电化学Glycobiosensing的最新进展

文摘

基于电化学生物传感器转导机制最近多糖分析的领域方面取得了进步。这些glyco-biosensors提供简单、快速、敏感、快速和经济的方法来测量需要多糖分析生物标志物检测、癌症和疾病诊断和生物过程监测治疗糖蛋白。虽然多糖分析的普遍方法(高性能液相色谱、质谱和核磁共振光谱)提供详细的识别和结构分析多糖的物种,有明显一些低成本、快速多糖检测可用于诊断和筛查的应用程序。这里我们回顾glyco-biosensors一直用于多糖分析的实例使用各种电化学转导机制(如电流、电位、impedimetric和伏安),选择性绑定代理(例如,凝集素和抗体),和氧化还原物种(如酶基质、无机和纳米材料)。

1。介绍

糖基化的过程是一种多糖(即。,saccharide or carbohydrate) is added to a nonglycan moiety (e.g., protein) and is the most common posttranslational modification of proteins [1]。改变(即。,diverse molecular forms of a glycoprotein, resulting from variable glycan structure and/or glycan attachment site occupancy) of a protein profoundly influence structure, function, stability, and serum half-life, which in turn affects many biological processes. Glycosylation plays a role in cell-cell interactions and has been linked to several disease states, including infection, genetic disorders, and cancer [2- - - - - -4]。在癌症的情况下,异常蛋白质糖基化与早期的肿瘤细胞生长和增殖;因此,glycan-based生物标志物一直寻求早期检测(3,5- - - - - -9]。

蛋白聚糖分为N-linked或O-linked(图1)。N-linked聚糖连接Asn-X-Ser /刺的肽序列的网站,其中X≠脯氨酸,共享一个公共支trimannosyl核心。有三种N-glycan亚型:high-mannoseN-glycans甘露糖残基与甘露糖的核心,复杂的N-glycans,不包含终端甘露糖残基,但复杂的分支,和混合动力N-glycans含有甘露糖残基和复杂的分支。O-linked聚糖往往不太复杂(即。,linear), they do not share a common single core, and they attach through serine or threonine residues (GalNAcα1-O-Ser /刺)。七个单糖中发现人类糖蛋白甘露糖(人)、葡萄糖(相关),海藻糖(Fuc),半乳糖(加),N-acetylgalactosamine (GalNAc) N-acetylglucosamine (GlcNAc)和唾液酸(SA)或神经氨酸(NeuNAc)。

糖基化的变化也可以影响生物活性(功效)和免疫原性的蛋白质(安全)治疗药物产品,其中大部分是糖基化的10- - - - - -12]。Glycoanalysis需要审批和许可的蛋白质治疗药物和用于质量控制和过程变化监测(12- - - - - -14]。即将引进的生物仿制药品进入市场,glycoanalysis将入选“千篇一律”的决心一般蛋白质治疗药物。对药物产品的有效性和安全性的影响由于特定的多糖结构或结构有些不可预测的变化。因此,制造商糖化蛋白质通常指定和控制改变的观察到的分数水平由检测极限(LOD)和/或定量限度(定量限)glycoanalysis技术使用。的后果之一是多糖物种代表不到5%的多糖总数可能需要控制和指定。

这种严格的要求描述的多糖含量为生物和其他领域的研究导致了复杂的glycoanalysis技术的发展。Glycoanalysis是具有挑战性的原因有几个1]。现代生物学的不同于其他领域,比如预测蛋白质的肽序列的RNA和DNA序列,糖基化不是模板驱动的,因此是不可预测的。糖基化是固有的异构变化中发现身份,相对量,连接寡糖糖组的检查(14,15]。糖的化学结构单元可以很相似,没有不同分子量和电荷。即使在人口生产单克隆抗体克隆细胞表达系统,使用和高度监控增长条件下,人口异质多糖可以存在由于表达水平的变化16,17]。分析进一步复杂化,聚糖可以埋在蛋白质结构中,作为单克隆抗体的情况,最大的类蛋白质疗法。因此,多糖不容易识别绑定化验和样品准备必须采取措施进一步化学切割的多糖蛋白质和/或结构分析。

