文摘
甲状腺功能减退是一种常见的疾病,其分子机制仍需进一步研究。赖氨酸succinylation发现参与各种代谢过程与甲状腺功能减退有关。我们进行定量分析在甲状腺赖氨酸succinylome hypothyroxinemia的老鼠,这是诱导通过高脂饮食的政府。总的来说,129个差异表达蛋白质量化。表达下调蛋白质丰富的甲状腺激素合成和甲状腺激素信号通路,主要定位在线粒体。此外,172年104蛋白赖氨酸succinylation地点均明显改变。减少succinylated蛋白质参与不同的代谢途径和线粒体主要是局部的。最后,人类正常的线粒体耗氧速率测量甲状腺上皮细胞进一步验证赖氨酸succinylation的角色。线粒体细胞耗氧率明显减弱,棕榈酸(所有对待 ),和时变化逆转细胞治疗与棕榈酸和(所有desuccinylase抑制剂在一起 )。因此,我们推测,甲状腺差异表达蛋白质和改变了mitochondria-mediated succinylation水平发挥着潜在的作用,能量代谢的脂食源性hypothyroxinemia鼠模型。
1。介绍
甲状腺激素、合成和分泌甲状腺,起着至关重要的作用在正常发展,分化,和人类的新陈代谢1]。在甲状腺内稳态扰动可能会导致一些甲状腺疾病如甲状腺功能减退。甲状腺功能减退是一个紊乱的内分泌系统,结果从低生产甲状腺激素甲状腺素(TT4)甲状腺。这导致代谢障碍因为甲状腺激素是一个glucose-lipid新陈代谢和能量稳态的重要调节器。甲状腺功能减退也会导致增加的浓度促甲状腺素(TSH)通过负反馈hypothalamus-pituitary-thyroid轴(2]。原发性甲状腺功能减退,甲状腺本身的功能障碍引起的甲状腺功能减退的主要原因(3]。成人甲状腺功能减退的发生往往是微妙的呈现了一系列非特异性症状。然而,严重的治疗甲状腺功能减退可能导致可怜的预测,如心力衰竭、精神错乱,甚至昏迷(3]。到目前为止,治疗甲状腺功能减退可能采取的措施包括改善症状和预防不良事件。毫无疑问,甲状腺功能减退的地方一个巨大的经济负担,极大地降低了患者的生活质量。因此,有必要研究发病机制和探索新的治疗策略。
转译后的修改(天车),指共价修改引入氨基酸的蛋白质酶或nonenzymatically,增加蛋白质组多样性机制是关键,对生物功能起到至关重要的作用在各种各样的物种(4- - - - - -7]。天车调节蛋白通过蛋白水解解理监管子单元属性,添加修改组一个或多个氨基酸,或整个蛋白质的降解,从而确定活动状态,本地化,营业额,和与其它分子之间的相互作用8]。
赖氨酸作为最常见的氨基酸残基posttranslation修改,对蛋白质结构的形成和监管至关重要的蛋白质功能。赖氨酸残基可接受各种多功能天车,如甲基化、乙酰化、生物素酰化、泛素化,ubiquitin-like修改,propionylation, butyrylation [9- - - - - -13]。这些赖氨酸天车扮演了一个重要的角色在细胞生理和病理,从而影响细胞生物学的几乎所有方面和发病机理14- - - - - -17]。赖氨酸succinylation是一种重要的蛋白质转译后的修改,可以发生在胞质核和线粒体蛋白质非酶的化学反应(18)和酶催化反应。前succinylation产生直接从琥珀酰辅酶,它可以生成柠檬酸循环,脂类,氨基酸代谢,酶succinylation赖氨酸succinyltransferase的赖氨酸发生。赖氨酸succinylation已被确认和验证天车与参与的一种重要形式多样化与甲状腺疾病相关的细胞功能(19- - - - - -21]。Cinzia Puppina等人发现的赖氨酸乙酰化水平位置9-14 H3组蛋白(H3K9-K14ac)明显高于在滤泡腺瘤,甲状腺乳头状癌、滤泡性甲状腺癌和未分化癌比正常组织(22]。安德里亚Henze等人报道,氧化的修改Cys10似乎影响T3的绑定转体基因和调节甲状腺激素的敏感机制提供可用性(23]。赖氨酸succinylation甲状腺疾病的作用仍然是未知的,需要进一步调查。
