文摘
使用全自动在线固相萃取(SPE)加上顺序注射分析、高效液相色谱法(HPLC)和电化学检测(EC)的分离和测定磺胺类药。自制的微柱凝集SPE系统加上顺序注射分析(SIA)被用于自动化样品清理和磺胺类药的提取。样本的最佳流量加载和洗脱被发现10μL / s,最佳洗脱时间区是20 - 24岁。在最优条件下,峰面积和磺酰胺浓度之间的线性关系获得了在0.01到-8.0之间μ克毫升−1。检测极限之间的七个磺酰胺类1.2 ng毫升−1和11.2 ng毫升−1。该方法已经应用磺胺类药在虾的决心。复苏的84 - 107%,相对标准偏差(rsd)低于6.5%,盘中为13%,inter-day收到三个浓度水平的飙升。结果表明,本方法简单、快速、准确测定磺胺类药和高度敏感。
1。介绍
磺胺类药(SAs)被广泛用作有效的化疗和生长促进剂在动物的喂养。他们是一群合成抗生素药物,扮演了重要的角色在人类和兽医药物治疗。SAs代表家庭最常用的抗生素之一,兽医,因为他们的低成本、低毒性,对常见的细菌性疾病和优秀的活动。如今,它们多用于治疗、预防和增长促进家畜牛农场(1,2]。残留的SAs可能发生在动物组织如果足够的撤军时间尚未观察到或者SAs管理不当。磺酰胺代理人因此,长期使用会导致严重的副作用,如史蒂文斯—约翰逊综合征和致癌性,因为人类消费(3,4]。此外,抗菌药物食品可能会导致过敏反应敏感的患者,可以培养致病菌的抗药性的发展。相当大的关注潜在的人类健康,欧盟(EU)设置最大残留水平在100 ng g磺胺类药−1在牛奶中食用组织和5]。在泰国,虾的前十名之一是我们出口给其他国家。维护人类健康和克服的局限性贸易基于SAs残留物,快速,准确,选择性、敏感和有效方法监测的SAs虾具有十分重要的意义。
几种传统方法已经成功应用的分离和测定磺酰胺含量不同的样本包括气相色谱(GC)、气相色谱分析-质谱法(GC / MS)、毛细管电泳(CE) [6,7),酶联免疫吸附试验(ELISA) [8,9),薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC-UV) [10- - - - - -17)、高效液相色谱-光谱法(HPLC / MS) [18- - - - - -25]。虽然提到方法提供良好的解决有机化合物,他们的敏感性往往足以直接测定微量食品中磺胺类药物残留。因此,样品制备是必需的,为了获得更高的浓度和避免干扰矩阵组成。最近,离线样品制备过程,如液液萃取(米歇尔)[14,26),基质固相分散(MSPD) [27),固相微萃取(SPME) (15),固相萃取(SPE) [1,16,18,20.- - - - - -24,28对磺胺类药的提取)已报告。不幸的是,经济复苏的这些方法的分析物和分析精度降低在准备样品。此外,他们还消耗大量的样品和溶剂。为了克服这些问题,在线固相萃取(SPE)加上了高效液相色谱法(29日- - - - - -36]。在线SPE是一个有吸引力的样品制备技术,因为它不仅可以提高分析精度,还降低了溶剂消耗。
近年来,顺序注射分析(SIA)已经变得明显,新航的范围可以扩展到包括各种更复杂的,在网上,样品处理,预处理过程。因此,新航的使用一个完全自动化的在线SPE程序之前,随后在高效液相色谱分析,提高生产率和再现性以及减少劳动密集型产业是一个有吸引力的选择。
从我们以前的报告,离线SPE使用绿洲HLB材料成功地提出并应用于提取残余磺胺类药在虾(28]。这种材料是一种hydrophilic-lipophilic平衡(HLB)吸附剂是由两个单体(N-vinylpyrrolidone和二乙烯基苯)。它表现出很好的保留多种极性分析物的能力18,24]。增加的性能和灵敏度HPLC-EC通过完全自动化,在这项工作中,我们使用在线绿洲HLB SPE程序扩展我们之前努力的决心磺酰胺类而不是使用离线SPE在高效液相色谱分离。常见的检测器对在线色谱SPE紫外线(UV) (10- - - - - -17),荧光1,4,37]和[女士18- - - - - -25]。尽管这些方法提供高灵敏度和选择性,有昂贵的设备,要求重要的劳动力和分析资源。如今,磺胺类药的替代检测测定电化学检测(EC)由于其高灵敏度,低成本、牢度和简单26,28,38]。
