的影响石斛兰多糖在人类皮肤成纤维细胞的功能和表达矩阵Metalloproteinase-2 High-Glucose条件下

文摘

的影响石斛兰多糖(PDC)在人类皮肤成纤维细胞的功能(hsf)和表达矩阵metalloproteinase-2 high-glucose条件下和探索潜在的机制尚不清楚。5-dimethylthiazol-2-yl我们使用了3 - (4)2,5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)分析和流式细胞术对细胞生存能力和细胞凋亡。的胶原蛋白水平测定Sircol™胶原蛋白测定。实时定量聚合酶链反应(rt - pcr)是用于检测矩阵的表达metalloproteinase-2 (MMP-2)和基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP-2) mRNA。我们发现如下:(1)在high-glucose条件下,HSF细胞生存能力,TIMP-2 mRNA的表达,和胶原含量减少,而细胞凋亡率和MMP-2 mRNA的表达增加( )。(2)high-glucose + PDC组,PDC逆转胶原蛋白水平的变化,生存能力,造成的HSF细胞和细胞凋亡率高葡萄糖,蛋白质和TIMP-2 mRNA的表达增加,MMP-2 mRNA水平下降( )。这是第一次试图表明PDC可以在HSF high-glucose条件下表现出保护作用,这可能是相关的upregulation TIMP-2表达和抑制MMP-2表达式。

1。介绍

糖尿病患者的皮肤是容易受到伤害和受伤后不容易愈合。糖尿病皮肤病变与糖尿病血管疾病,神经病变,细胞功能障碍,和细胞因子分泌异常;然而,其形成的具体机制仍然未知的(1,2]。因此,评估分子机制导致糖尿病皮肤溃疡的发展和确定适当的干预措施是十分重要的意义,这种情况的诊断和有效治疗。人类皮肤成纤维细胞(hsf)是一种修复细胞真皮和温和的组织代谢起着重要的作用。这种类型的细胞也分泌胶原蛋白以及noncollagen组件,如外矩阵,在伤口愈合发挥重要作用[3,4]。此外,他们是重要的在维持细胞弹性,培养水,并支持表皮细胞(5- - - - - -8]。已经确定,成纤维细胞是至关重要的效应细胞的过程与糖尿病皮肤病变和参与整个伤口修复过程。这些细胞的生物学特性的变化是糖尿病皮肤病变的发展的基础。值得注意的是成纤维细胞的数量和活动的减少也是原因之一的合成胶原蛋白(9,10]。很多深入的研究表明,皮肤成纤维细胞的数量和活力在糖尿病皮肤损伤和治疗也很重要11,12]。石斛兰多糖,也称为多糖石斛兰candidum(PDC),是主要的生物活性物质石斛兰candidum。以前的研究证实,PDC可以抑制胰岛细胞凋亡和坏死,保护胰岛细胞,预防糖尿病。此外,他们还可以防止钙超载,抑制角膜上皮细胞凋亡。PDC防止皮肤光老化;因此,他们显示保护和修复属性(13- - - - - -15]。然而,high-glucose条件下对人类皮肤成纤维细胞的影响尚未得到证实。因此,在本研究中,我们使用不同浓度的治疗HSF PDC在体外根据high-glucose (HG)条件。我们观察到的影响PDC HSF的活性和细胞凋亡,以及矩阵的表达metalloproteinase-2 (MMP-2)。关键的目标是要建立的保护特性PDC HSF在糖尿病和糖尿病皮肤损伤的治疗提供新的方向。

2。材料和方法

2.1。实验材料

胰蛋白酶,杜尔贝科修改鹰的媒介DMEM培养液,和低糖DMEM培养基获得从Gibco(美国)。胎牛血清是购自Gibco(美国)或杭州四季青生物工程材料有限公司(中国)。中度蛋白质溶解产物,NA-Red和朱红色年代的解决方案从Biyuntian购买生物科技(中国)。Biocolor Sircol可溶性胶原蛋白测定是购自Biocolor(英国)。的多糖石斛兰candidum(PDC)准备在房子。的有限公司₂孵化器是来自武汉华海还是奥林巴斯(中国)。kh - 600 db数据超声波清洁从JBtek购买(美国),而BD FACSCalibur流式细胞分析仪是来自(美国)正欲。

