文摘
睾丸激素生物合成主要发生在睾丸睾丸间质细胞。Nur77,孤儿核受体表达的促黄体激素/环腺苷酸(LH /营)信号通路,是一个关键的因素在睾丸间质细胞调节类固醇生成。Nur77调制通过交互的功能与其他蛋白质。FOXA3,对男性生育能力至关重要的转录因子,在睾丸间质细胞也表达了。在这里,我们试图阐明FOXA3在睾丸甾类产生的作用与Nur77通过专注于其交互。LH /营信号引起类固醇生成在睾丸间质细胞的发病,但压抑影响FOXA3的表达。过度的FOXA3 MA-10睾丸间质细胞压抑cAMP-induced表达Nur77和它的目标steroidogenic基因(明星,P450c17,Hsd3β)。此外,FOXA3抑制Nur77 transactivation steroidogenic基因的启动子。在小鼠原发性睾丸间质细胞,adenovirus-mediated过度FOXA3有相似的影响,导致睾酮生成减少。综上所述,这些结果显示的作用FOXA3 steroidogenic基因的调节睾丸间质细胞和睾丸微调类固醇生成。
1。介绍
睾丸间质细胞的睾丸产生激素和生长因子,是必不可少的发展和男性生殖系统的正常运行1,2]。关键的男性荷尔蒙睾丸激素,主要产生在睾丸,睾丸间质细胞和它的生产是由steroidogenic蛋白质,如明星,P450c17, HSD3B。在各种转录因子调节steroidogenic基因的表达,Nur77中起着重要作用[3,4]。促黄体激素(LH),类固醇生成的监管机构,诱发Nur77在睾丸间质细胞的表达5),进而调节steroidogenic基因的表达,如类固醇21-hydroxylase 20α-hydroxysteroid脱氢酶,P450c17 [3,6,7]。Nur77直接绑定定义的启动子区域的老鼠P450c17,鼠标明星,和人类HSD3B2和调节他们的表情3,4,8]。Nur77的表达和活动是通过控制调节其它细胞蛋白,如分子、DAX1、c-JUN,和核受体,如犯错γ基于“增大化现实”技术,GR, NOR1 [9- - - - - -12]。
成员forkhead盒(FOXA)亚科包括FOXA1, FOXA2, FOXA3主要以他们的角色在肝脏(13,14]。这些基因在哺乳动物的器官有多个角色发展(15]。在Foxa亚科的转录因子,只有Foxa3睾丸中表达,主要在睾丸间质和postmeiotic生殖细胞(16,17]。Foxa3突变小鼠显示睾丸发育异常、无法支持精子形成,表现出细胞凋亡增加生殖上皮(16]。FOXA3最丰富的表达在成人睾丸间质细胞的细胞核和一定程度上在一些滋养和小管细胞(18]。FOXA3调节血小板源生长因子受体的表达α(PDGFR-α在睾丸间质细胞(18]。然而FOXA3的功能,与男性生育能力相关的一个重要的转录因子,在睾丸睾丸间质细胞是知之甚少。
在当前的研究中,我们发现与Nur77表达式,表达式Foxa3压抑在cAMP-induced类固醇生成睾丸间质细胞。这使我们调查的影响FOXA3 Nur77表达式和transactivation睾丸甾类产生。FOXA3直接压制cAMP-induced Nur77的表达,抑制Nur77-mediated transactivation steroidogenic目标基因在睾丸间质细胞。steroidogenic基因的镇压导致减产的睾丸激素。总之,这些结果表明FOXA3睾丸甾类产生的调节效应。
2。材料和方法
2.1。动物
C57BL / 6小鼠(6)从商业供应商购买(Dae-han实验室、大田、韩国)和保持在12:12 h与食物和水随意光暗周期。老鼠被公司牺牲2窒息后,他们的睾丸解剖。动物治疗根据美国国立卫生研究院的道德标准。所有动物程序批准的机构动物保健和使用委员会(AICUC) Chonnam国立大学(许可证号码:2012 - 44)。
2.2。质粒和化学品
pcDNA-Nur77,记者质粒Nur77启动子(413 /−−34)卢克,NurRE-luc,鼠标明星(−1533 / + 34)luc鼠标P450c17卢克(−1040 / + 3),鼠标3βhsd(−4700 / + 40)卢克和CRE-luc前面描述的(5,9]。pcDNA3 -Foxa3只和adenoviral(广告)向量编码绿色荧光蛋白(仅广告)和GFPFoxa3(广告-Foxa3)一直在前面描述的19]。从Sigma-Aldrich 8 br-camp购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。
2.3。细胞培养、瞬时转染和荧光素酶检测
MA-10细胞(Mario阿斯科利博士的礼物;美国爱荷华大学,IA) [20.)保持在罗斯威尔公园纪念研究所1640 (RPMI 1640)介质(美国UT Hyclone),补充25 mМ玫瑰,2 mМ谷酰胺、15%马血清和抗生素。所有细胞培养在37°C下5%公司的氛围2。荧光素酶测定,MA-10细胞被镀在媒体含有5% charcoal-stripped血清前24小时转染和表达载体,转染报告基因,控制lacZ表达质粒,埃因霍温-β加(美国WI Promega公司)。转染是使用Lipofectamine执行2000(美国生命技术公司,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。转染DNA的总量是通过添加pcDNA3空向量保持不变。荧光素酶和β牛乳糖活动是化验如前所述[21]。48小时后,细胞收获和细胞溶解细胞裂解缓冲(0.2М三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0)液和0.1% Triton x - 100)。细胞溶解产物被用来测量荧光素酶的活动。荧光素酶活动规范化lacZ表达式。
