文摘

俄文(bpy)32 +的电化学发光检测(ECL)加上毛细管电泳(CE)是测定硫酸阿托品的开发的基础上一个Eu-PB修饰铂电极作为工作电极。分析物注入到50厘米长度的毛细管分离(25 m身份证。,360年 米的外径)朝阳注入10秒10 kV。分离和检测相关参数进行了讨论和优化。证明10毫米磷酸盐缓冲剂在pH值8.0能达到最有利的决议,和高灵敏度的检测是通过检测获得潜在的为1.15 V和5毫米俄文(bpy)32 +在80毫米磷酸盐缓冲剂在检测水库pH值8.0。在优化条件下,ECL峰面积是成比例的硫酸阿托品浓度范围从0.08到20 的检出限50 (3 )。迁移时间和峰面积的相对标准派生0.81和3.19%,分别。开发方法已成功应用于确定病人的尿样中硫酸阿托品的含量与复苏在98.6%和90.9之间。

1。介绍

阿托品((±)莨菪碱)是一个活跃的托品碱生物碱,从茄属的植物(作为一个传统的中国原油草),及其化学结构如图1。硫酸阿托品已经使用多年的临床麻醉的抗胆碱能在术前用药法。然而,高剂量的硫酸阿托品能刺激中枢神经系统,破坏人类的肾脏功能导致毒性反应(1]。因此,有必要建立敏感和有效的方法定量的硫酸阿托品在临床医学领域的。


图1
阿托品的结构。

更新不同的色谱方法,包括液相色谱(LC) [2),高效液相色谱法(HPLC) [3,4薄层色谱(TLC) [],5),气相色谱法(GC) (6阿托品)已报告的分析。然而,色谱法似乎耗时的缺点由于需要提取,浓度和/或衍生前分析。此外,批量制作最近声波传感器,用于测定血清中硫酸阿托品和尿液7]。应用领域的光谱分析、原子吸收法(AAS) [8),化学发光法(CL) [9),和电化学发光法(ECL) [10)也为阿托品开发检测。然而,这些方法经常遇到可怜的选择性在复杂样品的分析加上没有其他分离技术。

毛细管电泳(CE)代表一个有趣的替代是一个强大的分离工具,已经被应用阿托品分析。然而,目前的CE阿托品的方法通常加上UV-V探测器,导致限制检测的限制(11]。近年来,CE的婚姻俄文(bpy)32 +的发射极耦合逻辑检测已被证明是一种很有前途的和高效的分析技术在生化分析领域具有高度的敏感性和良好的分离效率(12- - - - - -15]。然而,利用裸金属铂电极在CE-ECL检测可以恶化的稳定性和灵敏度的中毒效应复杂矩阵在实际生物体液(10]。

近年来,化学修饰电极已被广泛用于检测微量的生物体液的中毒效应以来复杂的矩阵在光秃秃的铂电极可能恶化的稳定性和灵敏度16]。特别是普鲁士蓝(PB),其模拟和相关复合膜修饰电极收到更多的关注在大范围的电化学因为固有稳定性,高度可逆电极反应的性质,易于制备,和低成本17]。不幸的是,应用PB模拟改性电极与稀土离子在CE-ECL系统并没有报道其他工人虽然有些修饰电极也被用作固体发射极耦合逻辑探测器在CE-ECL检测(16,18]。它被证明在我们之前的工作19,20.),只有铕(III)再版普鲁士蓝类似物电影(Eu-PB)修改铂微电极有很好的催化活性的电化学发光俄文(bpy)32 +的系统。有鉴于此,准备一个由Eu-PB铂电极改性和应用作为工作电极和俄文(bpy)32 +基于CE-ECL方法开发的直接测定硫酸阿托品在病人的尿液样本。这个选择,更广泛的线性范围和灵敏度显著提高硫酸阿托品以来一直获得可能的电极污染是可以避免的。

2。实验

2.1。试剂和化学物质

硫酸阿托品是σ(圣路易斯,密苏里州,美国),刚做好的串行与双去离子水稀释前使用。三(2,2′联吡啶)氯化钌(II)六水合物(98%)来自奥尔德里奇(美国威斯康星州密尔沃基)。磷酸钠(pH值8.0,g . r .)用作缓冲溶液。所有化学药品和试剂均为分析纯,除了特定的语句。双重使用去离子水中,所有解决方案都是透过一个0.22μ孔隙大小膜在使用前。

2.2。装置

MPI-A多参数化学发光与休闲CE-ECL毛细管电泳分析系统软件(西安Remax电子科技有限公司,中国)使用。裸露的熔融石英毛细管(50厘米×25μm身份证。从工厂获得永年县光纤)(河北,中国)。结束列的发射极耦合逻辑检测与三电极配置安装,这是由铂Eu-PB修改磁盘(Φ= 0.5毫米)作为工作电极,Ag / AgCl充满饱和氯化钾作为参比电极,铂丝为辅助电极。