本文的最终目的是开发一个全自动在线SPE技术加上SIA-HPLC-EC分离和测定七种磺胺类药(磺胺胍(SG)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲嘧啶(SMZ) sulfamonomethoxine(多发性骨髓瘤)、磺胺甲恶唑(SMX) sulfadimethoxine (SDM)和磺胺喹喔啉(平方))。一个硅基整体柱用于磺胺类药对有机溶剂由于其高的分离,导致更长的寿命和更低的反压力,相对于其他传统的列。进行了细致的优化过程是为了得到一个在线系统的最佳性能。同样,一个详细的评估方法是可以令人满意地证明这种方法应用于确定七磺胺类药的残留浓度虾使用Oasis HLB SPE材料样本提取。
2。实验
2.1。试剂和标准
高效液相色谱法或使用的所有溶剂和试剂分析级。乙腈是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。乙醇是来自卡洛Erba(瓦尔德探寻、法国)。甲醇,磷酸氢二钠(Na脱水2HPO4),柠檬酸是来自默克(达姆施塔特,德国)。正磷酸盐二氢钾(KH2阿宝4)是获得BDH VWR国际有限公司,英国。乙二胺四乙酸二钠盐脱水(Na2EDTA)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。超纯水(R≥18.2 MΩ厘米−1)从Milli-Q系统(微孔)在整个实验过程。提取的解决方案(Na2EDTA-McIlvaine缓冲区,pH值4)是由溶解13.52 g的Na2HPO4柠檬酸13.02 g和3.72 g (Na2在一个升超纯水EDTA。在使用之前,所有解决方案和溶剂过滤为0.45μ米尼龙膜。
sulfadimethoxine磺胺嘧啶,磺胺甲嘧啶,磺胺甲恶唑,sulfamonomethoxine,磺胺喹喔啉从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。磺胺胍是来自ICN生物医学公司(美国)。股票(100标准的解决方案μ克毫升−1每个SA)是由溶解3毫克的SA在30毫升的乙腈:超纯水的解决方案(1):1 v / v)和在黑暗中储存在4°C。准备的工作解决方案与流动相稀释股票的标准解决方案。
2.2。材料和设备
绿洲滴粒径的30μ从水中获得了m(米尔福德,妈,美国)。自制的微柱凝集SPE(4.0厘米×1.59毫米证件)挤满了60毫克的绿洲HLB用于SAs的样品清理和提取。
HPLC-EC系统包括一个紧凑高效液相色谱泵模型2250(比绍夫,德国)和薄层流动单元(分析系统有限公司、日本)组成的三个电极:一个BDD电极工作,Ag / AgCl参比电极(分析系统有限公司、日本),和一个不锈钢管反电极。色谱柱是Chromolith性能RP-18硅基整体柱(100毫米×4.6毫米身份证。)从默克公司(达姆施塔特,德国)。进行了高效液相色谱的流动相,由磷酸缓冲溶液(0.05米KH2阿宝4,pH值3)、乙腈、乙醇的比例80:15:5 (v / v / v)。流量被设定为1.5毫升分钟−1。在这个实验中,使用的测量电流的检测是有应用潜力+ 1.2 V和Ag / AgCl。顺序注射系统,Auto-Pret ECD-01P (M&G CHEMATECHS日本有限公司、日本冈山日本)与2.5毫升注射器泵,2.5毫升控股线圈8-port选择阀(美国内华达州汉密尔顿)和6-port开关阀(Rheodyne MXT中715 - 000,美国)是用于样品处理。实验在室温下进行(25°C)。美国CHI1232A (CH仪器)用于测量电流的控制和信号处理。
2.3。在线SPE-HPLC过程