2.2。多糖的提取石斛兰candidum

原球茎的多糖的提取工艺石斛兰officinale研究了。在我们的研究过程如下:原料,称重,热水提取、粗过滤、蒸发浓度,滤液站、真空过滤、水浴浓度,冷冻干燥,粗多糖。2000克新鲜的原料石斛兰officinale重,切小段促进多糖的提取。200克留给冷冻干燥。剩下的部分被热水提取好几次了。根据医学和水的比例,药物提取用热水(医学:热水= 1:4)2小时,然后初步提取解决方案是保留,混合物提取(初步提取解决方案:水= 1:2)下一个小时。然后,滤液蒸发和浓缩到一定体积,然后它是冷冻24小时得到粗多糖。原球茎的多糖的提取工艺石斛兰officinale进行优化。提取条件通过正交设计建立了L (934)。实验重复三次。原球茎的粗多糖石斛兰officinale被优化的提取技术,纯度为51.3%。在实验中,的粗多糖石斛兰candidum原球茎可以溶解在三个蒸馏水准备10毫克/毫升的初始解,进行过滤和消毒。在使用之前,中添加并稀释至所需浓度。

2.3。HSF的主要文化

过程是基于之前报道的方法(16]。婴儿的包皮无菌移除,100用青霉素治疗μ100 g / mL和链霉素μ克/毫升。当时彻底清洗与磷酸盐(PBS)和D-Hanks解决方案。去除皮下组织后,皮肤标本使用无菌眼科剪和切成小块放在一个II型胶原酶消化解决方案在4°C一夜消化。表皮和真皮无菌分离。表皮被丢弃,而真皮削减和转移到解决方案包含0.25%胰蛋白酶(不含乙二胺四乙酸(EDTA))大约15分钟。消化被添加high-glucose停止包含10%牛血清DMEM培养基。解决方案是在800 g离心5分钟,以及由此产生的颗粒被接种到25毫升塑料培养瓶。大约4毫升high-glucose DMEM培养液含10%小牛血清是精心添加漂组织。培养瓶是放置在一个37°C, 5%的公司₂孵化器一夜之间(16]。第二天,5毫升的媒介了。主细胞通道时> 80%。在一段期间,细胞消化0.25%胰蛋白酶(EDTA除外)。培养瓶是拍在倒置显微镜下细胞的收缩之前添加10%小牛血清。消化了的除了high-glucose DMEM培养基。墙上的细胞瓶是轻轻地用移液器吸取收集到一个10毫升离心管。在800 g细胞离心5分钟,和上层的丢弃。细胞接种和常规培养。

2.4。High-Glucose模型的建立和实验分组

HSF细胞培养和通道。融合细胞达到80%时,血清培养基被丢弃。24小时后无血清培养基的改变,文化包含不同浓度的葡萄糖随后准备(5、10、15、20、25、30、35岁和40更易与葡萄糖/ L)。观察后12、24、36、48、72 h,的最佳葡萄糖浓度high-glucose HSF细胞模型建立在25更易/ L。实验分为以下组:(1)对照组(控制,C): HSF细胞培养与含10%胎牛血清的DMEM培养基48小时;(2)high-glucose组(高葡萄糖、HG): HSF对待文化解决方案包含25更易与48 h / L的葡萄糖;(3 - 5)在不同剂量PDC: HSF对待文化解决方案包含100年,200年和400年μPDC 48 h g / mL;和(6 - 8)高葡萄糖+不同剂量的PDC集团(HG + PDC): HSF处理葡萄糖的文化解决方案包含25更易/ L和100年,200年和400年μ克/毫升的PDC 48 h。甘露醇(25更易/ L)是利用高渗透压力控制。

2.5。MTT细胞生存能力测试

(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)法检测细胞的生存能力。这个试验的原理是脱氢酶酶活细胞减少四唑不溶于水的蓝色产品,即。甲瓒,沉淀的细胞。相反,死细胞不具有这个属性。二甲基明矾的蓝紫色晶体溶解细胞,和颜色深度成正比的甲瓒(17,18]。

