文摘
骨钙素是一种bone-derived激素起着重要的作用在骨之间的串扰和能量代谢。先前的研究已经发现,治疗uncarboxylated骨钙素可以保护小鼠免受脂肪食源性非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。然而,潜在的机制尚不清楚。尽管G protein-coupled受体家族C组6亚型(GPRC6A)是公认的骨钙素的受体,没有直接证据表明GPRC6A介导uncarboxylated骨钙素的影响在缓解非酒精性脂肪肝小鼠。我们旨在找出使用肝脏特异性GPRC6A淘汰赛(GPRC6ALKO老鼠)。与先前的研究一致,uncarboxylated骨钙素显著保护高脂肪饮食野生型老鼠肥胖和非酒精性脂肪肝,虽然它没有保护高脂肪饮食GPRC6ALKO老鼠从非酒精性脂肪肝。微分mRNA表达GPRC6A之间的脂肪生成和脂解作用LKO老鼠和控制老鼠显示GPRC6A介导的骨钙素的影响在缓解非酒精性脂肪肝通过抑制脂质合成和促进脂类分解。总之,本研究发现uncarboxylated骨钙素减轻非酒精性脂肪肝小鼠通过GPRC6A信号通路。我们的研究表明,肝GPRC6A可能是一个潜在的目标治疗非酒精性脂肪肝。
1。介绍
普遍的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是全球迅速增加(1]。非酒精性脂肪肝被认为是肝代谢综合症的表现,经常与腹部肥胖,高血压,糖尿病和心血管疾病(2]。非酒精性脂肪肝的组织学频谱范围从简单的脂肪变性到非酒精性脂肪肝炎(3]。大量的激素和细胞因子参与非酒精性脂肪肝的发病机制4]。
骨钙素,bone-derived激素,是由成骨细胞合成和分泌。的vitamin-K-dependentγ-carboxylated形式的骨钙素调节羟磷灰石的大小和形状。近年来,骨钙素的extra-bone功能获得了越来越多的关注(5,6]。流行病学研究发现,血清总骨钙素水平与非酒精性脂肪肝具有负相关性(7),腹部肥胖(8),亚临床动脉粥样硬化(9),和代谢综合征10]。基本的实验表明,骨钙素的uncarboxylated形式增加胰腺ß从胰腺胰岛细胞增殖、胰岛素释放,胰岛素敏感性和能量消耗11]。老鼠缺乏骨钙素显示胰腺癌细胞增殖下降,葡萄糖耐受不良,胰岛素抵抗[11]。此外,治疗uncarboxylated骨钙素可以保护小鼠免受食源性肝甘油三酯积累(12,13]。然而,非酒精性脂肪肝的机制uncarboxylated骨钙素的作用尚不清楚,需要调查。
G protein-coupled受体家族C组6亚型(GPRC6A)是一种代谢调控的主(14]。GPRC6A提出了集成通过协调分泌激素代谢功能,包括胰岛素,glucagon-like peptide-1,白介素6,和这种受体的直接作用在控制葡萄糖和脂肪代谢的肝脏、骨骼肌、脂肪组织(15- - - - - -18]。一些先前的研究报道,GPRC6A介导uncarboxylated骨钙素的代谢和内分泌的影响。GPRC6A敲除小鼠导致代谢综合症,GPRC6A刺激的扩散的激活ß肽、外围增加胰岛素敏感性和防止高脂肪饮食(HFD)全身的代谢异常14,19,20.]。骨钙素腹腔内注射的增加循环胰岛素水平在野生型小鼠(WT)而不是GPRC6A基因敲除小鼠(20.,21]。没有直接证据证明uncarboxylated骨钙素减轻非酒精性脂肪肝小鼠通过GPRC6A信号通路。GPRC6A表型的基因敲除小鼠表明这个G protein-coupled受体参与新陈代谢,调节炎症,内分泌功能。因此,我们使用肝脏特异性GPRC6A基因敲除小鼠来检测是否在非酒精性脂肪肝GPRC6A起着关键的作用。
2。材料和方法
2.1。动物和治疗
