文摘

卵巢储备下降(金龟子)是指降低卵母细胞的数量和质量。西方的金龟子的治疗没有改善卵巢储备从根本上说,影响是有限的。Gengnianchun配方(GNC)是一种传统中药配方最初应用于治疗更年期综合症,但也发现在治疗临床金龟子患者是有效的。这里我们的目标是检查GNC的影响在大鼠金龟子4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD),这种化学物质有选择性地破坏卵巢小preantral毛囊,并进一步探讨可能的机制。雌性SD大鼠随机分为4组:对照组(C)、模型组(M),高剂量GNC组(H)和低剂量GNC组(L)。老鼠在M H和L管理VCD和生理盐水,高剂量和低剂量GNC GNC的分别。鼠卵巢是收获进行他染色卵泡数、免疫组织化学、免疫印迹。我们发现高剂量的GNC显著增加卵巢指数和持续的原始卵泡数量和初级毛囊VCD治疗老鼠。此外,高剂量的GNC的卵巢蛋白表达显著增加小鼠瓦萨号同系物(MVH),她们血液中的抗苗勒氏管激素(抗苗勒氏管激素),卵泡刺激素受体(FSHR)和雌激素受体β(ERβ与模型组相比)。此外,高剂量GNC显著增加卵巢AKT磷酸化和下游forkhead的表达盒O3 (FOXO3a)。Proapoptosis伯灵顿的蛋白质裂解caspase-3,保利ADP-ribose聚合酶(PARP)是显著降低高剂量GNC治疗后与模型组相比。总的来说,这些发现表明,高剂量GNC可以防止卵巢储备VCD-induced毒性通过一种蛋白激酶信号通路的激活和减少细胞凋亡在SD大鼠。这种效应可能是引起增加FSHR nontranscriptional激活的信号或ERβ,这就需要进一步调查。

1。介绍

卵巢储备下降(金龟子)是指降低卵母细胞的数量和质量1,2]。金龟子的病人可能有月经不规则或普通但承担较低的机会怀孕和流产的几率更高。不同于生理绝经后卵巢储备下降,金龟子通常指早期或加速发生的生育年龄的妇女卵巢储备下降(3]。金龟子的病因仍不清楚。遗传因素、环境污染、自身免疫性疾病、心理因素和医源性因素可能参与其中。当前的共识认为,这是一个疾病与复杂的原因和治疗方法缺乏明确的功效。

Gengnianchun配方(GNC)是一种有效的中国传统公式应用在我们医院治疗绝经后综合症几十年(4]。我们小组研究了GNC的影响在不同的动物模型来揭示其机制治疗各种体内疾病如骨质疏松症、阿尔茨海默病,免疫功能紊乱,皮肤老化5- - - - - -13]。在传统中医理论,金龟子股票类似的病因与更年期,肾脏的不足。因此,我们也在临床应用GNC金龟子患者和观察到的在恢复卵巢储备中发挥巨大的作用,提高怀孕率。但这并没有在动物模型和验证机制仍然未知。

4-vinylcyclohexene diepoxide (VCD)是一种环境化学制造过程中产生的橡胶轮胎、阻燃剂、杀虫剂、增塑剂、抗氧化剂。VCD的早期研究表明,短期使用会损害的原始卵泡和初级毛囊Sprague-Dawley (SD)大鼠卵巢诱发金龟子的初始阶段(14,15]。此外,VCD可能通过抑制PI3K-AKT信号通路诱导细胞凋亡和卵泡闭锁16,17]。在这项研究中,我们的目标是探索GNC的影响在VCD-induced金龟子鼠模型,并进一步研究其影响PI3K-AKT途径探索潜在的分子机制,从而为应用程序提供实验依据GNC的金龟子疗法。