最常见的分析技术用于复杂glycoanalysis包括质谱(19- - - - - -22),核磁共振光谱(23- - - - - -26),和分离技术(例如,高性能液相色谱和毛细管电泳)(27- - - - - -29日]。这些方法已经成熟,而且能够提供详细的结构分析,使他们之间最常用的专家glycoanalysis研究中心(30.- - - - - -33]。尽管这些分析方法获得的信息是详细和严格,所需的时间和专业知识进行这些分析抑制的应用这些方法作为诊断或筛查检测质量控制监测biomanufactured样本,或生物标志物筛选疾病或感染。

完整的结构细节可能不需要监测,筛查或诊断应用程序(34]。准确的识别和定量的终端糖益生元(糖类)都是为这些类型的应用程序可能需要的。尽管生物传感器无法提供详细的糖基化信息,选择性和他们可以提供定量信息,通过综合生物识别事件可测量信号的转导,可以由非专业人士满足高通量glycoanalysis测量实验室(15,34,35]。

2。Glycobiosensors

Glycobiosensors最近进展到这个面积测量的科学。虽然糖分析通过电化学方法有着悠久的历史(特别是我们这里参考文献的大量用于葡萄糖分析葡萄糖氧化酶酶电极(36- - - - - -39]),扩展的分析多糖glycoconjugates物种(例如,糖蛋白和糖肤)或裂解多糖种类是比较罕见的。有几种生物传感器的应用综合评价研究聚糖(34,40)和碳水化合物(41,42]。这些评论包括一系列生物传感器设计的转导机制包括光学(例如,表面等离子体共振,SPR)、压电石英晶体微量天平、药物、电化学(如电子阻抗光谱学、EIS或脉冲测量电流的检测、PAD),和μ悬臂偏转。这里我们回顾glycobiosensors一直用于多糖分析的实例具体使用各种电化学转导机制。

2.1。电化学Glycobiosensors

电化学转换方法很有吸引力,因为他们通常不需要标记的多糖,电化学分析所需的物理仪器通常是非常简单和廉价的,和电极特征(例如,潜在的窗口、表面化学和大小)可以针对特定的应用程序。使用最广泛的应用之一,电化学转导碳水化合物的分析方法,包括裂解聚糖,是一种高效分离技术的耦合,如液相色谱(LC)或毛细管电泳(CE)垫。LC-PAD和CE-PAD系统展示了高选择性容易氧化或减少分析物的检测和限制对手荧光和质谱技术42]。这些成熟的分析系统显示显著的成功在过去的几十年里。信用证的应用,特别是高效阴离子交换色谱法(HPAEC)和CE垫低聚糖结构的测定和潜在糖基化的描述网站彻底检查了几组(42- - - - - -47]。这些评审讨论低聚糖的混合物的分析,糖蛋白、糖肤和glycoconjugates LC-PAD和CE-PAD。

其他电化学转换方法用于glycobiosensor设计包括微分脉冲伏安法(第一项)48- - - - - -54),循环伏安法(CV) [50,54,55),电化学阻抗谱(18,53,54,56- - - - - -64年),电位法(65年,66年],方波伏安法(SWV) [67年,68年]。本文特别关注生物传感器技术应用于glycoanalysis(即。,a glycobiosensor) that use electrochemical transduction mechanisms, unless otherwise noted [69年,70年]。

Glycobiosensor设计可能相当复杂,由于挑战与直接电化学分析聚糖有关。尽管碳水化合物能够氧化使用化学药剂,他们不常表现出氧化还原行为(42]。相似的化学结构,糖需要使用选择性粘合剂或glycoanalysis之前分离技术(42]。最著名的酶电极生物传感器设计,应用于检测葡萄糖。在这个例子中,碳水化合物的基质(葡萄糖)是酶(葡萄糖氧化酶)近端电极表面;酶的氧化还原活性产品测量反应在电极表面和溶液中葡萄糖的含量成正比。该技术首次引入50年前(36,38],有几个综合文章,回顾历史的研究在这个领域39,71年- - - - - -75年]。

