文摘

错误的耗氧量效应表现为减少极谱传感器读数的中性microadditives引入孵化介质是建模和测试。这些中性microadditives既不消耗氧气也导致其消费的其他组件中。表明microadditives不到3%的孵化介质的体积可能会导致虚假的耗氧量显著效应超过4%的初始氧含量。效果可以达到15%以上在更高的添加剂。添加剂增强效果的最重要的性质是低氧含量、低温、低浓度氧气盐析组件。

1。介绍

试剂的引入在孵化中耗氧量的极谱研究的操作。添加剂如ADP、衬底或解偶联剂正是开始消费的过程。即使在反应混合物中氧含量不变,添加剂的特性能够减少读数的测量设备是被忽视的。在最好的情况下,这将导致测量结果的失真,而在最糟糕的情况会确定氧气的消耗,实际上不是这样。在这种情况下,似乎是更重要的比预期的结果。在这里,这一现象被称为“虚假的耗氧量的影响。”

最常见的性能的添加剂,这可能会导致错误的耗氧量,包括:(1)没有或低溶解氧含量,(2)低的温度,(3)低水平的氧气盐析组件,和(4)高粘度。

引入microadditives (10 - 500μL),至少有一个以上列出的属性应该导致一个明显减少氧气的浓度或分压介质。此外,粘稠添加剂将增加的扩散层的厚度测量电极。这将导致减少极谱氧传感器读数,可以被错误地解读为耗氧量的生物学研究的对象。

虚假的耗氧量的影响伴随着呼吸的几乎每一个研究液体孵化媒体,而在文献中有单独的努力识别效果,并了解其机制(1- - - - - -5]。这样一个简单的系统被用作模型的某些参数microadditives操纵。这证明了虚假的耗氧量的定量方面,达到研究的目的。

2。方法

2.1。测量元件

测量细胞的体积(图4毫升1),装备有银极谱氧传感器,克拉克电极(6在修改Mancy [7),恒温37°C (±0.1°C)。由一个血氧计传感器读数记录N5221(波兰)。降低孵化介质和大气之间的气体交换,漂浮的塑料盖子被表面的介质。这允许添加任何液体的体积细胞没有损失。然而,盖子没有完全停止从大气中氧的扩散到孵化的媒介。因此,原始数据被修正为发布之前(8]。

2.2。孵化介质的模型

排除氧传感器的渗透对膜的影响,为了便于计算,而不是真正的培养中,使用了一个简单的模型。这个模型是氯化钾溶液的浓度60 g / L,而相同的成分和渗透压传感器电解质。它允许计算氧气的浓度以参考数据。这个解决方案是由连续流和氧饱和大气的空气富含水汽在恒温瓶在37°C。O的浓度₂在中是摩尔/毫升37°C和大气压力760毫米汞柱。

2.3。氧添加剂

解决方案的添加剂是由吹水蒸气饱和氮的混合物,这是开始前一小时,继续在整个实验过程中(表1)。

混合物在加热温度37°C或冷却浸泡瓶在融化的冰。增厚的解决方案是由溶解的氯化钾10%淀粉溶液浓度60 g / L。混合后3.5毫升中各种量的增厚添加剂、粘度计的相对粘度检测VK-4(俄罗斯)在20°C(5倍复制表2)。

2.4。实验方案

一旦孵化介质oxygen-saturated在37°C,然后3.5毫升的媒介是放置在一个恒温器测量细胞和浮动盖(图覆盖着1)。这是离开稳定血氧计读数为5 - 15分钟。记录被打开。然后,缺氧的添加剂被引入中微量吸液管通过一个等级的盖子。登记曲线如图2。

虚假的价值耗氧量的影响是由最低登记曲线(图2) 在哪里(摩尔):O的内容₂在3.5毫升的介质(37°C, 760毫米汞柱),

100(%):血氧计的最初阅读,(%):血氧计阅读至少,760(毫米汞柱):标准大气压力,(毫米汞柱):大气压力的测量。

每次测量后,细胞充满了新鲜的部分解决方案与大气中的氧气饱和37°C和保持20分钟恢复初始读数。添加剂的100、200、300和400μL在所有情况下使用。因此,10读数为每个卷了。

为了确定粘度、传播的变异系数计算了。此外,研究结果的统计评价,平均均值和标准错误也被计算。为了演示假耗氧量的统计学意义,t以及使用。这个测试数据比较了引入添加剂没有结果。2 - 5与添加剂的记录没有。1(卷到卷)。

