醛固酮增多症相关的生物信息学分析差异表达基因的腺瘤和验证

文摘

目的。先前的研究已经研究醛固酮生产过剩的转录调节醛固酮增多症相关的腺瘤(APAs)。我们旨在系统地研究与分子机制相关的基因和通路APA的表达谱的生物信息学分析和实验验证。方法。本研究进行了基于三个基因表达谱(GSE64957, GSE8514, GSE60042)。差异表达基因(度)的调查,函数和通路富集分析,蛋白质相互作用(PPI)网络分析被执行的生物信息学分析。与定量PCR验证,组织从11患者所患肾上腺腺瘤与APA (NFA)和13是包含在我们的队列。结果。在这项研究中,生物信息学分析和182年调节和88度使之抑制。正如所料,所涉及的调节度主要是钙离子稳态(= 2.00 x10⁻⁴)。在KEGG通路分析,钙信号通路(= 4.38 x10⁻⁶)和醛固酮合成和分泌(= 8.73 x10⁻⁶丰富。此外,执行定量PCR检测7调节基因的表达(PCP4、ATP2A3 CYP11B2, CLCN5, HTR4, VDR,和AQP2)度的交集。的mRNA水平CYP11B2、HTR4 AQP2显著增加在APA样品相比,NFA(24.420折的NFA,< 0.001;3.753折的NFA,= 0.002;和11.487 NFA的折叠,= 0.018)。结论。总之,目前的研究显示几个候选基因高表达的生物信息学分析和我们的队列。度也被浓缩在醛固酮合成和分泌和钙信号通路。

1。介绍

原发性醛固酮增多症(PA)是最常见的内分泌高血压患病率的5 - 20%患者的高血压和过度生产的特点是醛固酮(1,2]。PA主要是由醛固酮增多症相关的腺瘤(APA)或双边肾上腺增生(呸)[3]。

在过去的十年里,一些研究调查了基因表达谱APAs相比正常肾上腺或相邻的肾上腺皮质醛固酮生产过剩的识别转录调节的目的4,5]。全基因组表达(芯片)和RNA-sequencing分析(RNA-Seq)在基因表达的检测已属司空见惯APA (6,7]。许多基因,包括编码steroidogenic酶如CYP11B2 CYP11B1, CYP21A1, CYP11A1, CYP17A, HSD3B2,一些基因参与钙信号或内质网钙存储如CALM2 CALR, CAMK-I,和几个G-protein-coupled促性腺激素受体如受体,LH,加压素,血清素,已确定在先前的研究中差异表达APAs和肾上腺皮质5,8]。

在目前的研究中,生物信息学分析和实验验证的表达谱APAs与控制进行了研究。工作流图在图给出1。首先,生物信息学分析基于几个基因表达谱。差异表达基因(度)的调查,函数和通路富集分析,蛋白质相互作用(PPI)网络进行分析。我们旨在系统地调查潜在的与疾病进展相关基因和通路,这可能有助于阐明APA背后的分子机制。此外,数度从数据库被证实在我们组有13组织样本来自APA和11所患肾上腺腺瘤(NFA)。

2。材料和方法

2.1。数据资源

基因表达谱数据(加入。GSE64957、GSE8514 GSE60042)从基因表达综合下载(GEO)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。GSE64957和GSE8514数据集生产GPL570 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix人类基因组U133 + 2.0阵列平台,和GSE60042是GPL14550安捷伦- 028004 SurePrint G3人类通用电气8×60 K微阵列平台。共有47个组织样本APA患者和39他们邻近正常组织样本肾上腺(亚美大陆煤层气有限公司)是包含在这些数据集。

2.2。数据预处理和微分表达式分析

度从GEO数据库获得了一种GEO2R分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)。adj。< 0.05和| logFC | > 1.0被设置为度截止准则。

十字路口度这三个数据集,其中任意两个进一步考虑仔细,和所有的度由这些数据集是用于富集分析。

2.3。基因本体论和通路富集度的分析

数据库的注释,可视化和综合发现(大卫,http://david.abcc.ncifcrf.gov/)促进了从数据收集生物分析的转变。基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)通路富集分析由KEGG Orthology注释系统(KOBAS)在线工具(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/anno_iden.php)。< 0.01被设置为截止准则。