最常见的类型的glycobiosensor设计呈现在图2。他们使用选择性绑定代理;最常见的是凝集素(carbohydrate-binding蛋白质),下面将讨论,和氧化还原探针结合上述电化学转导技术之一,最常见的是EIS和第一项。通常使用EIS时(图2(一个))、电极(平面或修改纳米材料涂层)修改glycan-binding代理(凝集素),这是一项选择性和亲和力。电极的电荷转移电阻变化的氧化还原电对的存在(例如,[Fe (CN)₆]^{3−−/ 4})的监测和解释为绑定聚糖,glycoconjugates或细胞表面的碳水化合物。对于凝集素生物传感器三明治化验(图2 (b)),一个表面束缚凝集素选择性地吸引了多糖目标到电极表面,和另一个氧化还原活性植物血凝素共轭结合捕获的目标。最后,细胞表面的碳水化合物分析,捕获的细胞通常是在电极表面(平面或改性纳米材料涂层),和一个lectin-enzyme共轭的底物选择性地结合到细胞表面的碳水化合物并提供电化学签名(图2 (c))。将看到具体的例子从下面讨论的文献,纳米材料通常是纳入这些生物传感器设计增加表面积和随后在电极产生的信号,或者作为氧化还原代理。

凝集素是目前最常用的选择性绑定元素glycobiosensor测量。凝集素是天然carbohydrate-binding蛋白质表现出专一性依赖于终端的身份糖分析物的残留。尽管凝集素的特异性主要取决于终端糖组,凝集素亲和的各种碳水化合物定量差异序列,甚至在当终端糖是一样的,已报告(76年,77年]。凝集素被用于许多glycomic研究领域包括生物标志物检测、临床诊断和carbohydrate-protein交互的理解(35,77年- - - - - -79年]。

表1列出了和sugar-binding特异性(使用的凝集素34为每个实例调查)。反对,甘露糖/葡萄糖结合凝集素,通常是用作选择下拉试剂,将聚糖,glycoconjugates或细胞平面电极(63年,64年)和纳米材料涂层电极(18,60,61年]。共价键的酶(如辣根过氧化物酶,合一个创建一个lectin-enzyme共轭,结合多糖物种产生的利息在电极和提供了一个具有氧化还原信号(48,52]。缺点也被用于lectin-glycan-lectin三明治化验(51]。

2.1.1。Glycobiosensors基于电化学阻抗谱

电化学阻抗谱(EIS)是一种高效、敏感、快速、廉价的技术适用于描述的转换在电极表面,因此,尤其适合若事件的label-free转导电极(64年]。EIS能够快速、label-free化验,通过分析电极界面的性质的变化与分析物绑定相关联。多糖的分析、EIS允许lectin-glycan绑定事件的审讯通过监控系统阻抗的变化,或者更具体地说,改变电荷转移电阻(在氧化还原电对的存在)。

EIS测量阻抗的系统在一个通过应用程序的频率范围小振幅的交流信号。EIS可以用来理解电化学反应速率,和描述接口由于其灵敏度电荷转移过程发生在电极/电解质界面。通过合适的EIS数据等效电路,的值(模型在界面电荷转移)。在电极表面会影响绑定事件由于阻塞效应上的固定化分子电荷转移过程;因此,(或)可以作为检测参数。

电化学阻抗谱,结合凝集素,第一次使用了拉贝莱和同事glycoconjugates在芯片的检测生物传感器(58]。植物凝集素机构和系统网络体系结构(SNA) (I和II)共价连接到一个金电极之前修改mercaptohexadecanoic酸,和impedimetric测量存在的氧化还原电对亚铁氰化物/铁氰化物被用来演示绑定的人工和自然glycoconjugates lectin-modified金电极。金纳米粒子的“人工糖蛋白”构造(AuNP)封装TF-antigens(加β1-3GalNAc),以及糖蛋白asialofetuin (ASF),迅速发现在PNA-modified电极,而糖蛋白胎球蛋白(场效应晶体管)的sialylated ASF的改变,发现在SNA-modified电极检测低的极限150 g / L (femtomol / L)。

