免疫抑制剂霉酚酸酯的电化学氧化及其在药物配方中的测定

摘要

用玻碳电极在宽pH范围的水溶液中对霉酚酸酯(MMF)进行了电化学氧化研究。MMF在玻碳电极(GCE)上的氧化是一个主要由扩散控制的不可逆过程。用不同的标准验证了电极过程的不可逆性。提出了一种可能的电化学氧化机理。微分脉冲伏安图显示，在pH为6.0的磷酸盐缓冲液中，在0.631 V和0.921 V(相对于SCE)处有两个氧化峰。该方法可用于测定MMF的浓度范围来 M with a limit of detection ofM。该方法已成功应用于纯型、剂型和生物液体中MMF的分析。

1.介绍

霉酚酸酯(MMF)，化学名称为(Z)-2-morpholinoethyl6-(4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧基-1,3-二氢异苯呋喃-5-基)-4-甲基己基-4-enoate，口服后可迅速吸收并水解为其活性代谢物霉酚酸(MPA)。它是一种可逆的肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)抑制剂，因此可抑制嘌呤的合成[1，对T淋巴细胞和B淋巴细胞均有有效的细胞抑制作用。MPA的血浆半衰期约为16小时，用于预防肾移植排斥反应[2,心3.]，和肝移植[4.]，并且它也被肺移植后使用的5.),胰腺(6.和肠子[7.］．它也被用于预防骨髓移植后的移植物抗宿主病[8.］．由于MMF的临床优势，近年来市场上MMF制剂的数量有所增加[9.］．

几种分析方法即高效液相色谱法[10-14]，LC-MS [14),光谱光度测量的(15]，胶束电动色谱[16已被报道用于批量、制剂和生物样品中MMF的测定。报道的色谱和光谱方法被发现是耗时的。这促使我们开发了一种简单、快速、经济的分析方法进行常规分析。文献调查显示，目前还没有关于原料药和制剂中MMF含量估算的电化学方法报道。在目前的研究中，我们报告了一种简单、精确、准确和经济可行的电化学方法来估计散装和药物配方以及生物流体中的MMF。进行统计检验以验证数据。

2.实验

2.1。仪器

电化学研究是在CH Instruments Ltd.， Co.， USA, version 9.03的CH -1103a电化学分析仪电极系统上进行的，该电极系统使用GCE(直径3毫米)作为工作电极，铂丝作为对电极，饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极。

２.２.试剂

纯MMF作为礼物样本从印度雷迪博士的实验室获得。药片从当地商业渠道获得。在含有水和甲醇(50:50)的混合物中制备MMF (2.5 mM)原液，并在4°C冰箱中保存。在本研究中，使用磷酸盐缓冲液(pH = 3.0-10.4)。全部使用微孔隙水。

2.3。工作程序

为了重现结果，提高灵敏度和良好的伏安峰分辨率，工作电极用1.0,0.3和0.05仔细抛光μmα-氧化铝在光滑的抛光布上，然后在甲醇中清洗。然后，用水彻底冲洗。所有报道的电势均对饱和甘汞电极(SCE)。

工作溶液通过与需要的pH的相关缓冲器所需稀释原液制备的。For DPV, the following parameters were maintained: sweep rate, 20 mV s^-1，脉冲振幅50 mV，脉冲宽度60 ms，脉冲周期200 ms。对于分析应用，氧化峰被选中。所有实验均在25±1°C下进行。

2.4。片分析

10片MMF在研钵里磨成粉末。将相当于2.5 mM MMF的一部分粉末转移到100ml容量瓶中，并与甲醇和水混合物完成体积(50:50)。烧瓶的内容物用超声波搅拌10分钟，以使其完全溶解。取适量的清上清液，用支撑电解质稀释，制得合适的溶液。为研究该方法的准确性和检测制剂中辅料的干扰，进行了回收实验。通过校正图或回归方程确定片剂中药物的含量。

2.5。MMF的人尿和血浆样品测定

在0.9 mL等量尿液中加入100L MMF standard solution (2.5 mM) to obtain 250 M MMF。用磷酸盐缓冲液(不作任何预处理)稀释适量的加标尿液，制备合适的样品溶液，并在优化的条件下记录差分脉冲伏安图。