2.4。(PPI)蛋白质相互作用网络和集成模块的选择

PPI网络识别潜在的度之间的相互作用,构建了基于蛋白质度之间的相互作用。每个节点的分数是由学位中心,在增加分数显示在网络中更重要的位置。检索的搜索工具相互作用基因(字符串,http://string.embl.de/)数据库是用于构造PPI网络为度。预测的网络视图总结了网络协会为特定组蛋白。网络节点是蛋白质,边代表预测功能关联。截止信心指数为标准设置为> 0.7。随后,结果可视化使用Cytoscape软件。之前它已经证明了基因相同的模块在PPI网络服务类似的角色和涉及相同的生物功能。子是探索与相似度函数,获得途径有关。进一步确认了PPI网络的子模块使用MCODE工具使用以下参数:学位截止= 2,节点评分截止= 0.2,k生水起= 2,马克斯。深度= 100。每个模块的富集分析进一步由KOBAS在线。

2.5。主题和组织在我们的队列

组织与APA NFA患者从11和13是包括在内。临床和病理诊断是根据既定标准(3,9]。NFA患者血压正常,没有激素过剩的迹象或症状,正常血清钾(K +)水平,并显示正常的低剂量的地塞米松治疗后血清皮质醇抑制。我们只包括那些病人发现是偶然的。APA有高血压和低钾血症,患者都是诊断的基础上,升高血浆醛固酮浓度,抑制血浆肾素活性和计算机轴向断层。所有的APA体细胞KCNJ5突变的患者发现通过测序和阳性染色CYP11B2免疫组织化学(包含IHC)。肿瘤组织样本得到从单侧肾上腺切除术和临时使用液态氮冷冻和储存在−80°C到使用。研究了伦理道德委员会批准北京协和医科大学医院。书面知情同意了所有的病人。

2.6。RNA提取和实时定量PCR (RT-qPCR)

总RNA提取使用试剂盒RNeasy迷你包(74104、试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的协议。的质量和数量用nd - 2000分光光度法测定总RNA (NanoDrop技术,威明顿、德、美国)。合成第一链cDNA从1µ总RNA的g使用PrimeScript RT (PK0446,豆类、Kusatsu、日本)和低聚糖(dT)引物。目标基因包括PCP4、ATP2A3 CYP11B2, CLCN5, HTR4, VDR,通过生物信息学分析和AQP2确定以上,双链DNA染色,SYBR-Green,使用10µl SYBR-Green PCR主混合(PK0445,豆类、Kusatsu、日本)和100 nmol每个引物。PCR进行使用ABI 7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)总量的20倍µl /反应后反应参数推荐的制造商。所有的反应都是一式三份。给出了补充使用的引物1。RT-qPCR进行分析不同基因的mRNA表达的组织从不同的群体。相对定量分析了基因表达与2 ^^−ΔΔCt方法使用GAPDH作为内部控制。结果表示为目标/内部标准每个样品的浓度比。

2.7。统计分析

通常和非正态的分布提出了连续变量均值±SD和中位数(四分位范围),分别。独立的t测试和非参数测试(Mann-Whitney测试)和IBM SPSS 22.0统计软件被用来评估差异APA和NFA病人的临床特点。的褶皱变化qPCR APA和NFA样本之间的数据转换为对数,和非参数的差异进行了分析测试。值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。度在APA样本与控制亚美大陆煤层气有限公司样本

大量数据被包含在基因表达谱,分析了原始数据和过滤。共有182个调节和88度使之抑制被GEO2R分析确定。十字路口度的三个数据集包括6基因,PCP4, ATP2A3, PPP4R4, CTNND2 CYP11B2, CLRN1。更多的基因包括IL17D EDA2R、RAB3C SCRN1, CLCN5, MTMR4, ABCB4, HTR4, QPCT, 2英镑,NETO2, VDR, CBR1, ADAM23 FAM19A4, AQP2覆盖在任何两个数据集。维恩图显示了相交度图2。

3.2。度的功能富集分析

为了进一步阐明度的角色,功能和KEGG通路富集分析。正如所料,所涉及的调节度主要是钙离子稳态(:0055074,n= 3,= 2.00 x10⁻⁴)。同时,也丰富了调节心脏传导(去:1903779),树突(去:0030425),突触(去:0045202),和寡糖代谢过程(去:0009311)。KEGG途径分析、钙信号通路(hsa04020,n= 8,= 4.38 x10⁻⁶、补充2(我)是第一位和醛固酮合成和分泌(hsa04925,n= 6,= 8.73 x10⁻⁶、补充2(我)是第二个。调节度浓缩的详细信息如表所示1。至于表达下调度,最常见的丰富功能蛋白质绑定(:0005515),细胞外空间(去:0005615),collagen-containing细胞外基质(去:0062023),细胞外区域(去:0005576)和细胞外的外来体(去:0070062)。同时,下调KEGG通路富集度的癌症(hsa05200)和蛋白聚糖(hsa05205)。表达下调度浓缩的详细信息如表所示2。