3所示。结果

表3表示虚假的耗氧量的平均值在无氧添加剂的引入。独特的观察效果在所有情况下甚至100年添加剂μL,不到3%的孵化介质体积。

实现最大效果随着氧添加剂的引入冷却到0°C(添加剂。2)和添加剂含有120 g / L的至少使用氯化钾(添加剂。4)。

在所有的实验中,影响发展在缺乏氧气的添加剂。因此,个人贡献的其他因素计算差异效应同时作用下的两个因素(为添加剂开发。2 - 5)和氧添加剂的影响,没有不同于其他参数(添加剂的媒介。1)。结果展示在表4。

如表所示,缺乏氧气(添加剂。1),低温添加剂(添加剂。2),和一个没有溶解的化合物盐析氧气(添加剂。3)导致了统计学意义,但是虚假的孵化中氧含量的减少。发生这种情况即使添加剂的体积是100μl .过量的盐添加剂(添加剂。4)引起的可靠,但一个相反的效果。创建一个更复杂的画面,当增厚添加剂(添加剂没有使用。5)。因此,粘稠添加剂的影响假耗氧量的价值提出了图形形式(图3)。相比之下,还显示了其他因素的影响。

根据公布的数据(2),增加粘度应减少导致的测量设备读数,从而导致错误的消费的影响。然而,引入粘添加剂导致相反的效果(图3)。此外,统计确认指出最小曲线。

4所示。讨论

在目前的研究中,通过适当的方法使用公认的生物实验统计分析表明,引入添加剂,既不消耗氧气也启动了其消费的其他组件中,可能导致可再生的和显著减少氧的分压。尽管氧气在中不会改变的内容,分压的下降并不能消除模棱两可的解释结果的可能性(4,9- - - - - -11]。

虚假的耗氧量不仅是可再生的,但也很重要的。例如,在综合因素的影响下,即使添加剂(100年不超过3%μL)孵化介质体积,可以有统计学意义的“消费”超过4%的初始量的氧气。体积增加的添加剂(400 11%μL),虚假消费超过15%。这是完全比得上真正的耗氧量的对象,如线粒体生物实验(9,11,12]。

有不同的氧分压的下降的原因取决于类型的添加剂。没有氧添加剂(添加剂。1)导致稀释的含氧介质与纯溶剂(1,4]。由于浓度,但不是量,氧气减少,导致分压下降。如果添加剂有温度低于中等(除了没有。2),它的引入导致临时冷却的混合物。因此,氧在中溶解度的增加(5),和分压降低。没有或低氧盐析组件的内容添加剂(添加剂。3)导致浓度降低孵化这些组件的媒介。它也会导致氧气溶解度的增加13,14)和其分压下降。

因此,氧含量高的添加剂,高温、高盐含量应该导致相反的效果。然而,过饱和的氧和高温添加剂不常用的生物实验。测试只进行添加剂的盐浓度双重的高于介质(添加剂。4)。得到的结果,正如预期的那样,是一个统计上显著的增加氧气分压,它很容易掩盖实际耗氧生物研究中观察到的。

最困难的解释是增厚的实验使用添加剂(添加剂。5)。粘度的增加应该导致电极扩散层厚度增加(2),从而减少氧气传感器读数(明显减少氧气的分压),但结果是相反的。此外,增厚添加剂依赖虚假消费影响添加剂具有显著的体积最小,对应200卷μL(图3)。最可能的解释这一事实可能会同时影响的两个因素对氧传感器的读数有相反的影响。

减少错误的耗氧量的因素效果的盐析作用的添加剂。它不仅包含60 g / L氯化钾(约6%),但也有10%的淀粉作为一种增稠剂。他们的总浓度的添加剂是大大高于孵化中溶质的浓度。因此,没有添加剂的影响。5 200的体积μL非常类似于添加剂的作用。4(氯化钾,120 g / L)。

效果的因素导致了提高粘度的增加。的扩散层关闭氧传感器是足够大的,因为它包括膜的厚度。略有增加粘度的解决方案不可能显著影响其工作。时,才开始出现增长的影响扩散层厚度由于粘度的增加是与膜的厚度。人们认为这发生在添加剂的数量达到了300μL,混合物的相对粘度增加了1.36 20°C。从这本书开始,粘度测定的特点(图的依赖3)。

5。结论

因此,我们可以得出这样的结论:引入任何添加剂孵化介质,不同于介质的组成、温度、或粘度,将不可避免地导致氧传感器读数的变化。这些变化可以大到足以导致测量误差显著增加,同时well-reproducible工件的外观。这是确认为虚假的耗氧量的效果。在某些情况下,这种效果可以达到高氧含量的百分比在孵化中。

排斥这样的扭曲是不可能的,因为添加剂总是被各种参数不同于孵化介质。然而,有必要减少的效果。为此,试剂的解决方案与大气中的氧气饱和的温度孵化中应该使用。当准备试剂浓度较低时,水应该由孵化介质代替。如果这些建议很难满足,应该引入添加剂的控制测量氧气分压的变化条件,防止孵化中的氧气介质的实际消费。