奥利维拉等人修改金电极使用溶胶-凝胶方法与轭合物凝集素和金纳米粒子和聚乙烯醇缩丁醛(PVB) [61年]。使用EIS,他们研究糖蛋白卵白蛋白之间的相互作用和电极的亚铁氰化钾/铁氰化物在磷酸盐缓冲剂。葡萄糖/ mannose-specific凝集素,欺诈,Cramoll卵白蛋白,就是明证增加电荷转移电阻后的电极的糖蛋白。在卵白蛋白的浓度增加,从0.025 g / L 0.2 g / L,导致增加。这些变化经循环伏安法。

AuNP-lectin-PVB电极由奥利维拉和同事(61年)也被用来创建一个impedimetric生物传感器来检测血清糖蛋白从病人感染了登革热(DF) [59]。大量增加时获得的多糖部分糖蛋白在病人的血清感染DF获准与反对在修改后的金电极。增加一个小观察当健康患者的血清进行了分析,证明特定的欺诈之间的交互和聚糖可以区分从健康和DF患者血清。随后同一组的报告表明,impedimetric测量与AuNP-Con A-PVB电极区分病人的血清感染登革热和登革出血热(DHF),由于高表达的糖蛋白在登革出血热患者的血清,结果在一个更大的提高相比DF血清(60]。

类似的EIS生物传感器是通过修改铁制作的₃O₄混合纳米颗粒凝集素Cramoll,用聚乙烯醇缩丁醛和沉积在金电极(62年]。的铁₃O₄-Cramoll-PVB电极是暴露在糖蛋白胎球蛋白和登革热患者的血清感染不同血清型,和增加阻抗随后被观察,表明电极可用于lectin-glycan交互。该生物传感器有效地检测到存在的糖蛋白在几分钟,使用小样本容量,能够区分不同的血清型登革热。

Label-free impedimetric生物传感器(图3)之间的交互聚糖和lectin-modified电极作为识别原理分析多糖表情活细胞(18]。此外,lectin-glycan特异性的相互作用使得检测和识别的细菌(64年]。例如,快速,label-free电化学检测,识别,量化不同的细菌是通过监测impedimetric变化造成的识别细菌的凝集素和多糖组件之间的墙。九个不同生物素化的凝集素与微生物混合,随后沉积在金电极进行分析。生物传感器检测、识别和量化的三种不同的细菌检出限和线性范围等于或优于其它电化学生物传感器。另一个优势是,这种impedimetric传感器能够快速监测产生的电荷转移电阻变化之间的交互凝集素和细菌在金电极没有任何预先富集或preenrichment步骤。传感器显示的能力区分不同类型的细菌通过使用多路复用分析九凝集素(图4)。

广域网和同事捏造另一个lectin-based impedimetric生物传感器的快速和label-free检测硫酸盐还原菌(SRB)在反对修改金电极(63年]。缺点是共价连接到一个自组装单层11-mercaptoundecanoic酸(MPA)黄金,随后允许与SRB为了确定阻抗测量和监视细菌生长的(Fe (CN)₆]^{3−−/ 4}。几个参数,包括溶液的pH值和孵化时间,优化,SRB的浓度决定的电荷转移电阻值获得的EIS。此外,特异性的生物传感器研究通过分析不同类型的细菌,而且据报道,相同浓度的不同种类的细菌(如SBR和革兰氏阴性细菌诉anguillarum)诱导不同的变化值(图5)。impedimetric生物传感器产生了SRB生长曲线相似的同传统的和费时的最有可能的数量(或然数)方法,因此,证明EIS有很大潜力的快速、简单和低成本的检测和监测的微生物种群。此外,喜等人最近的工作表明,金电极改性与凝集素通过逐层自组装技术可以选择性地歧视革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌,真菌,哺乳动物细胞EIS [56]。

在相关研究中,EIS被用作一种有效的技术来探测sugar-binding特异性凝集素使用carbohydrate-modified电极,组成(掺硼金刚石80年和金81年),等等。此外,impedimetric测量阐明外源凝集素构象变化的影响在葡萄糖绑定在铂电极(82年]。