GPRC6A液氧/液氧在老鼠和老鼠通过Cre-loxP-mediated构造复合购自南京南京大学生物医学研究所。生成肝脏特异性GPRC6A淘汰赛,GPRC6A液氧/液氧小鼠(GPRC6A等位基因的外显子2两侧loxP网站)创建和backcrossed C57BL / 6 j遗传背景。GPRC6A液氧/液氧和albumin-Cre老鼠随后通过杂交产生GPRC6A液氧/液氧小鼠albumin-Cre老鼠,它表达了Cre重组酶转基因的控制下白蛋白基因启动子/增强子元素。男性GPRC6ALKO老鼠和WT同窝出生年龄在6到8周被安置在一个特定的无菌实验动物房,12小时光暗周期(黑暗从7:00点到7:00点)。所有实验符合《条例》起草的评估和认证协会在上海实验动物保健,伦理委员会批准上海交通大学附属第六人民医院(批准号2015 - ky - 001 (T) - (1))。
所有老鼠随意获取食物和水,再辅以HFD(美国60%的能源来自脂肪,研究饮食)。小鼠的腹腔里注射了一剂30 ng / g重组uncarboxylated骨钙素(美国Anaspec目录号码:- 65307)或生理盐水(车辆)每一天。重组的原液uncarboxylated骨钙素是由溶解uncarboxylated骨钙蛋白粉在DMSO溶液,浓度是1 g / mL,然后刚在生理盐水稀释浓度3 ng /μL对腹腔内注射12]。男性GPRC6ALKO小鼠随机分为uncarboxylated骨钙素治疗组(GPRC6ALKO:HFD + OCN,n= 8)和汽车集团(GPRC6ALKO:HFD + NS,n= 6)。WT的同胞也随机分为uncarboxylated骨钙素治疗组(WT: HFD + OCN,n= 7)和汽车集团(WT: HFD + NS,n= 6)。
在实验期间,体重监控每周电子天平。经过14个小时的通宵禁食、空腹血糖(FBG)尾静脉血液中水平测量两周一次的使用一个ACCU-CHECK glucometer(罗氏公司、德国)。HFD喂养16周后,小鼠被安乐死(1%戊巴比妥钠,10μl / g体重)。部分肝组织学检查在中性4%多聚甲醛固定,和其他肝脏组织立即在液态氮冷冻。组织被转移到一个−80°C冰箱进行进一步分析。
2.2。腹腔内葡萄糖和胰岛素耐受性测试
腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)和腹腔内胰岛素耐量试验(IPITT)进行16周后HFD喂食。IPGTT,一夜快14小时后,小鼠腹腔注射1克/公斤葡萄糖,然后尾静脉血糖水平测定在指定的时间点。IPITT,早上快5个小时后,一个1 U /公斤剂量的胰岛素(美国礼来公司)腹腔注射,和尾静脉血液收集测量血糖水平在指定的时间点。
2.3。肝组织学检查和肝脏甘油三酯测量
Hematoxylin-eosin(圆))染色,油红O染色进行根据先前描述的方法(22]。简单地说,一块肝脏在中性4%多聚甲醛固定24小时,嵌入在石蜡,随后切成5μ米厚的部分。最后,部分是沾)(贝索,中国),然后在显微镜下观察(德国蔡司)。油红O染色,肝脏组织中4%中性多聚甲醛,沉浸在蔗糖脱水,解决方案和嵌入式在10月Tissue-Tek化合物(美国樱花Finetek)。随后,他们在冰冷的平台和速冻切成10μ米厚片。片是沾油红O(美国σ)15分钟,然后白光显微镜下观察。为测量肝甘油三酯(TGs), 40 - 50毫克的肝组织均质在0.5毫升PBS。充分混合后0.4毫升匀浆和1.6毫升CHCl3-CH3OH (2: 1, v / v),暂停在3000 r.p.m离心机。在室温下10分钟。较低的有机相转移和风干一夜之间在化学罩。剩余液体resuspended于800年μ特里同x - 100 l(1%绝对乙醇,和TGs决心使用血清甘油三酯的浓度测定工具包(σ,甘油三酸酯试剂T2449和自由甘油试剂F6428)。
2.4。定量实时聚合酶链反应
