大黄素对高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs) NO分泌的影响及其机制

摘要

客观的．目的探讨大黄素通过p-Akt信号通路对高糖诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)一氧化氮(NO)分泌的影响。方法．MTT测定法测定细胞对大黄素的敏感性，以确定实验浓度;然后，用高剂量（33.3mmol / L）葡萄糖（Hg），Hg +大黄素（Hg + e），Hg + +磷酸化抑制剂Ly294002（Hg + Ly），或Hg + E + Ly处理Huvecs。使用Western印迹分析48小时内的P-AKT（SER 473）表达。使用硝酸还原酶测定分析对Huvecs分泌的影响。结果．对HUVECs生长敏感的大黄素浓度为10 mol/L ( )．与HG组相比，HG + E组NO分泌明显升高( )，而HG + LY组最低( )．与HG + LY组相比，HG + E + LY组NO分泌增加( )．与HG组相比，HG + LY组p-Akt蛋白表达降低( )，而HG + E组显著升高( )．与HG + LY组相比，HG + E + LY组p-Akt蛋白表达显著升高( )．结论．大黄素通过p-Akt信号通路改善高糖HUVECs的NO分泌。

1.介绍

胰岛素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)的特征。炎症反应和血管细胞功能紊乱通常会加速IR的生长[1]．内皮细胞产生一氧化氮（NO），这是血管松弛的重要调节器。内皮细胞的还原不是其功能障碍的重要原因，并且无分泌与一氧化氮合酶（Enos）的磷酸化密切相关[2，3.]．在细胞实验中发现，烯醇的磷酸化与磷脂酰肌醇3-激酶/ aKT（PI3K / AKT）转导相关[4]．目前的研究表明，T2DM患者的内皮功能障碍与PI3K / AKT / ENOS转导的抑制相关[5]．先前的研究表明大黄素在改善胰岛素抵抗方面具有潜在的作用。Lee等在对成骨细胞(OB)分化的研究中发现大黄素可以通过PI3K的活性调节Akt，促进OB细胞的分化[6]．因此，本文讨论了大黄素通过P-AKT蛋白信号转导改善高葡萄糖诱导的诱导的分泌，以提供实验依据，以进一步探索大黄素对糖尿病胰岛素抵抗和血管并发症的改善功能的探讨糖尿病。

2.材料和方法

2．1．试剂和设备

大黄素(美国Sigma公司生产):称取1mg大黄素溶解于DMSO中，加入7.4 mL高压灭菌三蒸馏水，再加入50 mLμL为5 mol / L NaOH溶液用移液器将其溶解成橙红色透明溶液，即大蛋白。高压灭菌过滤器通过清洁台式过滤。将过滤的溶液作为母溶液，浓度为500 μmol / L。用高压灭菌三蒸馏水将母液稀释至0.1浓度μmol / L, 5μ10 mol / Lμmol / L, 15μ20 mol / Lμmol / L, 25岁μmol / l和30 μ分别mol / L。人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购于中南大学药理实验室细胞中心;NO检测试剂盒来自南京建成生物工程研究所;p-Akt (Ser473)抗体，英国Abcam公司;老鼠反β-actin抗体，北京中山金桥生物科技有限公司;蛋白梯度预染色标记物，杭州四季青生物工程有限公司;上海碧泰生物科技有限公司LY294002LY294002的制备:add 1083μ将二甲基亚砜(DMSO)加入1mg，得到3 × 10⁻³稀释2次，得到1 × 10⁻³mol/L的应用液，再加10μmol/L施药液加入1ml培养基中。溶液的最终浓度是10μmol / L。低糖DMEM培养液(美国Gibco公司)、胎牛血清、FBS(澳大利亚APP公司)、d -葡萄糖和胰蛋白酶粉(美国Sigma公司)、MTT(美国Fluka公司)、凝胶成像分析系统GOS7500(美国UAP公司)、倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)、采用德国EPPendorf公司5804R高速低温离心机。

2．2．高糖模型和细胞培养

当细胞达到80%的聚结HUVECs是培养和退位,丢弃serum-contained培养基和取代培养基无血清培养24小时,然后采用营养液含有不同浓度的葡萄糖,5更易/ L, 11.1更易/ L, 22.2更易/ L,分别和33.3更易/ L。分别观察0 h、24 h、48 h和72 h后，发现高糖模型HUVECs 48 h后最适葡萄糖浓度为33.3 mmol/L。实验组为高糖33.3 mmol/L +大黄素组(HG +大黄素)、高糖+ LY294002组(HG + LY组)、高糖+大黄素+ LY294002组(HG +大黄素+ LY组)。联合孵育48 h后，测定各组细胞培养上清中NO含量，Western blot法检测p-Akt蛋白水平。

