池，如图2。

所有实验均在室温下进行，并且对于不同的三油精的浓度进行测定的电流。The working electrodes were polarized at 0.4 V potential, and the current was measured amperometrically [15]。在co固定化脂肪酶、GPO和GK的作用下，加入三olein后立即发生反应。加入三油酸后，转化为磷酸二羟基丙酮和H₂Ø₂。然后，H₂Ø₂会在恒电位器施加的电势作用下分裂，然后，电子从H₂Ø₂其传递给对置电极[16]。所涉及的反应如下;

2.7。实验的程序

2.7.1。明胶的含量对丝网印刷电极生物传感器的影响

为研究明胶用量对丝网印刷电极的影响，取三种不同浓度的明胶(30、45、30mg)，并保持酶混合物和戊二醛浓度不变。用不同数量的明胶固定工作电极，观察其反应。

2.7.2。戊二醛浓度对丝网印刷电极生物传感器的影响

的戊二醛溶液1.5，2.5和3.5％的三种不同的不同浓度的拍摄，并在丝网印刷电极的生物传感器响应的影响被发现。明胶浓度的酶混合物和量保持恒定。

2.7.3。pH值对丝网印刷电极生物传感器的影响

制备pH为4.0 ~ 9.0的反应缓冲液，研究其对丝网印刷生物传感器响应的影响。将柠檬酸溶液加入到10 ml磷酸钠缓冲液中，使低pH值在4.0 ~ 7.0范围内，高pH值在7.0 ~ 9.0范围内加入甘氨酸溶液。酶混合物、明胶用量、戊二醛溶液浓度均保持不变。对于5毫米三烯酸溶液，记录每种pH条件下的输出电流。

2.7.4。三油酸甘油酯和输出电流之间的关系的发展

对于读数酶之间的电化学反应过程中产生的输出电流，将样品使用生物传感器拍摄，并且使用所获得的经验关系，计算甘油三酯的量。

2.7.5。甘油三酯测量椰汁

将5毫升牛奶与10毫升0.1 M磷酸钠缓冲液混合，找出椰奶中甘油三酯的含量。加入Triton X-100溶液，作为乳化剂。

2.7.6。所开发的丝网印刷电极生物传感器的验证

采用超高效液相色谱(UHPLC)对所研制的生物传感器进行了验证。UHPLC系统(日本岛田株式会社)配备柱:垫片包装XR-ODS III ( ，2.2 μm颗粒尺寸)，柱温40℃，流速0.3 ml/min，注射体积5μ用湖Mobile Phase ACN/MeOH/THF (40 : 40: 20 ）与注射体积为40 μl，以1ml /min的流速洗脱样品。

3。结果与讨论

3.1。明胶对生物传感器响应的时间的影响。

Among the three different amounts of gelatin, 45 mg was found to be giving the best results for biosensor response, linearity, and值。所得结果如图所示3。In 30 mg gelatin concentration, the substrate may leach out easily, and a higher concentration of 60 mg gelatin bioactive layer increases and makes it harder for the substrate to pass through a gelatin membrane. Thus, lower并获得生物传感器的响应。先前的研究也发现了类似样的结果为明胶膜[14]，聚氯乙烯膜[17]，和乙酸纤维素膜[18]。

3.2。在生物传感器响应戊二醛含量的影响

在2.5%戊二醛浓度下得到了最佳结果，如图所示4。在1.5％的低的戊二醛浓度由于与明胶膜和为3.5％的高浓度更少联横制成的衬底以从明胶膜容易漏出，生物传感器响应的情况下较少由于更多的交联，这防止了基片穿过一个明胶膜。丙烯酰胺为判定炸薯条[获得类似的结果19]和血清甘油三酯测定[3]。

3.3。pH值对生物传感器响应的影响

不同pH值的缓冲溶液，看对生物传感器响应的影响，并且它显示在图五。生物传感器响应被发现是高为pH7，并发现是低对其他pH值的溶液。对于pH 7.0，我们可以看到得到其在曲线图中绘制的最大电流（电流对pH）。作为pH的轻微增加或减少可以归因于在反应的酶的改变微环境和差异的折叠，因此，所获得的最大电流已被接受为具有最大活性。不同的研究对电位传感器pH值为7.0类似的研究[20]和氧计为基础的生物传感器pH值为8.0 [21]。

3.4。底物浓度的影响和相关的开发和三油精输出电流之间

Different triolein concentrations ranging from 0.1 mM to 1.7 mM were taken to find a biosensor response. The experiment was conducted in 10 ml final reaction volume in 0.1 M phosphate buffer, in which pH is 7.0. The graph was plotted for a prepared biosensor. The linearity was obtained from 0.1 mM to 1.5 mM defined by the equation （ ）这在图中所示6。有一个从线性对于更高的浓度，其可以是偏差由于不足量的溶解氧，这是共底物的酶或酶的生物活性材料有限。Similar results were obtained for PVC membrane-based biosensor (5-2.1 mM) [17], silicon-based biosensor (0.2-2.1 mM), cellulose acetate-bound enzyme-based biosensor (0.2-3.5 mM) [20]和溶解氧生物传感器(5-2.0毫米)[22]。

3.5。再现性

The reproducibility was tested for a total of three average standard solutions, which contain the same amount of triolein concentration of 0.5 mM. The standard deviation, variation of the coefficient, and average value were calculated as ，11.97％（ ）。

3.6。所开发的生物传感器的验证

为研究本方法的准确性，采用高效液相色谱法检测甘油三酯[23对不同贮藏期的椰奶进行了实验研究。两种方法得到的数值具有良好的相关性 ，这在图中所示7。

3.7。椰汁甘油三酯含量的检测

施加显影的丝网印刷电极的生物传感器，以检测在椰奶甘油三酯的量。五 ml of milk was mixed with 10 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer. Then, the solution was taken into a reaction mixture, and the output current was measured for the 5^日, 10^日, 15个^日小时。相同的椰子样品的甘油三酯含量使用UHPLC方法测量。通过这两种方法获得的结果在图进行比较7。

4。结论

构建了一种用于测定椰奶中甘油三酯含量的电流型丝网印刷电极生物传感器。脂肪酶、GK和GPO被固定成凝胶膜。然后，将酶混合物倒入工作电极上。然后将丝网印刷的电极连接到恒电位器上，测量输出电流。测得的电流与三烯酸浓度呈线性关系。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据已包含在本文中。

利益冲突

作者宣称，有兴趣对此文件发表任何冲突。

致谢

作者表示感谢处长，食品加工技术，坦贾武尔的印度理工学院，他不懈的鼓励。

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