在线固相萃取耦合的原理图SIA-HPLC-EC测定sa的虾是描绘在图1。在线SPE-HPLC-EC由三个部分组成。组成的部分我是在线SPE三通注射泵(2.5毫升),8-port选择阀,6-port开关阀,保持线圈(2.5毫升),循环(34μL)和SPE微柱凝集。第二部分是高效液相色谱系统包括一个高效液相色谱泵和分析列。第三部分是一个EC探测器组成的薄层流动单元和数据采集系统(CHI1232A)。在线SPE过程包括六个步骤包括空调、加载、洗涤、洗脱,再调理,注入总结表1。列条件的第一步。SPE微柱凝集与1毫升的Na条件2EDTA-McIlvaine缓冲区。在第二个示例加载1毫升的磺酰胺类解决方案是引入SPE微柱凝集。在第三步,清洗,1毫升的超纯水是用来消除干扰SPE微柱凝集,而分析物保留在吸附剂。第四步,洗脱,0.2毫升的甲醇是用来洗提磺酰胺类吸附剂,然后洗出液区保存在样品环。第五步,SPE微柱凝集清洗。5毫升的甲醇和2.5毫升的超纯水顺序是通过溶剂合物的吸着剂的吸着剂的官能团。在最后一步,洗出液转移到分析柱通过改变开关阀从加载到注射位置。接下来,RP-18硅基单片分析列上进行分离。
2.4。样品制备
样品制备的设备包括一个旋涡混合器(混合器Uzusio LMS。有限公司、日本),超声波浴(ESP化学品公司,妈,美国),和一个离心机(美国伊利诺斯州科尔改)。虾得到从当地超市(泰国曼谷)。一克虾均匀样本被放置在一个15毫升琥珀色玻璃瓶,和5毫升的Na2EDTA-McIlvaine的缓冲溶液添加到瓶子。混合物混合在一个漩涡高速搅拌5分钟。然后,混合物被放置在一个超声波水浴10分钟后在20000转离心10分钟。之前加载上层清液进入在线系统,透过一个0.20μ米尼龙膜过滤器。
3所示。结果与讨论
3.1。固相萃取条件的优化
为了获得最优条件下,研究了各种参数的影响。其中包括洗脱液成分的影响,样品装载流量和洗脱时区。在这些参数的优化,10μ克毫升−1利用SAs的标准混合溶液,结果被评为最高的电流信号。
3.1.1。优化洗脱液的成分
从我们以前的报告28),甲醇被选为最合适的洗脱液为离线SPE实现完整的磺酰胺类萃取(SAs)虾和磷酸盐缓冲剂的混合物:乙腈:乙醇(80:15:5;v / v / v)作为流动相获得高分离效率。在这个工作中,七个SAs筛选了从在线SPE和直接通过分析柱(RP-18硅基整体柱),然后被电化学检测,分别。洗脱液不仅是用来洗提SAs从SPE还用于携带分析物进入整体柱和电化电池。因此,洗脱液成分对洗脱效率,直接影响分离性能和电化学信号的敏感性。甲醇为流动相的比例,研究了在50:50,60:40,70:30,80:20,90:10,100:0 (v / v)比率。结果见图2。通过使用50%的甲醇,只有三个山峰SG, SDZ和SMZ观察。有趣的是,甲醇比例增加到90%和100%,所有的SAs的七座山峰都可以记录下来。然而,所有分析物的保留时间随甲醇比例增加而降低。因此,甲醇洗脱液100%被选为最佳洗脱液下一个实验,因为这种情况导致了完整的SAs SPE柱、洗脱好七个SAs后高效液相色谱分离,最高的电化学信号。
(一)
(b)
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(d)
(e)
(f)
3.1.2。优化的示例加载流量
示例加载流量会影响SAs在SPE上保留的列。示例加载流量因此研究范围内的0.48,0.54,0.60和0.66毫升分钟−1。从结果如图3,它可以观察到,峰电流降低了在样本加载最小流量高于0.60毫升−1。这种效果是由于分析物之间的相互作用时间短和SPE柱吸附剂。更高的保留效率可以得到较低的示例加载流率;然而,总的分析时间也增加了。因此,示例加载流量0.60毫升的分钟−1被选为一个最优值之间的妥协交互时间和总分析时间。此外,示例加载流率的变化并不影响分辨率的七个SAs。
(一)
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3.1.3。优化洗脱的时区