2.4。隔离原发性睾丸间质细胞
主要小鼠睾丸间质细胞分离如前所述[10]。简而言之,无荚膜的睾丸细胞分散胶原酶类型І(0.25毫克/毫升,生命技术公司,大岛,纽约,美国)M199 / ebs的媒介。睾丸细胞维持在25°C的20分钟轻柔摇晃,每5分钟驱散了睾丸小管。中包含的细胞收集和过滤40μm细胞过滤器(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。收集到的细胞被洗两次离心M199 / ebs介质和颗粒状。最后,这些细胞被镀RPMI 1640中(包含25毫米玫瑰)补充15%马血清和抗生素。
2.5。放射免疫检定法(RIA)
测量睾丸激素水平,无血清培养基收集主要小鼠睾丸间质细胞的感染仅广告或Ad-FOXA3对待营地48 h。介质被离心分离在10000 g×5分钟在4°C和储存在−70°C到睾丸激素测定。睾酮浓度测量使用RIA (22]。interassay和intraassay系数睾酮的变化估计分别为8.7%和9.3%,分别为(23]。
2.6。定量实时聚合酶链反应(存在)
与2逆转录反应进行μ使用M-MLV g的总RNA逆转录酶(WI Promega,麦迪逊,美国)。定量PCR进行与TOPreal qPCR 2 x预混料、SYBR绿色高火箭(Enzynomics、大田、韩国)使用StepOnePlusTM实时PCR系统(应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。基因的引物序列补充表中列出1。
2.7。统计分析
识别显著差异,数据分析使用图垫Prism 5.0版。单比较两组实验进行使用未配对的学生的t以及。数据的均值±SEM至少有三个独立的实验。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。减少的表达Foxa3信使rna在cAMP-Induced MA-10睾丸间质细胞
睾丸间质细胞开始类固醇生成后通过表达steroidogenic基因信号感应LH /营地。调查FOXA3 LH /营信号的响应能力,我们刺激MA-10细胞与营不同时期的表达和比较Nur77。的表达Foxa3压抑在2 h,进一步抑制4 h,然后恢复6 h点营刺激(图1(一))。相比之下,Nur77表达强烈诱导2 h,之后下降(图1 (b))。
(一)
(b)
3.2。FOXA3压制cAMP-Induced Steroidogenic Nur77及其目标基因的启动子活动
相反的表达模式Foxa3和Nur77在营地刺激2 h和4 h MA-10睾丸间质细胞(图1)让我们调查的影响FOXA3 Nur77子活动使用瞬时转染。我们发现cAMP-induced Nur77子活动被FOXA3压抑过度MA-10细胞(图所示2(一个))。包含Nur77响应的子元素(NurRE-Luc)也被压抑的剂量依赖性的方式由FOXA3(图2 (b))。正如所料,Nur77目标steroidogenic基因启动子包括明星,P450c17 3βhsd剂量依赖性的方式被FOXA3紧(图2 (c))。综上所述,FOXA3抑制cAMP-induced Nur77及其目标steroidogenic基因启动子的活性。
(一)
(b)
(c)
3.3。FOXA3抑制分子的Transactivation,调节Nur77子活动
我们调查的影响FOXA3 transactivation的分子,调节Nur77表达式在营地诱导睾丸间质细胞(24),使用CRE-Luc记者。FOXA3抑制cAMP-activated转录分子活动方式存在剂量依赖的相关性,压抑的表达CRE-Luc(图3(一个))。此外,过度FOXA3减少分子表达式在MA-10细胞(图3 (b))。这些结果表明FOXA3压制cAMP-induced Nur77通过抑制启动子转录活性和分子表达。
(一)
(b)
3.4。FOXA3会使的表达Nur77和它的目标Steroidogenic基因
超表达Nur77 FOXA3会使子活动。因此,我们调查的表达Nur77和它的目标steroidogenic MA-10营地诱导后细胞的基因。符合压抑启动子活动中发现promoter-reporter化验,mRNA的表达Nur77和它的目标包括steroidogenic基因明星,P450c17,Hsd3b都是压抑过度后FOXA3(图4)。
3.5。FOXA3抑制Nur77-Mediated Transactivation Steroidogenic基因的启动子
FOXA3压制Nur77的表达,从而抑制其steroidogenic目标基因的表达(图4)。然而,我们不能排除这种可能性,FOXA3直接干扰Nur77-mediated transactivation目标基因。评估这个问题,我们进行了荧光素酶记者化验使用目标基因的启动子和外生Nur77表达式。所有目标启动子包括Nur-RE-luc StAR-luc, P450c17-luc 3β-HSD-luc强烈压抑过度后FOXA3(图5),这表明FOXA3抑制Nur77 transactivation。镇压Nur77 transactivation可能通过直接或间接的互动与Nur77 FOXA3。