总肝RNA从冷冻组织利用试剂盒提取试剂(生活技术,美国)。互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript从总RNATMRT主组合工具包(豆类、日本),和实时PCR进行SYBR®预混料Taq交货TM二世工具包。目标基因的相对表达规范化是肌动蛋白的表达β(ACTB)。ACTB的mRNA表达,stearoyl-coenzyme desaturase 1 (SCD1)固醇调节元件结合转录因子1 (SREBP1),甘油二酯O-acyltransferase 1 (DGAT1),细胞death-inducing DNA分裂因子αsubunit-like效应(CIDEA), acyl-coenzyme氧化酶1 (ACOX1)、过氧物酶体proliferator-activated受体α(PPARA) acyl-coenzyme脱氢酶介质链(ACADM)、过氧物酶体proliferative-activated受体γ共激活剂1α(PPARGC1A)趋化因子(碳碳主题)配体2 (CCL2)、肿瘤坏死因子(TNF),激活转录因子6 (ATF6), x - box结合蛋白1 (XBP1),热休克蛋白5 (HSPA5), glucose-6-phosphatase催化亚基(G6PC)进行了分析(表1)。
ACADM acyl-coenzyme脱氢酶介质链;ACOX1 acyl-coenzyme氧化酶1;ATF6,激活转录因子6;CIDEA,细胞death-inducing DNA分裂因子αsubunit-like效应;CCL2,趋化因子(碳碳主题)配体2;DGAT1,甘油二酯O-acyltransferase 1;G6PC glucose-6-phosphatase催化亚基;HSPA5,热休克蛋白5;PPARGC1A、过氧物酶体proliferator-activated受体γ共激活剂1α;PPARA、过氧物酶体proliferator-activated受体α; SCD1, stearoyl-coenzyme A desaturase 1; SREBP1, sterol regulatory element-binding transcription factor 1; TNF, tumor necrosis factor; XBP1, X-box binding protein 1.
2.5。免疫印迹分析
总肝蛋白质被隔绝冰冻组织里帕裂解缓冲和蛋白酶抑制剂。混合物在4°C离心10分钟,收集和上层的解决方案。蛋白质被量化后,等量的蛋白质被用于sds - page电泳,然后转移到PVDF膜(美国微孔)。膜被孵化的主要抗体GPRC6A(美国圣克鲁斯生物技术)在4°C隔夜后阻塞以5%的牛奶,然后用相应的辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体(细胞信号技术,美国)在室温1小时。蛋白质条被使用一个增强化学发光可视化工具包(美国通用电气医疗集团)和一个图像量化拉斯维加斯4000迷你凝胶扫描(美国通用电气医疗集团)。蛋白质的乐队是量化使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)和归一化ß肌动蛋白(英国Abcam)进行分析。
2.6。统计分析
所有数据都表示为平均值±标准平均误差(SEM),和分析进行SPSS 22.0版软件(SPSS Inc .)、美国)。T两组之间的测试进行,值在0.05双尾的统计学意义。
3所示。结果
3.1。骨钙素和GPRC6A的影响LKO对体重和空腹血糖