2。材料和方法

2.1。动物和治疗

共有四十还是雌性SD大鼠体重35±3到3.5 g是购自上海JieSiJie实验动物有限公司,有限公司,中国。老鼠被安置在SPF设施标准颗粒随意提供饮食和水的温度22 - 25°C和相对湿度50 - 60%的每日12小时光。适应5天后,老鼠被随机分为四组:对照组(C)、模型组(M),高剂量GNC组(H)和低剂量GNC组(L)。老鼠在M组,H和L VCD(美国Sigma-Aldrich 94956)腹腔内注射的剂量80毫克/公斤体重20天根据先前的报道15,18),而在C组大鼠管理同样体积的溶剂(美国Sigma-Aldrich S3547)。同时,老鼠在组米,H和L被给予生理盐水,高剂量(5.54克/公斤体重),或低剂量(2.77克/公斤体重)的GNC煎煮,分别为30天填喂法。低剂量的转换从人类剂量根据以前的报告(19]。高剂量是低剂量的两倍。GNC的应用程序的时间长度是根据金龟子的病人,临床应用的长度是6月经周期和老鼠= 30天。GNC汤是由溶解粉末颗粒进入热水(7]。腹腔内注射和口服填喂法体积是根据体重调整,这是测量每三天(13]。动物实验过程都是复旦大学动物实验伦理委员会批准(no.2015-07-FCKYY-WWJ-01)。

2.2。样品收集

30天的操作后,大鼠阴道涂片检查,观察到的主要细胞类型光显微镜下验证发情周期阶段(20.]。老鼠没有发情阶段选择牺牲。与先前的操作和其他老鼠继续牺牲,直到阴道涂片结果转向其他的发情周期阶段。麻醉后全血收集从心脏。收集到的全血在3000转离心10分钟4°C检索血清。双边卵巢收集并立即重计算卵巢指数以下配方:卵巢指数=卵巢湿重/体重。子宫也收集了形态学观察。左侧卵巢在4%多聚甲醛溶液固定24小时,然后嵌入在石蜡准备幻灯片的武汉Servicebio科技有限公司有限公司正确的卵巢是浸泡在液氮和转移到- 80°C冷冻直到进一步使用。

2.3。卵巢连续切片和卵泡计数

卵巢组织石蜡包埋后,最大的部分卵巢被选作连续切片。三个部分在10日20日和30日部分最大的部分每个卵巢被选中执行hematoxylin-eosin(他)染色组织学观察和卵泡计数。毛囊是分为不同阶段根据修改Oktay系统[21]。分析重复了三次,每个复制包含18片6从每组6大鼠卵巢。

2.4。血清激素测定

血清雌二醇(E₂)和睾酮(T)水平检测到的化学发光方法。商业上可用的工具被用来测量血清的浓度E₂美国贝克曼(33540、检测范围:13 - 4096 pg / mL)T美国贝克曼(33550、检测范围:0.1 -16 ng / mL)的贝克曼库尔特Unicel DxI 800系统根据制造商的协议。分析重复了三次,每个复制包含6样本6在每组大鼠。

2.5。免疫组织化学

卵巢组织部分与二甲苯脱蜡和乙醇。被暴露于抗原检索后,部分主要抗体在一夜之间在4°C。抗体信息列在表中1。组织与辣根孵化peroxidase-linked二级抗体在室温下了40分钟,然后沾民建联和苏木精为可视化的解决方案。脱水后,部分与中性密封胶,在显微镜下观察到。分析重复了三次,每个复制包含6片6从每组6大鼠卵巢。

2.6。免疫印迹

右卵巢被浸泡在裂解缓冲,超声波均质机均质。然后溶解产物是离心机在12000 rpm 30分钟4°C。浮在表面的收获,煮与加载缓冲sds - page。受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳和蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜。与脱脂乳阻塞后,细胞膜受到主要抗体在一夜之间在4°C。抗体信息也被列在表中1。之后,膜是孵化antirabbit免疫球蛋白HRP-linked抗体(# 7074年,春秋国旅,Inc .)、美国)在室温下1 h,然后用化学发光法和观察下ImageQuant las - 4000微型生物分子成像,美国通用电气。相关的蛋白表达水平是由数量决定一个软件。分析重复了三次,每个复制包含6片6从每组6大鼠卵巢。

3所示。统计方法

实验数据提出了均值±标准差(X±SD)。SPSS18.0用于统计分析。体重变化的比较四组之间用重复测量方差分析。方差分析与Bonferroni事后测试用于测试治疗组之间的意义。 被认为是一个重要的区别。