我们先前的研究[24,25)发现,过量摄入膳食脂肪诱导血清TT下降4和英国《金融时报》4浓度与血清TSH浓度升高,以及甲状腺形态和血脂变化异常,提供证据的相关性脂质和器官功能,以及一个新的前景了解甲状腺功能减退的发病机制。然而,潜在的分子机制尚不清楚,需要进一步的调查。
液体chromatography-tandem质谱-(质/ MS)为基础的蛋白质组学分析已成为一个强大的工具为研究疾病机制由于其高吞吐量和准确性(20.,26,27]。在目前的研究中,探讨在hypothyroxinemia天车扮演了一个角色,我们通过免疫印迹检测到四种类型的赖氨酸酰化,包括succinylation crotonylation 2-hydroxybutyrylaion, malonylation。中可观察到显著改变赖氨酸succinylation HFD组相对于对照组。然后,我们进行label-free-based定量分析甲状腺组织的全球蛋白质和赖氨酸succinylome HFD-induced甲状腺功能障碍大鼠模型中使用质/ MS方法。开展一系列的生物信息学分析来探索hypothyroxinemia的潜在的分子机制和赖氨酸succinylation的参与。我们旨在探索之间的联系赖氨酸succinylation和甲状腺功能减退,并评估潜在的诊断生物标记和治疗靶点。
2。材料和方法
2.1。实验设计和工作流程
我们比较的蛋白质表达谱和succinylation水平之间的大鼠甲状腺组织高脂肪饮食(HFD)研究小组和饮食(CD)对照组。实验过程包括四个关键步骤如下:(1)建立和样品收集在hypothyroxinemia鼠模型中,如前所述[24,25];(2)label-free-based定量蛋白质组学,包括蛋白质提取,胰蛋白酶消化、高效液相色谱法(HPLC)分馏,和赖氨酸succinylated肽的免疫抗体亲和富集;(3)质/ MS分析;和(4)生物信息学分析。三个生物复制进行全球蛋白质组和succinylome分析。过程详细描述以下段落。
2.2。动物模型和道德的声明
26雄性SD大鼠6(北京重要河流实验动物技术有限公司,北京,中国)重190 - 210克被喂食实验动物中心山东省级医院,山东大学。老鼠维持在一个恒定的温度和湿度,并呈现一个12 h: 12 h light-darkness周期。老鼠被随机和同样分为CD对照组(n= 13)和HFD研究小组(n= 13)(详细成分脂肪酸的饮食补充表所示S1)。这些动物体重24周的周和美联储。在24th一周喂,所有老鼠都牺牲前禁食12小时。动物伦理委员会批准的所有实验协议是山东省级医院,山东大学。
2.3。血清甲状腺功能参数分析
血清TT4英国《金融时报》,4年底,TSH浓度测量实验。通过下腔静脉穿刺收集血液样本。血清TT4英国《金融时报》,4,TSH测定用ELISA试剂盒(CUSABIO,武汉,中国)。所有程序都按照指令进行由制造商提供。
2.4。蛋白质的提取和胰蛋白酶消化
甲状腺组织样本从4 4和5老鼠池三个生物复制,分别。每个样本细胞被液氮磨成粉,然后转移到一个5毫升离心管。添加四卷后裂解缓冲(8 M尿素,1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒,3μM TSA, 50 mM南,2毫米EDTA)到离心管,声波降解法在冰上进行三次。在4°C在12000 g离心后10分钟,剩下的残骸被移除,上层的收集。最后,BCA试剂盒(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)是用来确定蛋白质浓度根据制造商的指示。
在准备消化蛋白质的解决方案是降低(5毫米二硫苏糖醇,30分钟,56°C)和烷基化(11毫米碘乙酰胺,15分钟,室温在黑暗中)。尿素浓度被稀释,通过添加100毫米NH小于2米4HCO3。最后,胰蛋白酶(Promega公司,菲奇堡,威斯康辛州,美国)在1:添加50 enzyme-to-substrate质量比和孵化隔夜第一消化,紧随其后的胰蛋白酶在1:100年enzyme-to-substrate质量比为一个额外的4 h消化。