SAs是从SPE柱筛选了之后,洗出液将保留在样品环(34μL)而开关阀设置在装载位置。然后,这个解决方案是通过左边的位置转移到分析柱注入。根据筛选了SAs的不同分布区域,最高的洗出液区sa浓度最好注入高效液相色谱系统中为了获得最大的灵敏度。提供最集中的区洗出液样品环,需要优化。从多方面的图(图1),发现洗脱液(100%甲醇),至少200人μL,被用来完全填补SPE柱洗脱液和新航6号端口之间的开关阀和港口8选择阀。在这个在线SIA-HPLC系统,洗脱时区不同于20 - 24,25 - 29 30 - 34,年代在恒定洗脱流速0.60毫升的分钟−1(10μL s−1使用注射泵)。洗出液的运动区被传递到分析柱和监控通过电子商务系统,分别。结果表明,七个SAs的峰值电流下降当洗脱时间增加,如图4。最大信号从一开始就获得了约20 - 24岁的洗脱步骤。这表明,sa的浓度在洗出液区从一开始就与洗脱时区洗脱步骤的停止。因此,20 - 24岁的洗脱时区被认为是最佳的交付洗出液区到样品环,然后分析高效液相色谱系统。
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3.2。分析性能
验证的方法对线性、准确性、精度和灵敏度为了评估方法提供的结果的可靠性。在最优条件下,建立了校准曲线通过测量各种浓度的七个化合物的峰面积与三个注射浓度标准的情景应用程序。研究了浓度在0.05 ~ -10.0的范围μ克毫升−1。校准曲线是线性浓度范围0.01 - -8.0μ克毫升−1SG, SDZ SMZ,多发性骨髓瘤,SMX -8.0和0.1μ克毫升−1长效磺胺和平方。相关系数通常超过0.994。检测的局限性(LOD)和定量的极限(定量限)计算和,年代提单空白的标准偏差测量()和S的敏感性方法或线性的斜率。总结了数据表2。
3.3。应用于虾样品
为了证明利用该方法,在线SPE-HPLC-EC申请SG的决心,SDZ, SMZ,多发性骨髓瘤,SMX、长效磺胺,平方虾样品抽样从当地超市的标准。通常,重要的问题在虾虾分析脂质含量大。之前样品加载到在线系统,Na2EDTA-MacIlvaine缓冲溶液的pH值(4)被用来提取虾的情景应用程序。该方法可用于确定SMZ,多发性骨髓瘤,SMX, SDM,平方,但SG和SDZ山峰重叠干扰化合物。这可能关心的虾非常大的蛋白质和脂质含量不能由高速离心沉淀与SPE和清理。
本方法的准确性是表示为一个百分比复苏的参数。恢复计算三个浓度水平的2,4,6μg g−1通过测量响应飙升空白虾。这些浓度的SAs在总体sa水平做了精度的选择:低、中、和高水平。的平均恢复五个SAs (SMZ,多发性骨髓瘤,SMX、长效磺胺和平方)在虾获得84 - 107%的范围,如表所示3。方法的精密度是重复性的特点是参数。连续三测量的相对标准偏差计算重复注射的包含标准化合物的全套解决方案。三个浓度上升(2、4、6μg g−1SAs的研究来评估该方法的可重复性。盘中,interday精密测定注入飙升空白虾在同一天(),同样的,这些方法分析了在不同天三次();结果如表所示3。所有浓度的SAs的相对标准偏差小于6.5%,盘中为13%,interday,分别。结果表明,该方法提供了可接受的准确度和精密度的SAs测定虾。
验证开发方法,开发方法的结果相比HPLC-MS从实验室获得的食品和农产品中心有限公司(表4)。可以看出,没有发现显著差异在95%置信水平的配对t以及方法。因此,情景应用程序的分析值在虾可以接受的和可靠的。
4所示。结论
完全自动化的样品制备、分离和测定sa在虾之前使用一个在线开发SPE加上新航高效液相色谱电化学检测。这项工作是我们之前努力的扩展与金刚石电极使用色谱法测定磺胺类药“真实世界”污染样品。特别关注在线样品制备。SPE SIA-HPLC电化学检测的自动化网络耦合以前没有提出确定磺胺类药;因此,第一次,我们有使用当前系统自动样品制备和测定sa在实际样品。方法表现出相似的敏感性与我们前面的工作。总之,发达的方法可以减少样品制备时间,试剂消耗和劳动密集型而使样本可以获得的有效清理。此外,方法还允许七SAs具有良好复苏的同时测定,精度,检测极限。总体而言,目前的方法是有前途的自动化在线样品制备高效液相色谱分析。因此,该方法可以推荐替代方法的常规分析残余SAs在虾。
确认
这项工作是支持的朱拉隆功大学90周年基金,创新对食品安全和食品质量的提高新的世界经济项目。还支持这项工作的泰国政府刺激方案2 (TKK2555),在项目建立全面创新中心食品、保健品和农业(正序连赢),大学格瓦拉和Ratchadaphisaksomphot养老基金项目(项目代码AM1009I)。