4所示。结果

4.1。大鼠的一般状况和生殖器官的观察

调整剂量的VCD和GNC,在不同组大鼠体重变化监测每三天在30天的操纵。如图1(一)显示,两组之间没有显著差异在药品监督管理局。这表明VCD和GNC不影响大鼠的一般健康。经过20天的VCD管理,模型组的卵巢指数明显比对照组降低(图1 (b), )。高剂量GNC治疗后,意味着卵巢指数似乎比M .但增加一个小群M和H组之间的差异不显著。低剂量的GNC并不影响卵巢指数。子宫和卵巢的外观在不同组如图1 (c)。我们观察到一个较低的卷的卵巢组相比,M和L C组和H的同时,似乎有那么大窦的卵泡在卵巢皮质组织M和L比C组和H代表微观的卵巢染色显示,有很多的原始卵泡积累在C组的卵巢皮质和H,而原始卵泡的数量在皮层组织M和L(图的要低得多1 (d))。

4.2。卵巢储备VCD和GNC治疗后的变化

根据先前的研究报告,VCD主要诱导原始大幅下降和初级毛囊相比对照组(数字2(一个)和2 (b), )。高剂量的GNC治疗显著提高原始卵泡和初级卵泡的数量(数字2(一个)和2 (b), )。初级卵泡的平均数甚至高于对照组(图2 (b), )。M组没有显著差异和C在次级卵泡,窦的毛囊或黄体(数字2 (c)- - - - - -2 (e))。也没有治疗效果的低剂量GNC观察改善毛囊的数量在所有阶段或黄体相比,模型组(数字2(一个)- - - - - -2 (e))有趣的是,大剂量的GNC显著改善窦的卵泡计数两组相比,M和C组(图2 (d), )。

4.3。VCD和GNC的影响生殖激素水平

E₂和T是两个生殖激素分泌颗粒细胞和卵泡膜细胞,分别。可能是因为VCD主要导致原始卵泡和初级卵泡,损耗和颗粒细胞和卵泡膜细胞的数量相对较小而大卵泡;我们没有观察到任何差异E₂和T每组(图之间的水平3)。

4.4。GNC对生物标志物的表达的影响卵巢储备和卵巢的激素受体

更好地验证GNC的影响提高卵巢储备,我们执行包含IHC和WB化验确定几个生物标志物的蛋白质表达水平的卵巢储备。MVH表达在细胞质中卵泡的卵母细胞在不同的阶段,主要是表现在原始卵泡和初级毛囊在这个实验。细胞质中表达抗苗勒氏管激素主要是次级卵泡和窦的早期卵泡的颗粒细胞。如数据所示4(一)- - - - - -4 (c)更深入地,有彩色MVH和积极抗苗勒氏管激素卵泡在C和H组比M和L组 。DAB染色强度在原始卵泡在L组略高于M组,差异不显著。FSHR是FSH受体和媒介促进FSH对卵泡发育的影响。类似的结果与MVH抗苗勒氏管激素被发现在小型和大型FSHR表达次级卵泡和窦的毛囊,FSHR主要是表达(数字4(一)和4 (d))。C组和H组比这更高的FSHR表达米 。该集团L M组相比,显示更少的区别。雌激素在卵泡发展是另一个重要的调节因子。呃α主要表达在卵泡卵母细胞的细胞核和基质细胞在不同的阶段,而ERβ主要表达在不同阶段卵泡卵母细胞的细胞质中,特别是在原始卵泡,初级卵泡和次级卵泡,没有表情的原子核(22]。嗯没有显著差异α卵巢的卵泡中表达水平在不同的阶段在任何团体通过免疫组织化学(图4 (e))。但VCD诱导显著下调ERβ表达式在卵巢(图4 (f), )。同时,高剂量的GNC显著恢复ER的表达水平β与模型组相比。也没有显著影响GNC观察低剂量的调节β表达式。