2.5。高效液相色谱法分离和浓缩基于抗体的亲和力
胰蛋白酶的肽被分离成若干分数减反相高效液相色谱使用安捷伦300扩展使用C18柱(5μ米粒子,4.6毫米ID, 250毫米长度)。简要来说,肽最初分为60分数梯度8% - -32%的乙腈(ACN, pH值9.0)超过60分钟。后来,肽分数被合并成4分数和干真空离心法。
浓缩是由免疫沉淀反应实现按照先前的研究[28,29日]。简单,丰富lysine-succinylation修改肽,胰蛋白酶的肽溶解在NETN缓冲区(100毫米氯化钠,1毫米EDTA, 50 mM Tris-HCl, NP-40 0.5%,和pH值8.0)然后孵化隔夜水洗antisuccinyl赖氨酸抗体琼脂糖珠(catlog没有。PTM402;天车生物、杭州、中国)在4°C温柔的颤抖。最后,结合肽从珠子筛选了0.1%三氟乙酸(组织),结合,vacuum-dried。质/ MS分析之前,获得肽与C18 ZipTips脱盐(微孔)根据制造商的指示。
2.6。质/ MS检测,数据库搜索和量化分析
胰蛋白酶的肽是resuspended在溶剂(ACN甲酸0.1%,2%),然后直接加载到一个反相分析柱(15厘米的长度,75μm ID;天车生物、杭州、中国)。恒流量700 nl /分钟成立EASY-nLC 1000 UPLC系统,梯度组成的9% -25%溶剂B(0.1%甲酸90% ACN) 38分钟,25% - -40%的14分钟,4分钟攀升至80%,持有80%在过去的4分钟。
缩氨酸受到nanospray电离(NSI)来源,其次是串联质谱分析(MS / MS)问ExactiveTM+(热费希尔科学)耦合在线ultraperformance液相色谱仪(UPLC)。完整的肽和succinylated肽检测Orbitrap在分辨率为70000 m / z扫描从350年到1800年不等。肽被选择使用28%规范化碰撞能量(指标)的MS / MS分析,使用Orbitrap和离子碎片被发现在17500年的一项决议。(DDA)视数据采集程序之间交替扫描女士随后15和20 MS / MS扫描收集前15和20肽和succinylated肽前体离子高于阈值离子计数10000女士调查的扫描与30.0和15.0年代动态除外,分别。喷雾电压为2.1伏特。自动增益控制(AGC)是用来防止过度充盈的离子阱和50000离子积累MS / MS谱的生成。最大注射时间设置为200毫秒,100毫秒肽和succinylated肽。
后天MS / MS数据处理和分析MaxQuant搜索引擎(v.1.5.2.8)。串联质谱对UniProt鼠数据库搜索序列(29795)连接常见污染物的蛋白质序列(如血红蛋白、角蛋白和乳球蛋白)和反向诱饵数据库。胰蛋白酶/ P被指定为解理酶允许两个失踪的分裂,以及五个修改/肽。质量误差设置为20 ppm的搜索和5 ppm的主要寻找前体离子和0.02 Da碎片离子。Carbamidomethyl半胱氨酸是指定为一个固定的修改,而乙酰化作用的蛋白质N终端和氧化对蛋氨酸指定为变量的修改。succinylome分析,succinylation赖氨酸也设置为变量的修改。错误发现率(罗斯福)阈值识别的多功能天车的水平,多肽,蛋白质被调整到0.01。肽的最小长度设置为7个氨基酸残基。
每个样本的定量值获得的三个复制LFQ强度。第一步是计算两个样品之间的差异蛋白质的浓度。首先,计算每个样本的定量值的平均价值在多个复制,然后,计算两个样本之间的平均值的比值。这个比例是作为最后的定量。正常化succinylated肽,赤裸的强度succinylated肽是首先测量,然后除以相应的蛋白强度(30.]。计算的重要值两个样本之间的浓度差,每个样本的相对定量值作为log2变换(这样数据符合正态分布),和价值是由两个示例计算的双尾t以及方法。值< 0.05和蛋白质比> 1.5被认为是upregulation。值< 0.05和蛋白质比例< 1/1.5。差别被认为是对这些
2.7。生物信息学分析