3.6。FOXA3压制的表达Nur77和它的目标主要Steroidogenic基因在小鼠睾丸间质细胞
FOXA3压制Nur77启动子的活动,因此其目标基因的启动子(图2)。此外,FOXA3压制的transactivation Nur77(图5),导致双重压迫影响Nur77目标推动者。确认FOXA3在睾丸睾丸间质细胞的作用,我们孤立主要从成年小鼠睾丸间质细胞,用FOXA3-expressing感染腺病毒(Ad-FOXA3),并分析了影响FOXA3内生steroidogenic基因的表达。符合promoter-reporter化验的结果在MA-10细胞的表达Nur77和steroidogenic基因包括明星和Hsd3b相比明显减少,细胞中只有GFP-expressing病毒感染(Ad-GFP)(图6(一))。这些结果表明,FOXA3压制steroidogenic基因的表达在睾丸间质细胞减少Nur77的表达和抑制Nur77 transactivation。
(一)
(b)
3.7。FOXA3调节类固醇生成睾丸睾丸间质细胞
镇压steroidogenic基因表达的FOXA3促使我们评估FOXA3对睾酮的产生主要的影响睾丸间质细胞。我们感染主要与Ad-FOXA3或Ad-GFP睾丸间质细胞控制。刺激后的细胞与营48 h,媒体收集和睾丸激素水平进行了分析。有显著减少睾丸激素的水平后Ad-FOXA3感染Ad-GFP相比控制感染(图6 (b))。在一起,这些结果表明,FOXA3调节睾丸甾类产生通过控制Nur77-induced steroidogenic基因的表达在睾丸间质细胞。
4所示。讨论
睾丸激素在睾丸间质细胞的生产是积极的还是消极的监管由几个信号通路和转录因子25,26]。其中,LH /营刺激睾丸甾类产生的主要监管途径,它迅速引发Nur77的表达上调steroid-producing基因的表达(5]。在这项研究中,我们调查的作用Foxa3,唯一的成员Foxa睾丸中表达的亚科。Foxa3产后天6和70之间的信使rna表达在睾丸发育(16]。其睾丸间质细胞中表达的主要生理重要性相比,精子没有观察组织学差异的精子在精子形成的第一波Foxa3零的老鼠。
在我们的研究中,镇压Foxa3在Nur77 cAMP-induced表达式MA-10睾丸间质细胞表明steroidogenic过程中其压抑的角色。这是减少所反映的Nur77及其目标steroidogenic基因启动子,营地感应后,当FOXA3过表达。是一个关键的转录因子分子,会调节许多基因的表达,包括Nur77在细胞发育和分化(27,28]。steroidogenic基因的表达减少过度后FOXA3可能是由于抑制transactivation分子的表达。事实上,以前的研究显示,FOXA结合位点的存在在启动子CRE站点附近干扰绑定和低分子CRE活动(29日]。然而,我们没有发现任何FOXA结合位点接近CRE Nur77启动子。然而,相似的序列在附近被发现,尽管这些序列略不同于规范FOXA绑定序列公布之前。
Garon等人报道的规定PDGFR -α启动子的FOXA3 MLTC-1睾丸间质细胞行通过直接绑定到其近端识别网站(26]。尽管他们不关注steroidogenic基因表达的调控在他们的研究中,他们报告说,与PDGFR -α子,FOXA3过度倾向于抑制启动子活性基因表达在睾丸间质细胞,包括一些steroidogenic基因等mCyp11a1,mStar,mHsd3b1(18]。在目前的研究中,我们的结果表明,steroidogenic基因的表达被压抑的通过抑制FOXA3 Nur77表达式和transactivation。然而,我们不排除PDGFR FOXA3-induced表达式——的可能性αMA-10细胞及其部分贡献steroidogenic基因的镇压。
原发性睾丸间质细胞感染腺病毒表达FOXA3 MA-10细胞系表现出类似的结果。此外,这种FOXA3-mediated镇压steroidogenic基因翻译成睾丸激素水平的降低。因为睾酮是男性生殖的重要激素,故障或改变的表达FOXA3可能影响男性生育能力。降低男性生育能力已经被报道Foxa3突变小鼠之间交配时3和8个月大的时候16]。
5。结论
我们的研究结果表明压制性的函数Foxa3在LH / cAMP-induced表达Nur77 Nur77-mediated睾丸甾类产生睾丸间质细胞,导致睾丸激素水平的降低。因此,我们假设FOXA3函数作为维持睾丸激素的平衡调制器通过微调steroidogenic基因的表达。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Hansle金正日和Sudeep Kumar的贡献同样这项工作。
确认
作者感谢马里奥博士阿斯科利(爱荷华大学)请提供MA-10小鼠睾丸间质细胞。这项研究受到了基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部、科学技术(NRF - 2017 r1a2b4006166和联盟- 2020 r1a2c1006705)。
补充材料
补充表1。用于定量PCR基因特定的寡聚物的列表。(补充材料)