免疫印迹分析证实了大多数免疫组织化学的结果。如数据所示5(一个)- - - - - -5 (d)MVH的表达、抗苗勒氏管激素和FSHR蛋白质组中的M组明显低于c的表达MVH,抗苗勒氏管激素,和FSHR蛋白质在H组高于组中,M和是类似于c MVH的表达水平,组中的抗苗勒氏管激素,FSHR L相比也略增加或保持相对低的组M .尽管组L显示降低ERα与C组相比,两组之间没有显著差异,H和L(图5 (e))。呃β表现出类似的趋势不同群体之间MVH,抗苗勒氏管激素,FSHR。高剂量的GNC改善ERβ表达较正常水平组比m .此外,L集团倾向于有一个更高层次的ERβ比那组中的表达米,但差异不显著(图5 (f))。

4.5。GNC的PI3K-AKT信号通路的影响

之前的一份报告声称,PI3K-AKT通路的抑制媒介VCD的不利影响原始和初级卵泡闭锁[17]。因此,我们进一步探讨了GNC的影响上游的表达和关键的监管者PI3K-AKT信号通路和下游apoptosis-related目标通过免疫印迹和免疫组织化学。如数据所示6(一)和6 (b)没有显著差异,在卵巢组织中PTEN的表达在不同的组。在下游信号分子,相对p-AKT / AKT蛋白表达水平和FoxO3a M组显著降低集团相比,c, H组显示这些蛋白质的表达显著高于组中,M M L组和组之间的差异不显著(数字6(一)- - - - - -6 (d))。此外,proapoptotic蛋白的表达,坏,伯灵顿,caspase-3裂解,M组和PARP显著增加组相比,c . M组相比,上述proapoptotic蛋白质的水平在H组明显降低(图6 (e)- - - - - -6 (h))。

通过免疫组织化学方法进一步证实了这些信号分子的变化分析。如图7,在所有测试PI3K-AKT通路分子,VCD主要诱导一种蛋白激酶磷酸化的明显降低(图7 (c), )和伯灵顿的显著增加(图7 (e), )和裂解caspase-3(图7 (f), )表达鼠卵巢。GNC的高剂量显著增加一种蛋白激酶磷酸化水平和降低了伯灵顿和裂caspase-3(数字的表达7 (c),7 (e),7 (f))。但低剂量GNC疗效不显著PI3K-AKT信号通路的调控。

5。讨论

金龟子是贫困不孕的主要原因之一的结果和一个重大的挑战甚至对病人转向辅助生殖治疗帮助。尽管西医所使用的激素替代疗法可以改善临床症状如闭经在某种程度上,实际的卵巢储备是没有根本改观。同时,存在生殖激素的副作用的应用程序。中医有一种特殊的力量在治疗女性生殖问题。作为一个长期使用multiherbal公式,GNC已经被证明是有效的治疗一系列的更年期和老龄化带来的疾病(4,5,8,23]。基于初步临床应用和猜测,金龟子的加速度可以被认为是卵巢储备下降之前,年龄,我们提出假设GNC应该有效地治疗金龟子。在这项研究中,通过使用大鼠金龟子VCD,我们验证了GNC有效保护卵巢储备通过激活一种蛋白激酶信号通路和减少细胞凋亡。

减少可用卵泡的数量和质量是金龟子的主要特征。我们目前的结果(图2)和一个以前的报告15)已经证实,VCD特别能导致原始的损耗和初级毛囊而不影响其他重要器官(24]。这微妙地复制金龟子的初始阶段,使VCD好剂诱导金龟子模型比其他方法建立金龟子模型像化疗药物。的一个重要的临床异常金龟子病人血清FSH水平升高。然而,由于VCD只有影响卵泡数量的初始阶段的卵泡阶段,模型大鼠的血清FSH水平仍然不受影响(数据没有显示)。这可能也解释了血清的结果E₂和T水平保持不变模型大鼠与对照组大鼠相比(图3)。但是我们发现了一个显著降低FSHR蛋白表达在免疫印迹和免疫组织化学分析(数据4 (d)和5 (d))。这表明降低模型大鼠卵巢FSH刺激。MVH生殖细胞是一种特殊的标记表示卵泡的卵母细胞在不同阶段(25]。抗苗勒氏管激素主要由颗粒细胞分泌的初级卵泡、次级卵泡,和小窦的毛囊,已广泛应用于临床预测卵巢储备的好标志,因为它不与月经周期波动(26]。我们选择这两个分子生物标志物的毛囊在早期阶段验证VCD的影响。同时,我们发现显著下调MVH和抗苗勒氏管激素蛋白表达在模型大鼠的卵巢(数字4 (b)和4 (c)和数字5 (b)和5 (c)),从而确认的有效性VCD-induced金龟子模型。