原始的蛋白质组和succinylome质谱数据存入ProteomeXchange (https://www.ebi.ac.uk/pridePXD012814)和标识符。基因本体论(去)分析来源于UniProt-GOA数据库(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)和注释(http://geneontology.org/)分类识别蛋白质分为三类:生物过程,细胞组件,和分子的功能。截止绝对的褶皱变化≥1.5是用来确认差异表达蛋白质。所有量化蛋白质或succinylated蛋白质的功能通路被执行《京都议定书》全书注释的基因和基因组(KEGG)分析(http://www.genome.jp/kegg/)。进行功能富集分析,揭示了各鉴定蛋白质差异表达蛋白质丰富,succinylated蛋白质。当进行生物信息学分析,小动物——一张长有确切概率法进行,和纠正值< 0.05被认为是显著的。蛋白质相互作用分析字符串(http://string-db.org/)使用微分蛋白质和succinylated蛋白质丰富的重大变化作为输入。所需的信心得分是设置为> 0.700高度自信的交互。结果可视化使用Cytoscape包。
2.8。细胞培养和试剂
人类正常的甲状腺上皮细胞系Nthy-ori3-1 (ECACC,威尔特郡,英国)培养rpmi - 1640年(Gibco热费希尔科学,Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)补充10%胎牛血清(的边后卫;ExCell生物、上海、中国),青霉素(100国际单位/毫升),链霉素(100国际单位/毫升),谷酰胺(2毫米)37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司2。
测量的线粒体功能,简单地说,棕榈酸(PA)从50 mM股票的解决方案是在2.5毫米BSA-PBS温暖和新鲜稀释。稀释PA的解决方案是温暖55°C水浴。然后,爸爸和烟酰胺(南)的解决方案是添加到文化,分别。细胞被分成三个组根据不同治疗(NC组、PA组和PA +南集团)。
免疫沉淀反应,细胞分成四组(对照组,不结盟运动组织,PA集团和不结盟运动+ PA组)。南、PA和不结盟运动+ PA组处理,PA,分别南和PA。所有试剂都是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,美国),除非另有说明。
2.9。线粒体OCR的测量
OCR的测量是执行使用一个XF96分析仪(海马生物科学、美国)根据制造商的指示。总之,约7×103每口井的细胞被播种到海马XF96细胞培养微型板块(海马生物科学、美国)和培养24小时。经过政府的PA(0.2毫米)和南(10毫米),这些细胞被培养为另一个24小时。然后,微型板块是low-buffered孵化和nonbicarbonated试验介质(XF基地中谷氨酰胺和2毫米,1毫米丙酮酸钠,葡萄糖和25毫米)non-CO2孵化器在37°C 1小时。然后,ocr测量在96年以一个XFe细胞外流量分析仪(海马生物科学)3时间3分钟混合在每个周期。结果归一化到相应的总蛋白浓度。
2.10。免疫沉淀反应
细胞培养24小时。经过政府的PA(0.2毫米)和南(10毫米),这些细胞被培养为另一个24小时。然后,细胞被洗了三次冰冷冰冷的PBS和细胞溶解1毫升里帕裂解缓冲(50毫米三、150 nM氯化钠1%钠脱氧胆酸盐,triton - x - 100 1%, 1毫米EDTA, 0.1% SDS,氟化钠10毫米,1毫米钠原钒酸盐,1毫米PMSF和10毫米南)。从板块细胞被刮掉,细胞溶解产物离心机在12000克15分钟。收集上清液,由BCA试剂盒和蛋白质浓度测定。500年μ总蛋白用于IP的g。蛋白质主要抗体孵育过夜在4°C与温和的摇摆。Immunocomplexes免疫沉淀反应使用蛋白质A-agarose珠子。免疫沉淀反应是洗四次裂解缓冲。最后,每个珠粒resuspended在20μl 2×减少加载缓冲区(130毫米三pH值6.8,4% SDS, 0.02%溴酚蓝,20%的甘油,和100毫米德勤)在100°C,煮5分钟。样本储存在−80°C,其次是西方墨点法。