2．3．MTT法检测细胞药敏

倒置显微镜下观察，细胞状态良好，培养瓶覆盖90%。废弃旧培养基，用PBS洗瓶两次，用胰蛋白酶消化，加入培养基，计数板数。增加5.096孔板每孔103个细胞，接种12小时后倒置显微镜观察。观察细胞贴壁后，弃去消化培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞2次。增加150μL为大黄素培养基，各浓度为0.1μmol / L, 5μ10 mol / Lμmol / L, 15μ20 mol / Lμmol / L, 25岁μmol / l和30 μmol/L加入相应的96孔孔板中，培养24小时后加入20μl浓度为5mg / ml的MTT进入每个孔中。4小时后丢弃上清液，加入150 μL DMSO进入每个孔并将其略微摇动10分钟（min）用于晶体和溶解。测量在微孔板读卡器的570nm波长下的吸收异位值。根据公式，计算HUVEC IR（存活率）（％）=（1 - OD平均值/受控孔的平均值） 100%，计算各组细胞的IC50值。

2．4．硝酸还原酶检测NO

NO迅速转化为NO⁻²也没有⁻³在人体，没有⁻²进一步转化为没有⁻³．没有⁻³降为NO⁻²利用硝酸还原酶的特性。它的浓度是通过显色度来确定的。收集的培养液室温溶解后稀释。具体操作步骤严格按照试剂盒说明书执行。用分光光度计测定各样品在550 nm、0.5 cm光程处的吸光度值，测定NO (μmol / L×10⁵严格按照试剂盒说明书中的步骤计算培养液中的细胞/ml)。变异系数在10%以内。(1)取0.1 mL样品，加入混合物中拌匀，置于37℃水浴中60min;(2)分别加入试剂3、试剂4 0.21 mL，充分旋转搅拌30秒，室温下，3500 rpm/min，炖40分钟，离心操作10分钟，取上清染色;(3)取上清液0.5 mL，加入显色剂0.6 mL，拌匀，室温炖煮10 min;用蒸馏水置零，用721型分光光度计测定吸光度，光程为550 nm, 0.5 cm;(4)将吸光度值代入方程，计算NO含量。

2．5．Western Blot分析p-Akt蛋白表达

Western blot法检测步骤:叠片平板玻璃是组装和固定站,准备将凝胶和叠加凝胶注入站在一个适当的比例,梳子是叠加凝胶插入到适当的位置,然后叠加凝胶在室温下聚合了30分钟。取蛋白质定量试剂盒手册中测定的蛋白溶液体积作为上样体积(样本量)。上样通电，SDS-PAGE凝胶电泳后，电印迹约50 min。用封闭液封住5%脱脂牛奶，室温下缓慢摇匀1小时，弃封闭液。稀释1%脱脂牛奶，一抗在4°C(1:500)孵育过夜或37°C孵育1小时，一抗恢复，用TBST洗涤三次，每次约10分钟。稀释后，二抗37°C(1:10 00)孵育1小时，然后进行培养。

2．6．统计分析

给出了实验中获得的相关数据 ，数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析。实验重复三次。他们在统计学上是显著的 通过单因素方差分析组间差异。

3.结果

3.1。大黄素浓度筛选实验中的筛选

MTT实验表明大黄素能抑制HUVECs的生长并促进其凋亡，且呈剂量依赖性。选择存活率为90%的细胞浓度作为实验浓度。表中结果1结果表明，当大黄素浓度为0.1时，HUVECs的存活率高于91.3%μmol / L, 5μmol / L, 10μ分别mol / L。0.1组HUVECs存活率无显著性差异μmol/L基团和10μ0.1 mol / L组(μMol / L组与10 μmol / L集团)( )．HUVECs的存活率有统计学差异( ）作为一个15人的团体μ20 mol / Lμmol / L, 25岁μmol / l和30 μmol/Lμmol / L组。因此，本实验中大黄素的浓度为10μmol / L。

3．2．大黄素对高糖诱导HUVECs上清NO含量的影响

在表2，在大黄素治疗下，与高糖组(HG组)相比，HG +大黄素组HUVECs NO分泌增加( )．此外，与HG组相比，HG + LY294002组HUVECs NO分泌减少( )，而HG +大黄素+ LY294002组较HG + LY294002组有增强( )．