基于模型,揭示了GNC的影响增加卵巢指数和原始和初级卵泡数量增加(数据2(一个)和2 (b))。而且,令人惊讶的是,窦的卵泡数也比对照组显著提高了GNC的高剂量。这种效应可能表明GNC不仅提高了卵泡早期开发阶段,但也促进窦的卵泡发育。MVH、抗苗勒氏管激素和FSHR表达水平也发现增加高达GNC的正常大鼠在高剂量组。这些结果证实,GNC可以提高卵巢储备的VCD-induced金龟子鼠模型和改善卵巢对FSH刺激响应性,尽管只有高剂量GNC被发现有效的足够了。以来中药多重视疾病的预防,我们开始GNC治疗的同时VCD管理。这就提出了两种可能的增加原始卵泡和初级卵泡数。第一种可能性是,GNC阻止VCD造成的损害,因此,预防毛囊的损失。这是我们进一步验证的可能性。第二个可能性是,GNC增加原始和初级卵泡的形成后,VCD损伤。 Traditional dogma holds that the ovarian follicle pool is fixed after birth. The number of follicles will only decrease with the increase of age. However, recent studies have raised the possibility of the existence of ovarian germline stem cells [27,28)或原始卵泡的形成bone-marrow-originated干细胞(29日,30.]。此外,其他传统中草药的研究也发现类似的结果改进MVH表达式,表明原始卵泡数量的增加31日]。GNC的影响是否涉及干细胞的参与仍有待研究。

根据之前的报道(17),VCD抑制一种蛋白激酶的磷酸化和核本地化原始和小初级卵泡的卵母细胞。同时,规范化的效应器FSHR PI3K-AKT通路。找出是否GNC阻止这种抑制效应通过改善FSHR-related AKT信号激活,进一步减少卵巢细胞凋亡,我们分析了几个关键的蛋白表达目标PI3K-AKT信号通路的免疫印迹和免疫组织化学。我们发现VCD显著地抑制p-AKT表达式,FOXO3a水平下降,并增加卵巢proapoptosis分子伯灵顿,caspase-3裂解,PARP表达式,而高剂量GNC显著提升一种蛋白激酶磷酸化,FOXO3a水平,增加和减少上述proapoptosis分子(数字6和7)。值得注意的是,PI3K-AKT信号是一个重要的信号通路在颗粒细胞和卵母细胞。在颗粒细胞与细胞增殖、凋亡和类固醇生成(32]。这有利于AKT-activation影响卵母细胞和颗粒细胞促进卵泡成熟。

除了促性腺激素,雌激素也必不可少的激素调节卵泡发展。细胞对雌激素的反应是由ERα和ERβ。在这项研究中,我们发现无论是VCD还是对ER GNC施加重大影响α表达式。但VCD显著降低ERβ卵巢中表达,高剂量GNC恢复ERβ蛋白质水平。这是符合我们之前发现GNC能够增加ER的表达β在下丘脑大鼠去卵巢后的骨骼状况33]。作为核受体,它已经认识到在一个ERβ突变鼠模型研究DNA binding-dependent ER的转录功能β对于排卵期前的卵泡成熟和排卵是至关重要的34]。但核外信号包括PI3K-AKT通路激活ER已报告β在脑疾病研究35,36)和心肌的研究(37]。ER nontranscriptional激活的影响β在卵巢癌研究仍然未知。因此,是否AKT-activation涉及增加ER的效果β活动需要进一步研究。

总之,GNC提高卵巢储备在VCD-induced金龟子老鼠。底层的机制可能是通过抑制细胞凋亡和初级卵泡闭锁通过一种蛋白激酶信号通路的激活。GNC是否作用于一种蛋白激酶信号通路直接通过刺激FSHR和ERβ通过体外实验需要进一步验证。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(批准号81273956)和上海市科学技术委员会(批准号18401932000)。