2.6。胶原蛋白检测方法

每个小组收集的细胞上清液中胶原蛋白含量的测定细胞培养基。100年μL培养基含有胶原蛋白的分离,和集中添加试剂。离心后的上层清液被丢弃在一夜之间在4°C。标准胶原蛋白稀释为0,0.01,0.05,0.1,0.2,和1.00 mg / L。500年μL Sircol染料被添加到每个样本和孵化了30分钟。样本然后用酸性盐洗清洗试剂(R)》250μL碱性金属试剂添加到每个管混合之前的漩涡。200年μL的样品转移到96孔板,由检测分析了利用微型板块读者。检测波长为555 nm,吸光度值调整为零。空白的吸光度试剂,标准的胶原蛋白,和测试样本测量准确性的三倍。测试误差±10%。

2.7。细胞凋亡的检测的影响PDC HSF HG环境中使用膜联蛋白V-FITC / PI和流式细胞术

九组的细胞分离在对数生长期。由胰液素没有EDTA消化后,这些细胞被放置在离心管和PBS冲洗两次。这些细胞被随后在800 g离心5分钟。这些细胞被收集并放置在1毫升埃普多夫管。500毫升的绑定缓冲了暂停的细胞。5毫升的膜联蛋白V-FITC和5毫升的碘化propidium添加和被允许在室温下反应5 - 15分钟。

2.8。测定的影响PDC TIMP-2 mRNA的表达和MMP-2 mRNA在使用RT-qPCR HG HSF细胞环境

根据描述九组治疗过程。细胞收集确定TIMP-2 mRNA的表达和MMP-2 mRNA的HSF细胞用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)。HSF的总RNA的提取细胞,以及反转录的RNA和RT-qPCR,进行了利用SYBR®方法。目标基因序列搜索的国家生物技术信息中心(NCBI)。引物5软件被用来设计引物。进行了系统组成和定量PCR扩增此举使根据先前所描述的方法(19)(表1)。

2.9。统计处理

所有的数据进行了分析使用SPSS 19.0版的软件包。根据提供的测量数据平均值±标准之间的差异值。的t以及个人的样本进行比较两组之间的平均值满足正态分布和方差齐性。团体之间的意义也进行了单向方差分析(方差分析),后跟一个图基HSD事后测试。单因素方差分析是用于比较不同群体之间的平均值。研究结果给出均值±Dunnett SD和比较的测试。所有组成对比较。显示统计学意义的差异。

3所示。结果

3.1。高葡萄糖浓度的影响和PDC HSF细胞的可行性

获得的结果显示在图1和表S1。可以看到,与对照组相比,HSF high-glucose组的细胞生存能力显著降低( )。相反,类似的细胞浓度葡萄糖内容组没有明显不同于对照组( ),表明高葡萄糖浓度会导致减少HSF细胞的可行性。此外,这一结果也表明,诱导细胞损伤与渗透压。细胞生存能力之间无显著差异石斛兰多糖(100、200和400μ观察g / mL)和对照组( )。与high-glucose组相比,细胞的可行性high-glucose + PDC(100、200和400μg / mL)组显著增加,表明浓度依赖性( )。

3.2。高葡萄糖浓度的影响和PDC HSF细胞凋亡

分析结果如图所示2和表S2。这是确定HSF high-glucose组细胞凋亡率与对照组相比显著增加( )。相反,细胞凋亡率相同的甘露醇含量组没有明显不同于对照组( ),表明高葡萄糖浓度会导致增加HSF细胞的凋亡。此外,诱导细胞损伤并不相关的渗透压。的细胞凋亡率PDC(100、200和400μg / mL)组与对照组没有显著差异( )。值得注意的是,与high-glucose组相比,high-glucose + PDC(100、200和400μg / mL)集团降低了高glucose-induced凋亡浓度的方式( )。