2.11。西方墨点法
等量的蛋白质来自不同样本受到8% sds - page,其次是electrotransfer从凝胶聚乙二烯二氟化物膜(微孔)。膜被5% (w / v)脱脂牛奶TBST和孵化一夜之间在4°C盘antisuccinyl赖氨酸抗体(1:1000稀释;天车生物学实验室),anti-sirt5抗体(1:1000稀释;春秋国旅),anti-GAPDH抗体(1:5000;Proteintech, 66009 - 1 - l g)。主要抗体后,与相应的二次抗体膜被孵化1:5000稀释1小时在室温下。免疫复合物检测使用一个Amersham成像仪600(通用电气公司)。相同的膜与anti-GAPDH reincubated抗体。GAPDH蛋白被用作加载控制总蛋白质。
2.12。统计方法
提出了定量数据均值±SEM和处理使用GraphPad Prism 6.0 (La Jolla、钙、美国)和SPSS 22.0版(美国芝加哥,IL)。单向方差分析之后,土耳其的事后测试进行多重比较。一个值< 0.05被认为是显著的,当比较HFD甲状腺样品和相应的CD甲状腺样本。
3所示。结果
3.1。HFD-Induced Hypothyroxinemia
观察甲状腺功能,我们测量血清TT4英国《金融时报》,4和TSH。如图1HFD集团展出TT的浓度下降4( )和英国《金融时报》4( )与TSH浓度升高( )。这些结果表明,hypothyroxinemia鼠模型的建立是成功的。
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3.2。一般特征的定量蛋白质组大鼠甲状腺组织
Label-free-based定量蛋白质组学进行了使用高效液相色谱法分离和高分辨率质/ MS分析。成对的皮尔森相关系数显示足够的再现性实验(补充图S1A补充材料的综合图像分析)。共有3869个蛋白质,其中2982个蛋白质定量(补充表S2)。差异表达蛋白质与叠化阈值过滤> 1.5 (值< 0.05)upregulation和比例< 1/1.5 (甲状腺的差别值< 0.05)对这些老鼠HFD相对于控制。共有129个蛋白质被量化为两组之间的差异表达蛋白质,包括69调节和60表达下调的蛋白质,由火山表现出情节(图2(一个))。然后,这些差异表达蛋白质注释通过执行密集的生物信息学分析。
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与蛋白质图谱比较大鼠甲状腺蛋白质组数据公开数据库,可以找到一些标志蛋白在甲状腺组织在我们的检测结果(图2 (b))。例如,甲状腺球蛋白(Tg)是所有中最丰富的蛋白质在女士发现,作为底物合成的甲状腺激素,甲状腺素(T4)和三碘甲状腺氨酸(T3)。甲状腺过氧化物酶也是高水平表达,参与甲状腺激素生物合成的途径。其他特定蛋白质如碘化酪氨酸deiodinase 1和降钙素相关基因肽2蛋白质图谱甲状腺数据库存在于我们的蛋白质检测表(补充表S2)。所有这些证明我们质谱的蛋白质组学资格,并量化是可信的。
生物过程和分子功能富集分析进行量化蛋白质。生物过程浓缩分析表明,最重要的浓缩是代谢过程,包括单个有机体的代谢过程中,小分子的代谢过程,organonitrogen化合物代谢过程(图2 (c))。为分子功能浓缩,保利(A) RNA绑定,蛋白结合,和钙粘蛋白绑定参与信息粘附是三大项目。
3.3。浓缩的分析差异表达蛋白质
富集分析识别方面,KEGG途径,极大地丰富和域。
去分析进行描述的生物过程和分子功能差异表达蛋白质。如数据所示3(一个)和3 (b)蜂窝组件中,蛋白质的表达本地化核糖体,核糖体亚基增加,而蛋白质本地化和线粒体atp酶的表达复杂的显著下降。在分子功能,核糖体的结构成分和结构分子活动调节,而atp酶活性表达下调。在生物过程类别,一些代谢过程的调节蛋白明显丰富(包括肽,细胞酰胺和高分子代谢),生物合成的过程(如肽、酰胺、高分子和有机物质生物合成),和翻译。相比之下,一些表达下调的蛋白质丰富的代谢过程,包括硫氮循环和新陈代谢。
