文摘

甲状腺癌的发病率排名第九人类恶性肿瘤,它占endocrine-related肿瘤中最常见的恶性肿瘤。本研究旨在探讨长非编码RNA的作用(lncRNA) ZFAS1转移的乳头状甲状腺癌(PTC)和潜在的分子机制。ZFAS1和MMP3甲状腺癌和PTC细胞中高度表达,以TCGA q-PCR和数据库。此外,ZFAS1诱导TPC-1转移通过诱导epithelial-mesenchymal过渡(EMT)过程。此外,ZFAS1击倒siRNA诱导mir - 373 - 3p表达式和减少MMP3表达式,量化q-PCR和免疫印迹。根据荧光素酶测定,ZFAS1和MMP3都列为mir - 373 - 3的直接目标p。然而,MMP3本身并不影响ZFAS1。使用在线预测工具,CREB3预测的转录因子(TF) ZFAS1在其启动子区域,包含两个结合位点和CREB3 ZFAS1呈正相关,甲状腺癌组。dual-luciferase化验的结果和ChIP-qPCR表示,两两结合位点基本ZFAS1转录的。总之,CREB3激活lncRNA ZFAS1在转录水平促进PTC转移调制mir - 373 - 3p/ MMP3。

1。介绍

在endocrine-related肿瘤、甲状腺癌是最常见的恶性肿瘤1),其发病率在过去二十年中翻了一番。基于统计数据的流行病学研究,甲状腺癌的发病率排名第九人类癌症(2]。在甲状腺癌,乳头状甲状腺癌(PTC)占据了接近80%的类型。PTC有良好的预后,5年生存率超过95%后常见的治疗如手术和放射性碘治疗。然而,进步的疾病可能进一步发展由于当地转移和肿瘤复发3- - - - - -5]。实际上,转移可以在10% - -15%的PTC病人接受治疗。因此,它是至关重要的潜在的分子机制的阐明PTC转移,并提供预防措施。

长非编码RNA (lncRNA)是一种包含超过200个核苷酸non-protein-coding RNA。越来越多的研究表明lncRNAs可以观察到的异常表达在不同的疾病包括癌症(6]。最近,生物医学研究表明,lncRNAs扮演重要角色在PTC进展和发展7]。值得注意的是,lncRNA锌指反义1 (ZFAS1)已经被确认,促进癌症发展。在胃癌(GC), ZFAS1具有致癌作用的相互作用EZH2 [8]。ZFAS1也调节在头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是正相关的癌症启动和转移(9]。在甲状腺癌,几项研究确定的差别,对这些ZFAS1可以抑制PTC进展通过调制小分子核糖核酸(microrna),它可以作为一个潜在的生物标志物预测甲状腺癌预后[10- - - - - -12]。然而,底层ZFAS1 PTC转移的分子机制尚不清楚,因为有限的研究。因此,本研究调查的潜在机制ZFAS1 microrna在目标相关。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和治疗

TPC-1和Nthy-ori 3 - 1细胞系在RPMI 1640培养基培养是从Sigma-Aldrich买来的,完成的胎牛血清(美国Gibco的边后卫,10%)、青霉素、链霉素(2%),和两性霉素B(1%)在37°C, 5%的二氧化碳。hek - 293细胞从写明ATCC获得和培养与10%胎牛血清的DMEM 37°C和5%的二氧化碳。

2.2。向量克隆

异位表达ZFAS1 pcDNA3.1系统实现(pcD-ZFAS1)。插入ZFAS1序列通过聚合酶链反应。使用的引物如下:向前5′-CGGGGGCCCAGGGTGGAG-3′;反向5′-TTTTGATTTAAAAGATTTTATTTTCTTTATG-3′。microrna的目标荧光素酶测定,pGL3-control向量(美国Promega)使用。ZFAS1序列包含野生或突变mir - 373 - 3p结合位点克隆成pGL3-control向量通过测序验证。

2.3。转染

基于2000年Lipofectamine指令(美国热费希尔),2μg质粒和25 nM microrna或核用于转染。简单地说,5×105细胞被播种到6-well板和培养,直到融合达到75%。Lipofectamine 2000年与质粒混合或RNA在1:1比例Opti-MEM™媒体(美国Gibco),然后在室温下呆了5分钟。混合物被添加到6-well板孵化48 h。具体siRNAs ZFAS1和设计并合成MMP3 GenePharma(上海,中国)。序列(5′3′)如下:siZFAS1: GTGCATGTGGTAGGTTAGATT;siMMP3: GAAGCAGTTTACTAAGAAA。