3.3。从度PPI网络建设

度被进一步分析使用字符串数据库构建PPI网络,和一般的PPI网络的270度如图3。有182个节点,285边的平均节点度为3.13构建网络。此外,所构造的PPI网络出口到Cytoscape软件和受子模块使用MCODE PPI网络建设的工具。所示的补充3模块1 ((Ia), 2 (Ib)模块,和(Ic)模块3),三个子MCODE得分大于4.0从构造识别PPI网络。有5节点和9交互模块1、15节点和31交互模块2和9节点和14交互模块3。在模块3中,度主要是参与积极调节胞质钙离子浓度(:0007204,n= 3,= 1.45 x10⁻⁶),包括PTGFR、CCKBR TACR1基因。KEGG通路中的分析模块3、钙信号通路(hsa04020,n= 4,= 7.60 x10⁻⁸)与PTGFR CCKBR、HTR2B TACR1基因首先丰富了。模块3的详细信息浓缩分析补充所示3(II)。其他模块(模块1和2)没有丰富的成功由于一些节点。

3.4。临床表现的研究参与者

十三APA确诊患者(年龄:27 - 69年)和11 NFA(对照组)患者招募在这项研究中,它是用来证实的mRNA表达几个RT-qPCR度。在补充这些患者的临床特点进行了总结4。收缩压(SBP)、舒张压(菲律宾)和醛固酮APA集团都高,等离子体K +, PRA,肿瘤大小低于NFA组。上述临床表现上的聚类结果表明,这两个组织是显而易见的,它适用于后续RT-qPCR分析。

3.5。信使rna表达的几个RT-qPCR度

确认生物信息学分析的结果,执行RT-qPCR检测7调节基因的mRNA表达(PCP4、ATP2A3 CYP11B2, CLCN5, HTR4, VDR,和AQP2)度的交集,这与醛固酮合成和分泌和钙信号调控(被上述7个基因及其编码的蛋白质生物功能补充所示5)。著名调节的mRNA水平CYP11B2基因,也积极的在我们的测试组(24.420折的NFA,< 0.001)。而且,HTR4和AQP2显著增加在APA样品相比,NFA(3.753折的NFA,NFA = 0.002和11.487折,= 0.018)。褶皱的变化,p值的所有7基因,和盒子块3调节基因RT-qPCR如表所示3和图4。

4所示。讨论

在这项研究中,生物信息学分析和182年调节和88度使之抑制。正如所料,钙信号通路的调节度是丰富和醛固酮合成和分泌。十字路口度不同的地理数据库,也与上面的途径,包括PCP4 ATP2A3, CYP11B2, CLCN5, HTR4,船舶,AQP2。HTR4,此外,CYP11B2的mRNA水平和AQP2显著增加13 APA样品相比11 NFA样品从我们的队列,证实这些基因的高表达和APA的发生和发展的重要作用。

本研究首次探讨APA的潜在机制通过生物信息学分析的方法。综合考虑APA许多关于表达谱研究的最终结果的可靠性提高。度的功能富集分析,我们进一步证实了APA和调控通路之间的关系,包括醛固酮的合成与分泌,钙信号通路,G-protein-coupled受体信号通路,信号通路,积极调节胞质钙离子浓度,和调节心脏传导,与先前的研究一致的APA转录组配置文件(7,10,11]。此外,一些调节通路,如低聚糖的代谢过程中,应对肌肉伸展,神经发生(树突和突触)中的刺激神经组织的互动,积极调节转录(dna模板)和dna结合转录激活活动(RNA聚合酶II-specific)富含APA样本,首次被发现。至于表达下调度,我们发现癌症的途径在这些数据集丰富。可能的原因之一APA增长和扩散的速度较慢,比NFA较小的肿瘤大小。