3所示。应用程序:生物标记和细胞检测

细胞表面聚糖扮演重要的角色在许多重要的生物过程,包括细胞分化、细胞粘附、细胞识别、和微生物发病机理(49]。异常的细胞表面的碳水化合物的糖基化模式与各种疾病;因此,它是至关重要的发展敏感、可靠和高通量技术来识别和检测细胞表面的碳水化合物。由于其高灵敏度、低成本、简单、测定时间短,易于小型化,glycobiosensors为多糖生物标志物的发现(一个不错的选择57]。在过去的几年中,glycobiosensors基于电化学阻抗谱(57),电位法(66年],伏安法(48,54,68年)已报告的检测细胞表面聚糖和潜在的生物标记物。此外,原位成像膜多糖图案的人类胃癌细胞(bgc - 823)已经完成了扫描电化学显微镜(SECM) [83年]。

最简单的一个glycobiosensor设计细胞表面多糖监测lectin-glycan绑定的特异性结合的电活性属性ferrocenyl集团(50]。二茂铁元羧酸酸(FcCOOH)是共价结合欺诈,和电活性species-lectin共轭获准与K562细胞。cell-Fc-Con配合是无法自由扩散到电极表面,,因此,诱导减少微分脉冲伏安法(第一项)的峰值电流,相比自由Fc-Con A减少电流的大小成正比的K562细胞,以及mannose-presenting聚糖在细胞表面的表达程度。这种简单的方法实现cytosensing和细胞表面的多糖量化。

一个类似的原则(即。,monitoring a decrease in DPV peak current caused by binding of cells to the electrode) was used for the sensitive detection and quantification of intestinal human colon adenocarcinoma (LS180) cells. This novel glycobiosensor was based on a competition between the specific binding of L-selectin to an aptamer, versus specific binding of L-selectin with glycans on the surface of LS180 cells. Binding of LS180 cells effectively blocked electron transfer between the electroactive species (naphthoquinone) and the electrode, causing a decrease in the DPV peak current.

双层电容测量的原则被Nagaraj和同事确定改变变异胎球蛋白和糖基化的蛋白质提取的差异从人类胰腺癌细胞系(57]。传感器,名叫Nanomonitor,由一个数组的金电极在一个硅芯片修改通过生物素与凝集素/化学链霉亲和素链接器。扰动的电双层发生在聚糖与凝集素,和扰动检测与impedimetric测量。传感器区分不同的胎球蛋白合成改变糖和糖基化差异蛋白质提取物人类癌变和正常的胰腺细胞。lectin-based ELISA检测相比,提供快速、Nanomonitor label-free糖蛋白具有更高敏感性分析(高出5数量级)和大动态范围的糖蛋白浓度。

工程纳米材料,包括纳米颗粒(51,66年),碳纳米管(48,52,54,量子点67年,68年,84年],和碳nanohorns [53),已与生物学结合使用绑定代理制造glycobiosensors生物标志物检测。例如,单壁碳纳米管功能化的短肽序列(RGDS, integrin-binding序列,抑制整合素受体功能)被用来捕捉人类白血病K562细胞在丝网印刷碳电极或人类胃癌细胞bgc - 823在玻璃碳电极(48,52]。细胞壁上的聚糖然后捕获的凝集素结合辣根过氧化物酶(合)和微分脉冲伏安法(第一项)记录解决方案中的电化学信号从合催化特征包含H₂O₂和o苯二胺。第一项量化的凝集素量峰值电流被俘,这是直接相关的数量聚糖在细胞表面。癌症细胞表面的多糖表达的程度和多糖的变化表达药物治疗后决定具有灵敏度高、重现性好。变异的分析显示增强灵敏度的检测K562细胞墙碳水化合物结合单壁碳nanohorns和金纳米粒子改性和反对一个合53]。