2.4。实时聚合酶链反应

不同的治疗后,总RNA提取高纯RNA隔离设备(瑞士罗氏公司)根据协议提供。提取rna被reverse-transcribed cDNA封底cDNA合成设备(热费希尔,美国)。分析了基因表达中存在与SYBR预混料TaqII交货(豆类)和LightCycler 480系统(罗氏,印第安纳波利斯,美国)。使用2的相对表达水平计算−ΔΔCT方法(循环阈值(CT))。中使用的引物列表在表中存在1(5′,3′)。

表1
存在引物。
2.5。免疫印迹

免疫印迹简要描述的详细过程。不同的治疗后,细胞细胞溶解里帕缓冲区和溶菌产物与BCA量化工具根据制造商的指示。总共30μ每一组g蛋白的加载10% sds - page凝胶电泳。然后,蛋白质转移到PVDF膜后通过阻断与5%的脱脂牛奶TBST 30分钟。美国主要抗体MMP-3 (Abcam)β肌动蛋白(Wanlei,中国)被稀释到5% BSA溶解在TBST 1: 1000年基于抗体的数据表。PVDF膜与稀释孵化主要抗体在一夜之间在4°C。二级抗体稀释成5%脱脂牛奶溶解在TBST(1: 10000)和孵化与膜1 h - 1.5 h在室温下与温和的颤抖。增强化学发光(ECL)系统是用于成像。

2.6。Transwell化验

在播种前细胞到一个8μ美国m transwell室(微孔),不同的治疗方法对细胞进行6-well板24小时。然后,细胞被播种到一个上院3×10的密度5细胞/室。参议院200年充满了μl媒体没有的边后卫,而众议院充满了800μl媒体含有10%的边后卫。细胞培养48 h,然后用PBS洗两次。细胞被固定为甲醇30分钟,然后沾0.5%结晶紫,持续15分钟。染色后,他们用PBS 3倍和照片是由显微镜成像系统(德国蔡司)。

2.7。RNA免疫沉淀反应

细胞转染mir - 373 - 3p模仿或消极控制48 h。转染后细胞被NP40缓冲细胞溶解。AGO2 (anti-AGO2, 1: 50、细胞信号、美国)抗体或使用免疫球蛋白g和免疫沉淀反应25个μl蛋白A / G的结扎珠子。试剂盒试剂添加沉淀剂提取rna。然后,mir - 373 - 3p、ZFAS1 MMP3被q-PCR测量。

2.8。ChIP-qPCR (q-ChIP)

Q-ChIP是根据提供的协议进行汽车理想ChIP-qPCR工具包(美国Diagenode)。CREB3在HEK293细胞中,然后与chrome DNA分离通过CREB3抗体(美国ThermoFisher)降水。获得chrome DNA用近10分钟让DNA片段以适当的大小。的表达ZFAS1被q-PCR评估。引物用于q-ChIP列表在表2。

表2
引物用于q-ChIP。
2.9。荧光素酶检测

microrna的目标和转录因子结合位点被荧光素酶试验证实。ZFAS1 3′UTR区域包含的全部长度microrna的种子序列通过PCR和插入pGL3-control向量。狗表达®乐器组快速诱变工具包(Vazyme中国)被用来引入突变体种子序列pGL3-control向量。ZFAS1启动子区域通过PCR是基于人类基因组DNA模板。启动子序列插入到pBV-luc向量(美国Addgene)。预测转录因子结合位点被狗表达突变®乐器组快速诱变工具包(Vazyme,中国)。引物用于荧光素酶测定列表在表3。

表3
引物用于荧光素酶检测。
2.10。生物信息学分析

ZFAS1、MMP3 CREB3微分表达谱进行了分析从TCGA-THCA数据集从美国国家癌症研究所的基因组数据共享下载(https://gdc.cancer.gov/)。ZFAS1基于个别癌症的表达谱阶段,表达式基于淋巴结的转移状况,对甲状腺癌患者的总体生存率的影响通过分析执行下载RNA-seq TCGA-THCA数据集的数据和临床数据。所有数据包含临床信息得救了。TPM(成绩单每百万)值转化为log2价值进行分析。ENCORI (http://starbase.sysu.edu.cn/)是用于分析和预测microrna的目标。通过JASPAR转录因子分析(http://jaspar.genereg.net/)和UCSC基因组浏览器(https://genome.ucsc.edu/)。ZFAS1之间的相关性,分析了CREB3通过在线生物信息学工具GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)。