CHI832电化学分析仪(上海Chenhua仪器公司、中国)是用于修改的工作电极和测量微分脉冲voltammograms (D.P.V.s)。

2.3。过程

CE-ECL探测系统的原理图是一样的报道在以前的工作19]。5毫米俄文的溶液(bpy)32 +在80毫米磷酸盐缓冲剂(pH值8.0)直接注入到反应水库。运行缓冲溶液是10毫米磷酸盐缓冲剂(pH值8.0)。在动电的模式样本注入10 kV 10年代。分离电压17岁千伏。光电倍增管(PMT)在−850 V的偏见。capillary-to-working电极距离调整到150μm。新鲜的俄文(bpy)32 +取代每3 h,以获得良好的重现性。毛细管与两个样本之间的运行缓冲冲洗注射直到基线稳定。样品浓度被ECL峰面积定量。

2.4。铂电极制备Eu-PB修改

修改后的复合膜制备了表面光滑、清洁的铂电极。10.0毫升FeCl的解决方案310.0毫升K3铁(CN)6,6.5毫升盐酸,5.0毫升EuCl3和5.0毫升苯二甲酸氢钾(浓度都是0.01米)是直接添加到电化电池。Eu-PB电影逐渐-细胞潜在周期性扫描时的速度从0到1.3 V 20 mV / s 20段轮(南加州爱迪生公司和参比电极)。

2.5。尿液样品制备

新鲜尿液样本的患者获得兰州大学第二医院和两位男病人收集的3 h和8 h后0.5毫克硫酸阿托品注入时,分别。尿液样本使离心10分钟的2000 rpm。顶层是分离和去离子水稀释20倍,其次是通过一个0.22μm膜和直接注入CE-ECL系统和分析。

3所示。结果和讨论

3.1。影响Eu-PB修饰铂电极工作
3.1.1。影响电氧化特性的俄文(bpy)32 +

俄文(bpy)的电氧化特性32 +测试之前和之后的修改工作电极的微分脉冲伏安法。如图2电氧化峰电流的俄文(bpy)32 +在修改后的电极,显著增强,俄文(bpy)的氧化峰32 +观察在ca。1.05 V(与Ag / AgCl),轻微的负面转变ca。20 mV获得的关于修改的电极。因此,电解研磨效率的俄文(bpy)32 +可以改善由于俄文(bpy)催化氧化32 +因此生产激发态的俄文(bpy)32 +在准备的电极。


图2
微分脉冲voltammograms俄文(bpy)32 +在磷酸缓冲(pH值8.0):(a)在光秃秃的Pt电极;(b)在Eu-PB改性Pt电极。振幅:0.05 V;脉冲宽度:0.05秒;脉冲周期:0.2 s。浓度:俄文(bpy)32 +5毫米;磷酸盐缓冲剂,80毫米。
3.1.2。对阿托品的发射极耦合逻辑响应的影响

阿托品的发光反应调查准备电极如图3。发现的比率的变化发射极耦合逻辑信号与硫酸阿托品浓度的变化( )是显著增加使用Eu-PB修饰铂电极发射极耦合逻辑传感器,表明发射极耦合逻辑信号的变化是对硫酸阿托品浓度的变化更加敏感。因此,校准曲线的斜率会增强。此外,它也显示在图3线性范围将扩大Pt电极时修改。因此,制备电极将受益于硫酸阿托品的提高灵敏度和线性度。


图3
发光反应的硫酸阿托品裸Pt电极和Eu-PB改性电极:分离毛细管:25μ米,身份证。,45 cm length; sample injection: 10 s at 10 kV; separation voltage: 17 kV; running buffer: 10 mM sodium phosphate, concentration in detection cell: 80 mM, all at pH 8.0.
3.1.3。修饰电极的消毒效果

为了研究修改后的电极的消毒效果,硫酸阿托品在患者的尿液样本由CE-ECL方法使用铂电极和电极准备发射极耦合逻辑传感器,分别。发现未改性电极的使用导致了峰展宽和一个相当不稳定的测量由于电极中毒效应,因此是不适合真正的尿液样本的测定。时发现尿酸,其他矩阵,和阿托品在尿液中代谢物的几乎没有干扰的检测使用的电极,从而增强发射极耦合逻辑信号,低噪音,更好的形状、峰值和再现性得到改善。也证明了准备电极是足够稳定的重复使用检测系统一个多月没有需要更换电极。综上所述,修改后的电极显示了真正的尿液样本利用良好的消毒效果。

3.2。条件的优化
3.2.1之上。俄文(bpy)的影响32 +浓度

俄文(bpy)的浓度32 +对ECL信号有很大影响。结果表明:ECL强度显著增加而增加俄文(bpy)32 +浓度从0.2到5.0毫米的加速度反应速率。在这工作,5毫米俄文(bpy)32 +在80毫米采用磷酸盐缓冲由于担心种种和经济使用的试剂。