张和同事还开发了一个电化学酶联免疫测定,依靠第一项检测细胞表面的碳水化合物和能量依赖性蛋白22,可以找到肿瘤细胞(54]。HRP-catalyzed氧化的硫堇H₂O₂由循环伏安法监测、EIS和第一项在玻璃碳电极与nitrogen-doped碳纳米管改性,金纳米粒子,和反面(图6)。高手之间的特定的绑定和细胞表面mannosyl组捕获人类上皮细胞癌。Electrocatalytic从第一峰值电流测量相关的聚糖呈现在细胞表面。cytosensor设计,而复杂,显示出其良好的稳定性和重现性,和一个宽的线性范围和较低的检出限为22的量化和细胞表面的碳水化合物。

另外,潜在的转变发生在电极与卵巢肿瘤标记反应形成电位的基础免疫测定糖类抗原125 (CA125) [66年]。多功能磁珠,使用磁性铁合成₃O₄纳米粒子和聚(amidoamine)聚合物,用作亲和力anti-CA125支持固定,借助一个磁体,附着在碳糊电极。的潜在转移记录CA125绑定到电极后允许简单,快速,灵敏的电化学检测CA125的肿瘤标志物。的检测CA125 mucin-like糖蛋白也通过夹层电化学免疫测定CA125使用anti-CA125-coated磁珠捕获和固定电极,和anti-CA125-coated nanosilica粒子掺杂合和硫堇信号增强[55]。

顾等人开发了另一个夹层免疫分析法检测碳水化合物抗原胜负(CA胜负,胰腺癌的标志(68年]。轭合物的氧化锌量子点和CA胜负的抗体形成的三明治结构通过免疫反应与CA胜负和CA的单层胜负抗体在硅片上。氧化锌量子点与基质溶解在酸性介质,并包含锌的解决方案^{2 +}在电极和积累分析方波溶出伏安法(SWSV)。这可重用的免疫传感器灵敏度高、稳定性、选择性、和良好的重现性。此外,SWSV与cd或CdTe量子点也被用于开发竞争分析化验的K562细胞表面的碳水化合物(84年),和癌症相关的t抗原的检测67年]。

三明治格式也用于制造lectin-based传感器分析唾液酸的潜在生物标记物对人类肺、肝脏和前列腺癌(51]。金纳米粒子的复合膜和微碳纳米管固定化凝集素(图7)。绑定的聚糖细胞壁表面lectin-modified电极,紧随其后的是附件的金纳米粒子标记凝集素和电活性物种硫堇的固定化细胞,形成了三明治。硫堇的电化学信号是碳水化合物在细胞表达水平相关,因此间接相连的细胞的数量,允许细胞量化。label-free,电位传感器基于phenylboronic酸之间的交互(PBA)和1,2 -或1,3-diols应用于分析唾液酸的表情改变红细胞作为糖尿病诊断模型(65年]。前面描述的glycobiosensors能够检测唾液酸的增强表达在肿瘤细胞与正常细胞相比,红细胞唾液酸含量的差异,从而证明唾液酸可以作为潜在生物标志物为不同类型的癌症,以及糖尿病。

4所示。总结

Glycobiosensors提供简单、快速、敏感和经济的方法来测量的需要与期望快速多糖分析生物标志物检测、癌症和疾病诊断和生物过程监测治疗糖蛋白。这里讨论的例子通常在发生奇异,但各种电化学转换方法的成功应用,结合新颖的氧化还原探针说话的兼容性与glycoanalysis生物传感器。高灵敏度和动态范围广泛报道Nanomonitor系统就是一个例子如何设计精良glycobiosensor可以提供一个快速和label-free替代传统lectin-based ELISA测定多糖监控。多糖结构和功能的新信息是来源于作者研究新的glycobiosensors可以发展。除了凝集素结合代理、适体和抗体绑定代理的集成电化学glycobiosensors可以提高检测的特异性。进一步发展发展的这些类型的glycobiosensors将有助于有效地转移获得的知识专家glycoanalysis研究设施变成实际的低成本的高通量分析化验,可用于临床和生物制造设置。

承认

金融支持受到g S。通过国家研究议会研究-Pomales为准会员计划/ NIST博士后奖学金计划。

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版权

版权©2011 Germarie Sanchez-Pomales和丽贝卡·a·Zangmeister。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。