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KEGG通路富集分析也进行进一步调查这些差异表达蛋白的功能。一致的结果去分析,结果表明,核糖体途径是最突出的强化途径调节蛋白(图3 (c))。同时,表达下调的蛋白质被观察到丰富的甲状腺激素信号通路和甲状腺激素合成,表明这些通路可能发挥重要作用的发展hypothyroxinemia(图3 (d))。
3.4。的一般特征量化Succinylome大鼠甲状腺组织
Label-free-based定量赖氨酸succinylome使用基于抗体亲和富集分析,其次是质/ MS分析。总共685 succinylation网站250年蛋白质,其中621 succinylation网站229蛋白质是量化和归一化蛋白质组数据(补充表S3)。的量化比例> 1.5 (值< 0.05)upregulation阈值和< 1/1.5 (阈值,差别值< 0.05),对这些基因的172 succinylation网站对应104蛋白质显示不同succinylation水平在三个重复实验(调节蛋白质,5日succinylated网站165下调succinylated网站99个蛋白质,和HFD组与CD组)相比,表现出的火山地块(图4(一))。平均肽质量误差< 10 ppm,表明质量精度高的女士(补充图数据印地补充材料的综合图像分析)。最确定的长度肽是8-20氨基酸残基(补充图就是S1C补充材料的综合图像分析)。
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与CD组相比,大多数赖氨酸succinylation HFD组中不同蛋白质进行下调变化,此外,这些succinylated蛋白位于线粒体ATP合酶等复杂、异柠檬酸脱氢酶(IDH2)。然而,一些赖氨酸网站succinylation调节甲状腺球蛋白(图4 (b))。生物过程浓缩分析显示,三羧酸循环、脂肪酸机会使用酰coa脱氢酶,氧化还原过程中,脂肪酸机会,脂质稳态五大重要物品(图4 (c))。分子功能富集分析(图4 (d))表明,fatty-acyl-CoA绑定和相关代谢显著强化。
3.5。浓缩的分析不同改变Succinylated蛋白质
如数据所示5(一个)和5 (b)蜂窝组件之间,表达下调succinylated蛋白质主要展出三羧酸循环(柠檬酸循环)酶复杂。最丰富的分子功能是连接酶的活动。在生物过程类、蛋白质相关系统的过程,对脂质调节succinylated中丰富蛋白质,而蛋白质与柠檬酸代谢过程、细胞呼吸,三羧酸循环,柠檬酸代谢过程,能量推导有机化合物的氧化,有氧呼吸是丰富的表达下调succinylated蛋白质。
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KEGG通路富集分析表明,柠檬酸循环(柠檬酸循环)是最丰富的途径中表达下调succinylated蛋白质。此外,propanoate新陈代谢和丙酮酸代谢相关通路也丰富(图5 (c))。蛋白质域分析显示,大大丰富了前两届生物素/ lipoyl附件和单一混合图案(图5 (d))。
3.6。差异蛋白质和PPI Succinylated蛋白质分析
为了更好地理解赖氨酸succinylation的功能和甲状腺功能减退病理学、微分蛋白质和蛋白质succinylated受到(PPI)蛋白质相互作用网络分析使用字符串数据库(视力11.0)。字符串定义了度量称为“信心得分”来定义交互信心;我们获取的所有交互有信心得分≥0.7(高信心)。蛋白质相互作用网络生成与马尔可夫集群和集群(制程)算法(31日),然后使用Cytoscape可视化程序(视力3.7)。