有22个基因是高度对APA表示从至少两个地理数据库的生物信息学分析。其中最著名的是CYP11B2基因,编码醛固酮合酶和催化去氧皮质酮的多步反应生成醛固酮。CYP11B2被认为是醛固酮合成的一个标志和普遍认为调节在APA表达式。除此之外,其他三个度,PCP4 HTR4,和VDR,也被报道参与APA(的发生和发展12- - - - - -14),其中,验证了调节表达HTR4 qPCR在这项研究中。HTR4是5 -羟色胺受体亚型表达在肾上腺和5 -羟色胺受体可以增加醛固酮分泌体内和体外15- - - - - -17]。此外,其他几个度相关的钙信号通路和醛固酮分泌没有被报道参与APAs的进展,如ATP2A3 CLCN5, AQP2。在这项研究中,我们发现他们在APA首先高度表达。同样,只有最后一个,AQP2,验证了我们的队列。AQP2是抗利尿激素敏感的水通道蛋白。最近的研究表示,抗利尿激素和受体的结合会导致瞬态增加细胞内钙(18,19),醛固酮分泌增加。这一现象的调节表达AQP2 APAs被其他研究人员还发现没有详细说明(8,20.]。然而,妞妞等人发现AQP2表示所有的肾上腺髓样肿瘤,但不是在肾上腺皮质肿瘤,这反映了维护的水代谢在肿瘤发生[通过AQP221]。因此,基因是否发生相关APAs还有待进一步研究。

也许由于样本的局限性和选择组织的特异性,其他基因的高表达是没有证实在我们群,还需要进一步的研究来证实相关通路的基因表达。在这项研究中,我们做了NFA组织作为对照组APAs,用于讨论的分泌功能和相关的mRNA的表达。然而,亚美大陆煤层气有限公司组织被广泛应用为正常控制在先前的研究和地理数据集。虽然减少了社会团体内部的差异在某种程度上,这是不容易获得的亚美大陆煤层气有限公司样品单球状带肾上腺准确。细胞在不同的地区可能会有不同的类固醇激素表达谱。

我们的研究应该承认一些局限性。首先,微阵列数据包括从NCBI生成网站(16,22,23]。除了qPCR几个重要基因的mRNA表达的验证,还需要其他的实验来确认他们对APA的影响。第二,三个地理数据库所有亚美大陆煤层气有限公司作为控制探索转录的差异。在这项研究中,我们招募患者NFA控制。可能的原因之一的一些基因的表达没有显示upregulation当我们在数据库中找到。

5。结论

总之,目前的研究显示候选基因高表达,其中部分验证了在我们的群体中,可能参与了APA的发生和发展。此外,所有的度都浓缩在醛固酮合成和分泌和钙信号通路。然而,未来的研究是必要的,以确定的详细分子机制APA超过生物信息学分析。

数据可用性

所有的数据和材料已经包含在公共数据库和表,数据,本文的补充材料。

信息披露

这篇文章曾发表的预印(https://www.researchsquare.com/article/rs-466199/v1)[24]。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为潜在的利益冲突。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(批准号81770427和81770427)和凸轮创新医学科学基金(批准号2017 - i2m - 1 - 001)。

补充材料

补充1。用于实时rt - pcr引物。补充2。KEGG分析的路径的图。补充3。蛋白质相互作用网络的子模块和浓缩的分析模块3。补充4。NFA患者临床特点11和13 APA患者。补充5。由七个基因编码的蛋白质度及其生物功能。(补充材料)