在实验的开始,我们证实GPRC6A是有条件地击倒在肝脏通过免疫印迹(图1(一))。在实验期间,体重监控每周和光纤光栅检测每两周。从8th到13th周和15th到16th周,WT: HFD + OCN组体重明显低于WT: HFD + NS组(所有 ,图1 (b))。之间没有明显差异,体重WT: HFD + NS组和GPRC6ALKO:HFD + NS组(所有 ),这表明体重没有明显受到GPRC6A吗LKO。也有在体重GPRC6A之间没有显著差异LKO:HFD + OCN组和WT: HFD + OCN集团所有 )。在12th和14th周,WT: HFD + OCN组光纤光栅水平明显低于WT: HFD + NS组(所有 )(图1 (c)),而没有治疗uncarboxylated骨钙素,GPRC6A之间没有明显差异LKO:HFD + NS组和WT: HFD + NS组。
(一)
(b)
(c)
每日uncarboxylated治疗16周后骨钙素或车辆,IPITT和IPGTT进行。正如预期的那样,GPRC6ALKO: HFD + OCN组糖耐量明显不如WT: HFD + OCN集团(数字2(一)和2(c)),尽管没有显著差异在胰岛素敏感性(数字2(b)和2(d))。这意味着GPRC6A发挥了关键作用在调节葡萄糖体内平衡。
(一)
(b)
(c)
(d)
WT HFD-induced肝脂肪变性是那么严重:HFD + OCN比在WT组:HFD + NS组建议uncarboxylated骨钙素治疗显著减毒HFD-induced肝脂肪变性(数字3(一),3(b),3(e),3(f)3(我))。HFD-induced NAFLD也更严重的病变GPRC6ALKO: HFD + OCN组比WT: HFD + OCN组(图3(b),3(d),3(f),3(h)和3(我)),这表明uncarboxylated骨钙素没有保护GPRC6ALKO老鼠从HFD-induced肝脂肪变性。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
3.2。外生骨钙素治疗基因表达改变HFD-Induced肝脂肪变性
我们下一个检查肝细胞如何GPRC6A失活调节HFD-induced肝脂肪变性的进展。肝基因表达的分析表明,合成的关键基因的mRNA水平(DGAT1 SCD1, SREBP1, CIDEA)明显降低,基因的mRNA水平参与脂类分解(ACOX1, PPARA、ACADM PPARGC1A)显著增加在WT: HFD + OCN集团与WT相比:HFD + NS组(所有 )。然而,SCD1 SREBP1, DGAT1, CIDEA明显高于PPARA, ACOX1, ACADM,和PPARGC1A GPRC6ALKO显著降低:HFD + OCN集团与WT相比:HFD + OCN集团所有 )。基因参与炎症(CCL12和TNF), ER应激(ATF6, XBP1, HSPA5)和糖质新生(G6PC)显示这三个组之间无显著差异(所有 )(图4)。在一起,这些结果说明GPRC6A需要减轻脂肪生成的激活和HFD-induced uncarboxylated骨钙素治疗肝脂肪变性。
4所示。讨论
在目前的研究中,一个条件GPRC6A肝脏特异性基因敲除小鼠模型被用来探索潜在的机制uncarboxylated骨钙素缓解非酒精性脂肪肝的能力。第一次,我们的研究结果发现,uncarboxylated骨钙素减轻非酒精性脂肪肝小鼠通过GPRC6A信号通路。GPRC6A的研究扩展了函数的谱,进一步增加了证据的概念,骨头和肝脏相互调节,并建议一些退化性疾病的发病机理的能量代谢可能比预期的更复杂。