微分蛋白质净分析表明,核糖体蛋白质相互作用是高度聚集,和PPI网络集群的蛋白质具有调节coexpression(图6(一))。微分succinylated蛋白质交互网络(图6 (b))显示三个功能集群:柠檬酸循环(柠檬酸循环),ATP合酶复杂,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸退化,它们都表达下调succinylation。
(一)
(b)
3.7。线粒体OCR的测量
进一步研究脂肪酸的作用在线粒体的功能,避免成立因素在活的有机体内,OCR代表水平的线粒体功能测定正常人甲状腺上皮细胞。如图7线粒体相关ocr基底呼吸,ATP生产,最大呼吸由棕榈酸暴露(所有明显减弱 ),和时变化逆转细胞治疗与棕榈酸和(所有desuccinylase抑制剂在一起 )。
(一)
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3.8。验证的蛋白质Succinylation水平
确定蛋白质的变化succinylation细胞系,我们进行蛋白质免疫沉淀反应化验加上免疫印迹检测异柠檬酸脱氢酶2 (IDH2) succinylation水平。IDH2被称为三羧酸循环中的一个关键酶。Nthy-ori3-1细胞治疗与不结盟运动或PA或不结盟运动和PA,分别。结果表明,IDH2确实succinylated,抑制了其succinylation PA治疗。尽管IDH2 succinylation并没有显示出明显的改变不结盟运动,PA和不结盟运动治疗使IDH2 succinylation水平与PA治疗相比(图中恢复过来8)。
4所示。讨论
在本研究中,HFD-induced hypothyroxinemia鼠模型构造根据我们先前的研究[24,25]。过量摄入膳食脂肪诱导显著甲状腺功能障碍和hypothyroxinemia老鼠通过减少甲状腺激素的表达synthesis-related蛋白质,提供证据的相关性脂质和器官功能。然后,我们采用定量蛋白质组学策略和质/ MS-based浓缩调查全球蛋白质和succinylation概要文件在甲状腺组织。我们确定了129个差异表达蛋白质和172个差异表达succinylation网站,其中一些蛋白质和succinylation网站本地化相关的线粒体和线粒体功能。确认改变线粒体呼吸活动,OCR进一步用来验证质/女士的结果。
蛋白质组数据证明了代谢过程的变化HFD-induced hypothyroxinemia鼠模型。别人等人提出了一个proteome-wide研究HFD-fed老鼠和检测到百分之五十四的差异表达蛋白质参与代谢过程(32]。此外,杨等人发现差异表达蛋白质的代谢途径可能是有关HFD-induced雄性老鼠的生育能力下降(33]。此外,你等人发现颅内和颅外动脉粥样硬化的蛋白质表达水平HFD-fed兔子是不同的,这有利于诊断和治疗脑动脉硬化(34]。这些蛋白质组学研究提供了分子对HFD-induced病理学的理解和识别潜在目标为代谢综合征治疗的发展。因此,我们推测,HFD可能在甲状腺功能减退的形成起着重要的作用[35,36]。
最近的研究集中在蛋白质天车识别几种疾病的潜在机制。各种类型的天车如磷酸化、赖氨酸乙酰化,泛素化,propionylation, crotonylation, succinylation被发现与质谱技术的发展7,12,37]。特别是多功能天车的作用在调节细胞能量代谢已经证明。调查在hypothyroxinemia天车扮演了一个角色,我们通过免疫印迹检测到四种类型的赖氨酸酰化,包括succinylation crotonylation 2-hydroxybutyrylaion, malonylation。中可观察到显著改变赖氨酸succinylation HFD组相对于对照组。赖氨酸succinylation,作为一个新发现的天车在蛋白质,广泛的在不同的生物体和影响各种代谢途径(38- - - - - -41]。因此,我们调查的定量蛋白质succinylome HFD-induced hypothyroxinemia鼠模型,探索可能的目标角色的赖氨酸succinylation HFD-induced hypothyroxinemia。