3.2.2。运行缓冲效果

阿托品测定,研究了在不同的缓冲系统包括磷酸盐、醋酸,Tris-HCl,柠檬柠檬酸acid-sodium,硼酸缓冲。最后,磷酸盐被选中的基线稳定,噪音低,分析时间短,和更好的峰形状。

此外,pH值磷酸对检测的影响研究在酸碱范围4.5 - -10.0每隔0.5单位。显示在图4pH值、ECL强度增加而增加的酸度范围4.5 - -7.5,到达了一个高原7.5 - -8.5,高于它减少一点。可能的原因是认为是俄文(bpy)之间的竞争反应32 +噢,- - - - - -离子产生高pH值(21]。所以pH值8.0被选为所有以下工作。


图4
运行缓冲液的pH值效应对ECL强度:其他条件,同样如图3所示。

与固定的pH值为8.0,运行缓冲液的浓度是由5 - 20毫米。发现在高缓冲浓度允许工作改进的灵敏度和分辨率。然而,高缓冲浓度会引起过热引起的焦耳效应,导致一个不稳定的测量。因此,10毫米磷酸盐在pH值8.0是用作运行缓冲。

3.2.3。检测潜在的影响

ECL强度取决于electroproduced俄文的效率(bpy)33 +和大大取决于氧化潜力应用于电极。见图5俄罗斯生产的增加(bpy)33 +上升可能导致增加的响应和获得最高的价值为1.15 V。上面,响应略有减少,暗示electroproduced俄文的效率(bpy)33 +竞争力下降反应涉及缓冲占主导地位。因此,最优潜力为1.15 V。


图5
检测潜在的对ECL强度的影响:其他条件,图3中一样。
3.2.4。分离电压的影响

同时分离电压对ECL强度和迁移的影响。更多的分析物抵达工作电极的扩散层与一个给定的时间内增加分离电压,导致更高的发射极耦合逻辑信号。同时,增加分离电压缩短EOF的迁移时间的增加。然而,系统无法去除多余焦耳热产生高电压导致峰值展宽和再现性下降。最后,17岁kV电压分离的最佳选择。

3.2.5。注入电压和注入时间的影响

注入电压和注入时间的影响进行了研究。结果表明,很难获得良好的ECL强度虽然列效率高可以实现当注射时间缩短,注入电压下降了。同时,再现性变得更糟的是当一个过度示例介绍了体积。最后,10 s 10 kV的注入参数推荐。

3.3。校准和检测

在最优条件下,硫酸阿托品浓度的校准曲线与ECL峰面积的线性范围从0.08到20μg·毫升−1,这是更广泛的比获得的铂电极(22]。回归方程可以表示为: 相关系数为0.9994 ( )。检测极限,定义为三倍的金丝试剂空白信号,ng是50毫升−1。

该方法的精度是由重复注射( )5.0μg·毫升−1硫酸阿托品标准的解决方案。相对标准偏差(R.S.D.)的迁移时间和ECL峰面积分别为0.81和3.19%,分别。

3.4。应用程序

为了检查申请临床分析,硫酸阿托品的含量在两个病人的尿液样本由该方法所决定的。electropherogram图6显示,尿酸,其他的矩阵,在尿液中代谢物的阿托品几乎没有干扰的检测使用的电极。见图6,峰值在267年代被发现从硫酸阿托品飙升的标准样品溶液。定量的回收率为98.6% ( ),约22.4%硫酸阿托品和不变的形式从尿液中排出。在测量过程中,另一个高峰在375年代总是发现,估计也有从一个正常的人类尿液代谢物。同样,另一个尿样本进行了分析和经济复苏的90.9% ( )。表中列出的结果1。

表1
在病人尿液测定硫酸阿托品( )。
(一)
(一)
(b)
(b)
图6
重复的(a)一个健康男性的稀释尿液样本;(b)男性患者的尿稀释样品;(c)稀释尿液样本的男性患者上升5.0μg·毫升−1硫酸阿托品标准解决方案;在图的其他条件都是相同的3。

4所示。结论

本文描述了一个俄文(bpy)32 +的发射极耦合逻辑方法耦合CE技术测定硫酸阿托品。一个Eu-PB修饰铂电极制备和使用ECL传感器取代传统的裸Pt电极电活性物种的吸附和直接氧化以来真正的尿液样本的病人工作电极表面可以尽可能避免。因此,信号的稳定性和重现性,线性范围,发射极耦合逻辑信号比硫酸阿托品浓度都显著提高。总之,该方法表现出一个优秀的性能对选择性,灵敏度,线性度,与稳定,进一步为托烷生物碱的测定带来了体液。

确认

作者(没有感激自然的基础。甘肃1010 rjza017)和国家的天然地基(没有。20707039)支持这项研究。