2.11。统计数据

所有数据提出了平均±标准差值(至少包括三个独立的实验)。分析实验数据是通过双向方差分析(方差分析)t以及,分析使用GraphPad Prism8软件。Mann-Whitney TCGA-THCA数据分析U测试执行。 < 0.05和< 0.01的值被认为是统计上明显不同。

3所示。结果

3.1。lncRNA ZFAS1甲状腺癌中高度表达

在临床样本,获取ZFAS1表达谱TCGA-THCA表达式的数据进行了分析。如数据所示1(一)和1 (b),ZFAS1的表达显著增加THCA样本与正常样本。此外,ZFAS1也积极与THCA阶段(T3和T4阶段)和节点转移状态(数据1 (c)和1 (d))。然而,ZFAS1并未表现出显著影响存活率(图1 (e))。接下来,我们测试了ZFAS1表达在两个不同的PTC q-PCR细胞系。事实上,在TPC-1细胞,ZFAS1的表达水平超过2.0折的价格相比人类甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-ori 3 - 1(图1 (f))。集体,ZFAS1积极与甲状腺癌和可能促进癌症发展。

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图1
ZFAS1表达在甲状腺癌。(一)ZFAS1表达谱在原发肿瘤和正常组织从TCGA-THCA获得数据集( )。(b) ZFAS1在原发肿瘤和正常组织表达谱从TCGA-THCA获得数据集( )。(c) ZFAS1表达谱在不同癌症阶段甲状腺癌从TCGA-THCA获得数据集( )。(d) ZFAS1表达谱在不同的甲状腺癌淋巴结转移状态从TCGA-THCA获得数据集( )。(e)的关系ZFAS1表达和THCA病人的存活率。截止值是50% - -50%(高低)。(f) ZFAS1表达式是衡量q-PCR TPC-1细胞和Nthy-ori - 3 - 1细胞( )。
3.2。抑制lncRNA ZFAS1抑制TPC-1转移

后来,在转移ZFAS1评估的功能。首先,几个epithelial-mesenchymal过渡(EMT)标记被q-PCR测试。TPC-1细胞、间充质标记如波形蛋白、SNAI1,蛞蝓和调节,而上皮钙粘蛋白表达下调是相对于Nthy-ori标记(图3 - 1细胞2(一个))。然后,具体siRNA ZFAS1转染到TPC-1细胞。ZFAS1核(siZFAS1)显著减少ZFAS1表达TPC-1细胞(图2 (b)),siZFAS1增加钙粘蛋白的表达而抑制波形蛋白,SNAI1和蛞蝓(图2 (c))。此外,Transwell试验还表明,siZFAS1抑制TPC-1入侵(图2 (d))。上述结果表明,抑制ZFAS1抑制TPC-1细胞转移。

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图2
在TPC-1 ZFAS1转移的影响。(一)EMT标记被q-PCR测试TPC-1细胞和Nthy-ori 3 - 1细胞( )。(b) ZFAS1小干扰rna(被撞倒了 )。(c)的影响小干扰rna (siZFAS1) ZFAS1 EMT q-PCR TPC-1细胞标记测试( )。(d)的入侵能力TPC-1细胞测量与细胞转染siZFAS1和量化后数字( )。
3.3。lncRNA ZFAS1直接mir - 373 - 3的目标p

采用在线生物信息学工具ENCORI lncRNA ZFAS1为特征的直接目标mir - 373 - 3p(图3(一个))。事实上,mir - 373 - 3p模仿被转染进TPC-1细胞,ZFAS1的表达被抑制约20%的价格相比-控制(图3 (b))。在荧光素酶测定,记者向量包含ZFAS1野生型序列(pGL3-ZFAS1 WT)显示荧光素酶活性下降而向量包含ZFAS1突变序列(pGL3-ZFAS1狗)(图3 (c))。此外,mir - 373 - 3p也抑制波形蛋白的表达,SNAI1和蛞蝓而诱导的钙粘蛋白。此外,过度的ZFAS1废除mir - 373 - 3的影响p模仿EMT标记(图3 (d))。有趣的是,ZFAS1压抑的异位表达mir - 373 - 3p表达式在TPC-1细胞(图3 (e)),这表明ZFAS1不仅直接mir - 373 - 3的目标p也扮演了一个角色microrna的“海绵”,影响了mir - 373 - 3p表达式。上述结果表明,ZFAS1直接mir - 373 - 3的目标p,而ZFAS1介导mir - 373 - 3的表达和功能p。