3.3。高葡萄糖浓度的影响和PDC HSF细胞胶原蛋白含量细胞培养液

与对照组相比,胶原蛋白水平的HSF细胞培养液high-glucose组显著减少( )(图3和表S3)。细胞培养液中胶原蛋白含量的PDC(100、200和400μg / mL)组与对照组相比没有变化( )。此外,与high-glucose组相比,胶原蛋白水平在培养液high-glucose + PDC(100、200和400μg / mL)浓度的方式组显著增加( )。

3.4。高葡萄糖浓度的影响和PDC mRNA的表达MMP-2和TIMP-2 HSF细胞

与对照组相比,MMP-2 mRNA的表达显著增加在high-glucose HSF细胞( ),虽然TIMP-2 mRNA的表达下降(数字4和5和表S4和S5)。与对照组相比,PDC(100、200和400μg / mL)下调MMP-2 mRNA的表达和调节TIMP-2 mRNA的表达HSF细胞浓度的方式( )。与high-glucose组相比,MMP-2 mRNA的表达在HSF细胞high-glucose + PDC(100、200和400μg / mL)组明显减少,而TIMP-2 mRNA的表达增加浓度的方式( )。

4所示。讨论

高葡萄糖环境模拟糖尿病状态不仅可以减少成纤维细胞的迁移和增殖能力,但也增加了细胞凋亡。正如前面提到的,成纤维细胞构成的主要修复细胞在伤口愈合和肉芽组织的一些主要组件。他们合成和分泌细胞外基质,包括胶原蛋白、纤连蛋白和透明质酸(20.- - - - - -23]。因此,在糖尿病的病理状态,增加纤维母细胞凋亡必然阻碍皮肤溃疡的愈合。基质金属蛋白酶(MMP)的动态平衡家庭是异常在糖尿病。基质金属蛋白酶的表达和增强的增加酶活性可能导致过度的细胞外基质的降解,导致慢性难治性伤口表面的形成。研究表明,MMP-2增加损伤真皮成纤维细胞(24- - - - - -26]。

它已被证实之前,在中国传统医学,石斛兰officinale增强脾脏以及滋养胃、肺和肾脏。它通常用于治疗慢性胃炎、高血压、糖尿病、慢性肾炎、肾病、通常是作为抗肿瘤和抗衰老的代理(27,28]。类似的物质被证明影响角质细胞或内皮细胞,它也参与了糖尿病伤口愈合。莫等人探讨erianin的影响,bibenzyl化合物提取石斛兰chrysotoxumHaCaT细胞增殖和细胞凋亡,表明erianin都可以被认为是一个潜在的antipsoriasis药物,抑制增殖和诱导细胞凋亡HaCaT细胞通过ROS-mediated物/ c-Jun和AKT / mTOR信号通路(29日]。Erianin还发现诱导物/ SAPK-dependent代谢抑制人类脐静脉内皮细胞(30.]。的乙醇提取物石斛兰chrysotoxum采用改善视网膜血管生成在糖尿病性视网膜病变的发展通过抑制VEGF的表达/ VEGFR2和其他proangiogenic MMP-2/9[等因素31日]。目前的研究发现,在high-glucose条件下,HSF细胞生存能力显著降低,细胞凋亡率显著增加,和胶原蛋白含量明显降低。此外,TIMP-2的mRNA表达减少,而mRNA的表达MMP-2 HSF细胞增加。的PDC(100、200和400μg / mL) HSF细胞对细胞生存能力没有显著影响,细胞凋亡,或胶原蛋白水平。然而,PDC(100、200和400μg / mL)可以反向胶原蛋白水平的变化,生存能力,造成的HSF细胞和细胞凋亡率高葡萄糖,蛋白质和TIMP-2 mRNA的表达增加,MMP-2 mRNA水平降低浓度的方式( )。因此,目前的研究证实,PDC可以表现出一定的保护对人类皮肤成纤维细胞的影响作用在high-glucose条件下。此外,我们推断,PDC皮肤成纤维细胞的胶原蛋白合成增加移植TIMP-2抑制MMP-2的mRNA的表达,这可能是有利于糖尿病皮肤损伤的修复。这还需要进一步的研究来确定信号通路参与监管TIMP-2在皮肤成纤维细胞的胶原蛋白合成。MMP-2的过度参与银屑病表皮被发现伴随着基底膜改变与降解胶原IV型(32]。以前的研究也表明,全脑照射介导的降解胶原IV型通过改变大脑MMP-2和TIMP-2水平的平衡(33)、基质金属蛋白酶和TIMPs负责健康的细胞外基质重塑,他们生产的协调方式,Kozaci等人发现pro-MMP-2水平与椎间盘突出的胶原蛋白含量负相关材料(34]。