在succinylome层面,我们的数据表明赖氨酸succinylation和mitochondria-mediated代谢调控之间的关系密切。我们都知道,线粒体参与氨基酸的代谢,脂肪、胆固醇、类固醇和核苷酸。也许,最重要的是,线粒体在细胞能量代谢发挥基础性作用(包括脂肪酸β氧化呼吸链),不同的细胞功能和发育过程的关键(35,36]。最近人体肾细胞癌组织中的蛋白质succinylome研究表明,糖酵解途径可能是通过赖氨酸succinylation监管,发挥潜在的作用,肾细胞癌进展(42]。此外,歌曲等人发现,柠檬酸循环和磷酸戊糖途径是能量代谢的潜在机制在人类胃癌,这可能是通过赖氨酸succinylation监管他们的核心酶(43]。此外,众所周知,甲状腺激素参与能源监管和代谢过程,和甲状腺激素体内平衡的丧失是高度相关的各种甲状腺障碍包括甲状腺功能减退,甲状腺机能亢进44,45]。因此,赖氨酸succinylation可能发挥了重要作用在线粒体功能和能量代谢HFD-induced hypothyroxinemia鼠模型(38- - - - - -41]。
脂肪酸,甘油三酸酯的主要组件,发现内容增加甲状腺组织HFD-induced鼠模型的先前的研究。进一步研究脂肪酸的作用在线粒体功能,避免成立因素在活的有机体内脂肪酸,用于治疗甲状腺上皮细胞正常的人类,从而减少succinylation水平。线粒体功能被调查在体外在目前的研究。棕榈酸,如最常见的饱和脂肪酸在动物,植物,微生物,应用。烟酰胺(南),SIRT5的抑制剂,据报道,催化消除succinylation [46- - - - - -48),然后被棕榈acid-stimulated细胞抑制desuccinylase sirtuins蛋白的活性。线粒体OCR被用来检查甲状腺上皮细胞的线粒体功能正常的人类改变了succinylation水平。结果在体外按照结果在活的有机体内,进一步表明脂肪酸可能直接影响能量代谢和甲状腺功能减退的形成起着重要的作用。
我们所知,目前的研究是第一次调查的succinylome HFD-induced hypothyroxinemia鼠模型。Succinylation水平显示在许多差别明显对这些重要的蛋白质,主要定位在线粒体。我们假设重大succinylation下调线粒体ATP合酶复杂,和线粒体IDH2蛋白质更可能伴随着沮丧三羧酸循环活动因为succinylation取决于细胞内琥珀酰辅酶的水平,和琥珀酰辅酶可以生成柠檬酸循环的脂质,和氨基酸代谢succinylation可能发生非酶的化学反应。
5。结论
这项研究揭示了重要的表达下调赖氨酸succinylated蛋白主要定位在线粒体和共现抑郁线粒体活动HFD-induced hypothyroxinemia鼠模型。这些结果扩大我们的理解底层机制的甲状腺功能减退的进展和提供新途径的探索对甲状腺功能减退的潜在治疗策略。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
信息披露
本文的摘要是ENDO 2019摘要-内分泌学会的第101届会议。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢ENDO 2019摘要- 101内分泌学会的年度会议上发布的抽象。作者感谢Jingjie天车生物学实验室的技术援助(杭州)实验。这项研究得到了国家自然科学基金(81430020,81430020,81600604,81300644,和81670720)和中国山东科学技术委员会(ZR2016HB07)。
补充材料
补充表S1:脂肪酸组成的饮食。补充图S1:皮尔逊相关系数和质量控制的MS / MS数据的验证。补充表S2:所有带注释的蛋白质识别和差异表达蛋白质的定量蛋白质组大鼠甲状腺组织;S2: HFD组和S1: CD组,每组三个生物学重复。补充表S3:所有注释succinylated蛋白质和显著差异赖氨酸succinylation定量succinylome大鼠甲状腺组织。S2: HFD组和S1: CD组,每组三个生物学重复。(补充材料)