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图3
目标确认ZFAS1和mir - 373 - 3之间p。(一)ZFAS1被预测为mir - 373 - 3的直接目标p。(b) mir - 373 - 3的效果p在TPC-1 ZFAS1表达细胞被q-PCR测试( )。(c)目标ZFAS1和mir - 373 - 3之间p证实了荧光素酶试验( )。(d) mir - 373 - 3的效果p和mir - 373 - 3p/ pcD-ZFAS1 cotransfection在TPC-1 EMT标记细胞由q-PCR测试( )。(e)的影响ZFAS1过度mir - 373 - 3p表达水平测试由q-PCR ( )。
3.4。lncRNA ZFAS1调制mir - 373 - 3p/ MMP3轴

接下来,我们检查是否下游mir - 373 - 3的目标p被ZFAS1监管。同样,MMP3被预测为mir - 373 - 3的直接目标p通过使用ENCORI在线生物信息学工具(图4(一))。荧光素酶分析证实,mir - 373 - 3p直接针对MMP3(图4 (b))。此外,mir - 373 - 3p模仿在MMP3有抑制作用(图4 (c))。蛋白质免疫印迹分析表明,MMP3水平被mir - 373 - 3表达下调p(图4 (d))。siZFAS1转染到TCP-1细胞时,mir - 373 - 3高p表达和低MMP3表达式被发现(图4 (e))。此外,在TCGA-THCA数据集,发现MMP3原发肿瘤样本(图中高度表达4 (f))。然而,当MMP3被siRNA沉默,观察ZFAS1无显著变化(图4 (g))。最后,在RNA免疫沉淀反应,ZFAS1和丰富了MMP3 anti-AGO2 mir - 373 - 3后抗体p转染(图4 (h))。因此,ZFAS1诱导MMP3表达式通过mir - 373 - 3p目标。

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ZFAS1调制mir - 373 - 3p/ MMP3轴。(一)MMP3被预测为mir - 373 - 3的直接目标p。(b)目标MMP3和mir - 373 - 3之间p证实了荧光素酶试验( )。(c) mir - 373 - 3的效果p在TPC-1 MMP3表达细胞被q-PCR测试( )。(d) MMP3蛋白质水平下降了mir - 373 - 3p模拟( )。mir - 373 - 3 (e)p和MMP3表达被q-PCR测试在TPC-1 ZFAS1推倒后细胞( , )。(f) MMP3表达谱在原发肿瘤和正常组织从TCGA-THCA获得数据集( )。(g)的影响MMP3推倒q-PCR ZFAS1表达式进行了测试。(h) ZFAS1和MMP3浓缩AGO2抗体分析RNA免疫沉淀反应遵循q-PCR ectopically mir - 373 - 3表达后测试p( )。
3.5。转录因子激活CREB3 ZFAS1表达式

有越来越多的证据表明,几个关键TFs的失调lncRNAs在人类癌症13- - - - - -15]。分析潜在的ZFAS1 TFs, ZFAS1启动子区域(2000个基点)获得UCSC基因组浏览器。从JASPAR ZFAS1 CREB3被预测为TF,包含两个结合位点在其启动子区域(数据5(一)和5(b))。事实上,在TCGA-THCA, CREB3呈正相关,ZFAS1(图5(c))。此外,CREB3 THCA样本(图显示更高的表达式5(d))。CREB3过度增加ZFAS1表达式在HEK293细胞(图5(e))。根据dual-luciferase化验,两个结合位点的转录,自从第一个或第二个突变网站荧光素酶活性下降(数字5(f)和5(g))。q-ChIP测定,抗体与免疫球蛋白g相比,使用CREB3丰富ZFAS1 CREB3过度后(图5(h))。上述结果表明,CREB3提升ZFAS1表达式作为一个特遣部队直接绑定到ZFAS1启动子。