3．3．大黄素对高糖诱导HUVECs中p-Akt蛋白表达的影响

在表3.和图1，与33.3 mmol/L高糖组相比，HG (33.3 mmol/L) + LY294002组p-Akt蛋白表达降低( )，而HG (33.3 mmol/L) +大黄素组( )．与Hg（33.3mmol / L）+ Ly294002组相比，在Hg（33.3mmol / L）+ Ly294002 + eModin组中增加了p-akt蛋白表达（ )．

4.讨论

在病理条件下，血管内皮功能障碍主要是炎症反应，内皮剥落，内皮血管渗透性增加，并降低内皮依赖性血管扩张（EDD）[7]．这些病理改变是胰岛素抵抗发生的重要诱因。NO是内皮细胞分泌的重要生物活性物质之一。血管功能障碍与NO浓度的调节密切相关，NO浓度是衡量内皮功能的重要指标。过度分泌NO可诱导或启动凋亡程序诱导内皮细胞凋亡[8]．相反，分泌NO的减少会导致EDD功能障碍，平滑肌细胞增殖增强，血小板聚集增强，导致血栓形成，促进动脉粥样硬化的发展。糖尿病患者的高糖是引起内皮功能障碍的重要因素，不仅影响了内皮功能的屏障，还导致内皮细胞分泌的收缩因子血管紧张素II增加，舒张因子NO减少。也有研究表明，给正常人葡萄糖负荷后，血管内皮细胞收缩功能增强，血管舒张功能减弱，血流速度减慢。由此可以推断，葡萄糖浓度向上调节血管舒张[9，10]，而高糖(高血糖)可直接诱导血管内皮功能障碍，从而影响内皮分泌功能。

大蒜是羟基蒽醌的衍生物。它可以通过抑制骨骼肌细胞线粒体的氧气消耗来减少ATP的产生，并通过抑制骨骼肌细胞线粒体的氧气消耗，从而激活细胞中的能量开关AMPK并促进葡萄糖/右旋糖的转化为细胞和实现降低血糖的目的，以改善胰岛素抵抗[11，12]．一些研究表明，从大黄等某些草药中提取的大黄素，蓼属植物cuspidatum，有望为治疗2型糖尿病(T2DM)带来新的希望。对部分饮食肥胖大鼠喂食大黄素后，发现其血糖和血清中胰岛素水平降低，胰岛素抵抗水平升高，血脂水平升高[13]．我们的研究表明大黄素具有改善胰岛素抵抗的潜在作用，并引起了越来越多研究者的关注，但其具体的功能机制尚不清楚。

在这项研究中，我们发现10 mol / L Emodin是对数生长阶段的最佳浓度和培养的Huvecs的生长状态。先前的研究表明，胰岛素受体基质（IRS）激活了磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的胰岛素信号转导之一，使葡萄糖/葡萄糖被骨骼肌细胞吸收，并促进释放NO内皮细胞[14]．因此，PI3K信号转导的损害是IR的突出特征。在高浓度胰岛素的情况下，胰岛素的PI3K信号转导的损伤影响了eNOS的活性并减少了enos的产生[15]．LY294002是PI3K的特异性抑制剂，作用于PI3K/Akt的活性靶点，抑制Akt磷酸化，促进细胞凋亡[16，17]．

大黄素能改善高糖环境下NO的分泌。通过添加10μmol / L大黄素进行干预,通过对比HG 33.3更易与L组,HG 33.3更易/ L +大黄素组,HG 33.3更易/ L + LY294002集团和HG 33.3更易与L +大黄素+ LY294002集团,我们发现没有分泌HG + LY294002组最低,但这减少干预的10时可以逆转μmol / L大黄素。结果表明，大黄素能改善高糖对HUVECs的损伤。

本实验检测p-Akt蛋白表达也证实了大黄素对33.3 mmol/L高糖诱导HUVECs中p-Akt蛋白表达水平的积极影响。同时，p-Akt蛋白表达结果证实LY294002作为PI3K的特异性抑制剂，抑制了高糖环境中Akt的磷酸化。大黄素能促进高糖环境下p-Akt蛋白的表达，并逆转HG + LY294002组p-Akt蛋白表达下降的趋势，这与MTT结果显示大黄素对NO分泌的调控作用一致。

为了得出结论，研究表明，大黄素在PI3K / AKT转导的各种分子中发挥了调节作用，并且与AKT转导密切相关。大黄素可能通过调节AKT转导的内皮细胞的不分泌，从而扮演保护糖尿病内皮细胞并降低胰岛素抗性的作用。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

李亚佳、谢春燕贡献相等。

致谢

这项工作得到了2017年湖南省技术创新指导方案临床医疗技术创新指导项目（2017SK50510，第97号）的资助的经济补助金。

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