引用

1. s . Monticone j . Burrello d Tizzani et al .,“患病率和原发性醛固酮增多症临床表现中遇到初级护理实践中,“美国心脏病学会杂志》上,卷69,不。14日,第1820 - 1811页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. g·p·罗西,g .贝尔尼尼Caliumi et al .,”一个前瞻性研究原发性醛固酮增多症的患病率在1125年高血压患者,”美国心脏病学会杂志》上,48卷,不。11日,第2300 - 2293页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. j . w .资助者,r·m·凯里Fardella et al .,“病例发现、诊断、治疗前和治疗原发性醛固酮增多症:一个内分泌学会临床实践指南,”临床内分泌学与代谢杂志》上,卷93,不。9日,第3281 - 3266页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. s . Monticone t, p . Mulatero t·a·威廉姆斯和w·e·雷尼,“了解原发性醛固酮增多症:下一代测序和表达的影响分析”分子和细胞内分泌学卷,399年,第320 - 311页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. e . t . Aristizabal普拉达,即可以见到效果,大肠Sušnik et al .,“比较基因组学和转录组分析在原发性醛固酮增多症”,国际分子科学杂志》上,19卷,不。4、2018。视图:谷歌学术搜索
6. m·h·巴b·梅休k·拉赫曼et al .,“表达谱steroidogenic酶在肾上腺皮质疾病。”临床内分泌学与代谢杂志》上,卷90,不。9日,第5455 - 5446页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. c, c .赵z . Zhang et al .,“在肾上腺原发性醛固酮增多症转录组分析和控制,”国际临床与实验病理学杂志》上,10卷,不。9日,第10018 - 10009页,2017年。视图:谷歌学术搜索
8. 佐藤晴t . Wang f r·森本晃司et al .,“基因表达谱在醛固酮增多症相关的腺瘤和相邻的肾上腺,”欧洲内分泌学杂志,卷164,不。4、613 - 619年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. t·a·威廉姆斯,c, e . Gomez-Sanchez w·e·雷尼et al .,“国际组织病理学共识单方面原发性醛固酮增多症,”临床内分泌学与代谢杂志》上,卷106,不。1,42-54,2021页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. g . Assié, c . Auzan人类。Gasc et al .,“类固醇生成醛固酮增多症相关的腺瘤重转录组分析,“临床内分泌学与代谢杂志》上,卷90,不。12日,第6649 - 6638页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. n . El格拉耶布,即Bourdeau Lacroix,“ACTH和其他激素的作用在原发性醛固酮增多症的醛固酮生产的规定,“内分泌学前沿,7卷,p。72年,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. j·g .这个f . Li Chen等人“Upregulation PCP4的醛固酮增多症相关的腺瘤培养人类通过AKT肾上腺皮质肿瘤细胞生长,AMPK途径,”国际临床与实验病理学杂志》上,11卷,不。3、1197 - 1207年,2018页。视图:谷歌学术搜索
13. k . Itcho k .冲电气k Kobuke et al .,“异常G受体蛋白质表达与DNA甲基化在醛固酮增多症相关的腺瘤,”分子和细胞内分泌学卷,461年,第104 - 100页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. 高x, y山崎,y手冢et al .,“醛固酮之间的串扰和钙代谢在原发性醛固酮增多症:一个可能的钙metabolism-associated异常“肿瘤”在肾上腺类固醇生成”,类固醇生物化学和分子生物学》杂志上文章ID 105434卷,193年,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. c . Duparc c·安德烈·j·Menard et al .,“赖氨酸作为一种5 -羟色胺4受体拮抗剂,以抵消体外和体内血清素激活的特工在醛固酮分泌的刺激效果的人,”激素和代谢研究卷,49号4、269 - 275年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. p, b . Mariniello f . Mantero h .柴田和w·e·雷尼,“G-protein-coupled受体在醛固酮增多症相关的腺瘤:高醛甾酮症的潜在原因,“内分泌学杂志》,卷195,不。1,39-48,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. o . Zwermann y Suttmann, m . Bidlingmaier f·贝希和m . Reincke”筛查原发性醛固酮增多症膜激素受体的表达情况,”欧洲内分泌学杂志,卷160,不。3、443 - 451年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. g . Tamma a . Di协定,m .拉涅利et al .,“V2受体拮抗剂tolvaptan提出了胞质钙和防止AQP2贩运和功能:体外和体内评价,“细胞和分子医学杂志》上,21卷,不。9日,第1780 - 1767页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. m·拉涅利a . Di协定g . Tamma g·瓦伦蒂,“钙敏感受体产生负面的监管行动向vasopressin-induced aquaporin-2表达和贩卖肾集合管,”维生素和激素卷,112年,第310 - 289页,2020年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. e·a·b·Azizan b . y . h . Lam s·j·纽豪斯et al .,“微阵列、qPCR andKCNJ5Sequencing醛固酮增多症相关的腺瘤揭示基因型和表型差异的球状带和带fasciculata-like肿瘤,”临床内分泌学与代谢杂志》上,卷97,不。5,E819-E829, 2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. d .牛y呗,问:姚明,l .周x,和c .赵”AQP2作为诊断为嗜铬细胞瘤和副神经节瘤免疫组织化学标记,”腺手术,9卷,不。2、200 - 208年,2020页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. s . g .公司j .周b Lam g·s·h·杨·e·a·b·Azizan和m . j .布朗,“转录组醛固酮增多症相关的人体组织病理和生理途径分析,“高血压,卷68,不。6,1424 - 1431年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. m .村上t . Yoshimoto k Nakabayashi et al .,“集成的转录组和methylome醛固酮增多症相关的腺瘤,分析”欧洲内分泌学杂志,卷173,不。2、185 - 195年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 王y高,x, h . et al .,“醛固酮增多症相关的生物信息学分析差异表达基因的腺瘤和验证,”2021年,预印本。视图:谷歌学术搜索

版权

版权©2021 Yinjie高等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。