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图5
CREB3 transactivated ZFAS1表达式。(a)和(b) JASPAR预测假定的CREB3绑定图案的位置在人类ZFAS1发起人−2000个基点。(c) CREB3被发现正相关ZFAS1表达在甲状腺癌。(d) CREB3表达谱在原发肿瘤和正常组织从TCGA-THCA获得数据集( )。(e) Ectopically表示CREB3诱导ZFAS1 q-PCR水平测试( )。(f)测定荧光素酶记者cotransfection长篇ZFAS1之后执行发起人或删除ZFAS1启动子片段CREB3表达质粒或空白向量TPC1细胞。(g)荧光素酶的活动表示为相对于pGL3向量( )。(h)之间的绑定CREB3 ZFAS1 q-ChIP试验证实了;乙酰胆碱受体作为负控制( )。(我)监管模型CREB3 / ZFAS1 / mir - 373 - 3p/ MMP3 EMT过程。

4所示。讨论

在这项研究中,我们验证lncRNA ZFAS1促进甲状腺癌细胞转移通过调节MMP3通过共同mir - 373 - 3p目标。此外,ZFAS1被TF CREB3证实被激活,总结在图5(我)。以前的研究已经表明lncRNA ZFAS1与EZH2交互具有致癌作用的GC [8),也是调节HNSCC因为它是正相关的癌症启动和转移(9]。与在其他癌症,结果发现ZFAS1也证实了高表达在甲状腺癌。沉默ZFAS1压抑TPC-1入侵能力的细胞,表明ZFAS1是甲状腺癌转移紧密相关。此外,沉默ZFAS1诱导上皮标记钙粘蛋白的表达,但抑制间充质标记。因此,ZFAS1可能通过调节EMT过程诱导甲状腺癌转移。

竞争内源性RNA(龙头)网络的一个主要lncRNA监管机制(16]。因此,潜在的microrna的目标也是在这个研究调查。ZFAS1验证直接mir - 373 - 3的目标p。事实上,mir - 373 - 3p通过针对不同lncRNAs发现抑制癌症发展(17,18]。在这里,mir - 373 - 3p运行作为一个肿瘤抑制microrna TPC-1细胞。值得注意的是,mir - 373 - 3p抑制ZFAS1表达式,ZFAS1的异位表达也压抑mir - 373 - 3pTPC-1细胞中表达,这表明ZFAS1还充当一个microrna的“海绵。“此外,我们也证实,mir - 373 - 3p直接目标和压抑MMP3表达式。作为基质金属蛋白酶(MMP)的一个成员的家庭,MMP3 cell-extracellular矩阵中起着关键作用(ECM)交互和导致EMT刺激(19]。因此,MMP3是一种很有前途的下游mir - 373 - 3的目标p/ ZFAS1轴,这可能是参与调节甲状腺癌转移。值得注意的是,沉默ZFAS1也导致MMP3的低表达,但沉默MMP3稍微影响ZFAS1表达,这表明ZFAS1位于上游的监管轴。mir - 373 - 3p、ZFAS1 MMP3互相通过直接绑定,证实了RNA免疫沉淀反应;因此,ZFAS1 / mir - 373 - 3p/ MMP3监管轴是甲状腺癌转移的关键。

除了ZFAS1-related电抗器的规定,我们也调查了潜在TF ZFAS1调节器。这里,TF CREB3属于bZIP家族(20.)被激活ZFAS1表达式通过直接绑定到其启动子区域。CREB3属于CREB3家族,在代谢中发挥着关键作用,肿瘤发生,细胞分裂。先前的研究已经确定了,CREB3函数作为一个特遣部队通过绑定到下游目标,如CC趋化因子受体1 (CCR1)和组蛋白脱乙酰酶3 (HDAC3),从而诱导肿瘤发生[21,22]。符合这些发现,我们证实CREB3 ZFAS1甲状腺癌中高度表达。结果荧光素酶试验和q-ChIP透露,CREB3直接绑定到ZFAS1启动子区域。值得注意的是,这两个假定的CREB3结合位点都是激活ZFAS1所必需的。我们的研究结果表明,lncRNA-miRNA-gene监管轴是甲状腺癌的关键细胞使癌症治疗中考虑多个目标的提示。尽管如此,仍有局限在这项研究中,例如,缺乏体内的证据进一步支持整个CREB3 / ZFAS1 / mir - 373 - 3p/ MMP3监管轴。总之,CREB3激活ZFAS1驱动器甲状腺癌的转移,这是参与mir - 373 - 3p/ MMP3监管轴。

数据可用性

在生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

信息披露

进行这项研究的作者的就业西南医科大学的附属医院。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。