健康人的血清样本(在获得他们的书面同意后)冷冻保存，直到化验。血浆中MMF的测定，500L MMF溶液(2.5 mM)加入500L未经处理的血浆。将混合物旋转30秒。为了沉淀血浆蛋白，血浆样品用250大号高氯酸（15％）。After that, the mixture was vortexed for further 30 s and then centrifuged at 5000 rpm for 5 min. Appropriate volume of supernatant liquor was transferred in the voltammetric cell containing phosphate buffer of pH 6.0 and voltammograms were recorded. The voltammograms of samples without MMF did not show any signal that can interfere with the direct determination. The content of the drug in plasma/spiked urine sample was determined referring to the calibration graph or regression equation.

3.结果与讨论

3．1.Electro-Oxidation MMF的

MMF的结构如图所示1．循环伏安图为1.25 × 10^-4mmmf在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中以100 mV s的扫描速率进行扫描^-1在0.631 V处出现两个阳极峰，峰值电流为7.868A and at 0.921 V with a peak current of 7.292 分别一个。反扫描未见峰，说明氧化过程在本质上是不可逆的。MMF在ph6.0的磷酸盐缓冲液中以100 mV s的扫描速度进行多次扫描循环伏安^-1如图所示2．峰值电流的显著下跌后连续循环伏安扫描发现。这种现象可能是由于在电极表面的结垢由于在电极表面上MMF或其氧化产物的吸附[17］．为了验证吸附特性和第一个峰的可逆性，在0.2-0.8 V的电位范围内进行了另一个实验。但是，我们没有注意到反向扫描中的任何峰表明第一个峰的不可逆性。此外，峰值电流被发现在连续的循环中降低，从而揭示了氧化产物在电极表面的吸附。因此，考虑了与第一个循环相对应的伏安图。在两个阳极峰之间和、峰值考虑进行进一步的研究，因为它更尖锐，定义更明确，峰值电流更高。

３．２．pH值的影响

1.25×10电氧化^-4M - MMF在pH范围为3.0-10.0的磷酸盐缓冲液中通过循环伏安法进行研究(图3.）.峰a的电位₁到pH 7.0时，会转移到较低的正值，然后变得几乎与pH无关(图3.)，其峰较弱且不清晰，pH值超过7.0。基本得到两个线性区域;pH范围为3.0 ~ 7.0的，斜率为56 mV/pH，说明参与电极反应的电子数与质子数相等[18]， pH范围7.0-10.0，斜率为8.1 mV/pH。这些线的交点位于ph8附近，这接近于MMF酚基的pKa值8.5 [19］．注意到的第一个趋势可能是由于去质子化形式的MMF的氧化。在更基本的ph上观察到一种前波，这归因于从醇侧链形成醛[20.]其又形成由于内酯环的裂解。此外，最高的峰强度（峰)，随着pH的进一步升高而不断下降，因此选择pH为6.0的磷酸盐缓冲液作为进一步研究的支持电解质。

３．３．扫描速率的影响

研究了扫描速率对1.25 × 10电极电氧化的影响^-4M MMF在10 - 800mv s范围内^-1在通过循环伏安法的pH 6.0的磷酸盐缓冲液（检查图4.）.峰值电流图与扫描速率的平方根值(10-350 mV s)^-1)显示出线性关系(= 0.9912)表明电氧化为扩散控制过程[21，同样可以用下面的方程表示: 因此，我们提出MMF的电氧化是在10-350 mV s扫描速率范围内的溶液过程^-1而在扫描速率400-800 mV s范围内进行表面处理^-1．

峰值电位随扫描速率的增加而线性地向正方向移动。线性Randles-Seveik图(与ν)(图未示)，扫描速率为400-800 mV s^-1（R.²= 0.9904)根据公式: 表明MMF在GCE上的电化学行为似乎受到吸附的限制[22］．两者呈线性关系扫描速率的相关系数为0.9887，由下式可知:

3．4．电化学氧化机理

在MMF注意到的第一氧化峰可以归因于在酚-OH发生氧化，其是类似于香草扁桃酸观察到23]和沙丁胺醇[24]，然后水分子或甲醇在羟基的对位进行亲核攻击。观察到的第二个氧化峰是烯醛-OH基团的氧化。上述机理是根据图提出的而pH值的斜率为56 mV/pH，表明相同数量的电子和质子参与了电氧化过程[18］．图中显示了MMF氧化的一个可能的反应机制1．为了证实这一点，我们使用高比表面积的工作电极在1.2 V的固定电位下进行了6 h的本体电解。为此，在40 mL磷酸盐缓冲溶液中保持1 mM MMF的初始总浓度。通过的电荷为1.150 × 10^-1C，端电流为−1.004 × 10^-5一个。分离得到的产物经质谱分析，在m/z值分别为334、320和302处有三个峰，分别对应于MMF氧化产物的碎裂峰，即:a、b和C.分别(计划1）.

3．5．分析功能

与循环伏安法相比，差分脉冲伏安法具有更高的灵敏度和更好的峰分辨率，可用于研究电活性化合物的电化学行为。因此，我们将此技术用于MMF的测定。图中显示了不同浓度的MMF在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中GCE时的差分脉冲伏安图5.．在优化条件下，MMF在1.5 × 10的浓度范围内呈线性关系^-7-7.5×10^-4M。标定图形的特征记录在表中1．通过对检测限(LOD)和定量限(LOQ)的评价，验证了该方法的有效性。LOD和LOQ值计算公式如下: 在哪里S.峰值电流的标准偏差(5次运行)和m为校准曲线的斜率[25］．LOD和LOQ为1.48 × 10^-74.94 × 10^-7m分别。当前测量的可重复性是从1.25×10 5个独立运行计算^-4M MMF的解决方案。计算了日间测定和日间测定的RSD值。对应值见表1结果重现性好。

3.6。干扰物的影响

该方法的选择性是通过研究干扰的影响，即那葡萄糖，硬脂酸镁，淀粉，阿拉伯胶粉末，抗坏血酸，和滑石上电化学确定MMF的。对于这一点，我们已经记录20的微分脉冲伏安 MMF在不同浓度干扰的存在下。干扰对MMF峰值电流的影响结果如表所示2．可以注意到的是，抗坏血酸，硬脂酸镁，淀粉和不干扰高达10倍过量而葡萄糖，滑石和阿拉伯胶粉末施加任何影响高达20倍过量。因此，该方法提供了良好的选择性，MMF的决心。

3.7。药物应用(片剂分析)

所开发的DPV方法是为MMF的片剂测定成功应用。MMF的分析结果记录在表3.是令人满意的吗．采用标准加样法进行了回收率研究。为此，将已知数量的纯MMF与确定数量的预分析配方混合，混合物与之前一样进行分析。然后确定药物的总用量，并通过差值计算加药量。平均回收率是定量的，表明该药物的回收率较高(见表)3.）.

3.8。尿、血浆样品中MMF的测定

该方法的实际分析应用进一步建立在不经任何预处理的人尿样品中MMF的测定。尿液样品的回收率通过在无毒品的尿液中加入已知量的MMF来检测。用标定图测定尿样中MMF的浓度。分析结果如表所示4.．平均加样回收率> 99.5%，RSD < 2.1%。这些数值表明结果具有良好的回收率和重现性。

通过GCE分析血浆样品中的MMF，进一步验证了该方法的适用性。血清样本加入已知量的MMF，进一步用支持电解质稀释。血清样品中MMF含量参照标定图测定。结果包含在表中4.说明MMF恢复良好。

4.结论

首次研究了MMF在GCE中的电化学行为。发现MMF在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中发生不可逆氧化。应用所提出的差分脉冲伏安法成功地测定了片剂和生物样品中的MMF。该方法简单、快速、价廉，可用于临床和质量控制实验室。

致谢

作者感谢新德里大学资助委员会的财政援助(F. no.)。34/374/2008 (SR)日期30-12-2008)。我们还感谢达瓦德卡纳塔克大学当局提供了必要的设施。

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