通路调节的分子机制TIMP-2和MMP-2表达式中引入许多疾病,尤其是糖尿病、或不同疾病以外的糖尿病。这项研究由何鸿燊et al。35)发现,氧化应激引起的高葡萄糖可能参与。差别MMP-2激活和TIMP-2对这些相反的影响这种活性氧(ROS)依赖MMP-2激活,反过来,介导high-glucose-induced细胞凋亡在人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)。此外,转化生长因子(TGF) / SMAD家庭成员3 (Smad3)通路被发现调节MMP / TIMP活动,诱导纤维化介质的激活和抑制细胞外基质的降解36- - - - - -38]。TIMPs可以控制MMP的活动,MMP-2可以消化纤维胶原蛋白肽和新成立的胶原纤维降解胶原蛋白(39,40]。此外,更多的证据表明,TIMP-2和MMP-2表达式可以发挥重要作用在其他疾病的发展。MMP-2、TIMP-2 MMP-2 / TIMP-2比率可作为生物标记物对系统性红斑狼疮(SLE) [41]。慢性鼻窦炎的发病机理也可能相关的监管MMP-2和TIMP-2表达式。类固醇可以抑制smoke-regulated MMP-2 TIMP-2生产和激活通过活性氧(ROS) / PI3K Akt, NF -κB在鼻成纤维细胞信号通路42]。然而,MMP-2 / TIMP-2活动之间的因果关系和胶原蛋白在皮肤成纤维细胞还不清楚,需要进一步的调查。选择性MMP-2抑制剂和MMP-2基因敲除小鼠可以用作深入药理和遗传方法阐明MMP-2表达式之间的机械连接,TIMP-2表达式,胶原蛋白含量的变化在皮肤成纤维细胞暴露于高葡萄糖。

总之,我们的研究表明PDC可以在HSF high-glucose条件下表现出保护作用,这可能与upregulation TIMP-2表达和抑制的MMP-2表达式,为预防和治疗提供了新概念的使用中医糖尿病皮肤溃疡或伤口,包括石斛兰officinale。

数据可用性

本研究或分析生成的数据是包括在发表的这篇文章。生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者参加了实验。问:l . y . l .构思实验。y L。,Z. C., and C. W. conducted the experiments and drafted the manuscript. Y. L., Z. C., and Z. Z. analyzed the results. All authors reviewed the manuscript, and Q. L. critically reviewed and revised the manuscript. All authors gave final approval to the version submitted for publication.

确认

作者感谢来自中国美国国家科学基金会的拨款(81170823),湖南省哲学社会科学基金项目2018 (18 yba325), 2018年湖南省教育部项目(160546),湖南省卫生和卫生委员会科研基金项目(C2019055),湖南省2017年财政部项目湘财金融局([2017]61号),宁夏回族自治区哲学社会科学规划项目(19 nxagl01),和湖南的“225”项目培训纪律领袖项目高级卫生专业人员。这项工作是由湖南省技术创新指导计划支持的临床医疗技术创新项目(2017 sk50510,没有指导。97)。

补充材料

表S1:高葡萄糖浓度的影响和PDC HSF细胞的生存能力。表S2:影响高葡萄糖和PDC HSF细胞的凋亡。表S3:高葡萄糖浓度的影响和PDC细胞培养液中的胶原蛋白含量。表S4:高葡萄糖浓度的影响和PDC的mRNA表达MMP-2 HSF细胞。表S5:高葡萄糖浓度的影响和PDC mRNA表达的TIMP-2 HSF细胞。(补充材料)

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