骨骼本身就是不断破坏和再生骨重塑。持续的骨重建使骨架来说机关(23]。有人可能会质疑这个过程来说是值得的。近几十年来,骨重建和能量代谢之间的串扰已经认可,提供高能源消耗的合理性这一过程。骨钙素是最重要的激素之一,参与骨重建和能量代谢之间的串扰。骨钙素是一种骨基质蛋白。高调的能量代谢和骨钙蛋白之间的联系主要是基于uncarboxylated骨钙素的形式。Osteocalcin-deficient小鼠高血糖的和较低ß细胞质量和减少能量消耗11]。相比之下,治疗uncarboxylated骨钙素增加血清胰岛素水平和改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性24]。ESP是成骨细胞的基因表达和负调节骨钙素的uncarboxylation。ESP-deficient老鼠表现出减少肝脏中脂肪含量(11]。圣人等人发现uncarboxylated骨钙素能抑制非酒精性脂肪肝炎发展(13]。我们之前的研究还发现,骨钙素改善非酒精性脂肪肝通过激活Nrf2途径减轻氧化应激,抑制物途径(12]。
GPRC6A多个配体的受体,作为一个点的集成不同的细胞外信号在多个组织和细胞反应。GPRC6A广泛表达于大脑、肾、睾丸、胰腺、肝脏、脂肪组织等。25]。GPRC6A是公认的骨钙素的受体。我们目前所了解的组织功能很大程度上来自骨钙素的影响的分析治疗和老鼠基因研究[14]。通过GPRC6A增加胰腺癌Uncarboxylated骨钙素的行为ß细胞数量、胰岛素释放,和胰岛素敏感性19]。通过GPRC6A Uncarboxylated骨钙素诱发睾丸睾酮生产的(26),增加脂肪细胞中脂联素的表达通过GPRC6A [17]。然而,肝脏中GPRC6A是否参与骨钙素减轻非酒精性脂肪肝的潜在机制仍不清楚。在目前的研究中,我们构建了一个肝脏特异性GPRC6A基因敲除小鼠模型。GPRC6A HFD-induced肝脂肪变性LKO老鼠在WT老鼠比这更严重。uncarboxylated骨钙素治疗后,WT老鼠免受HFD-induced GPRC6A时非酒精性脂肪肝LKO老鼠仍然显示明显的肝脂肪变性。研究结果表明,在非酒精性脂肪肝GPRC6A起着关键的作用。我们的数据表明,GPRC6A介导反应uncarboxylated骨钙素治疗肝脏体内,主要通过增强脂类分解,减少脂肪生成。
非酒精性脂肪肝的特点是异位脂肪过多堆积在肝脏。的生物活性脂质合成和脂解作用揭示了致病性NAFLD的变化。SCD1病原反应酶的单一不饱和脂肪的合成。SREBP1脂肪合成的关键转录调节因子(27]。(DGAT1催化甘油三酯合成的最后一步28]。在生成脂滴CIDEA中扮演着重要的角色;因此,可以使用CIDEA作为脂质积累的敏感标记(29日]。所有这些基因参与脂质合成中表达下调uncarboxylated osteocalcin-treated WT老鼠和高度表达uncarboxylated osteocalcin-treated GPRC6ALKO老鼠。相反等脂类分解基因被发现ACOX1(催化氧化的支链脂肪酸)(30.),PPARA / PPARGC1A(促进脂肪酸氧化)31日],ACADM(催化氧化中链脂肪酸)(32]。上述结果表明,GPRC6A介导骨钙素在非酒精性脂肪肝的影响通过抑制脂质合成和促进脂类分解。先前的研究已经发现,GPRC6A直接作用于许多器官和激活相同的信号通路,包括ERK营地,PI3K / Akt / mTOR, AMPK途径(20.,21,33,34]。在肝脏,这些途径也可能调解的影响GPRC6A抑制脂质合成和促进脂类分解。除此之外,最近一项研究显示,骨钙素还可以控制脂肪吸收在小肠35]。还需要进一步的研究来阐明GPRC6A激活的潜在机制减轻非酒精性脂肪肝的肝脏。
5。结论
目前的研究提供了证据表明GPRC6A直接介导uncarboxylated骨钙素的影响在缓解HFD-induced非酒精性脂肪肝小鼠。小说本研究的发现扩展我们的知识GPRC6A在能量代谢中的作用,表明肝脏GPRC6A可能是一个潜在的目标治疗非酒精性脂肪肝。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
明亮,小民聂,Yeqing元贡献同样这项工作。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金项目(批准号31571212)。