文摘

背景。目前治疗术后hypoparathyroidism缺点,例如多次血液监测剂量调整,不确定的长期疗效和重组甲状旁腺激素疗法的高价格。脂肪干细胞能够接受脂肪形成的体外成骨分化和被认为是小说parathyroid-like细胞的来源,但这个想法缺乏理论基础和可行性。我们旨在建立一个协议区分脂肪中提取干细胞治疗hypoparathyroidism parathyroid-like细胞。材料/方法。脂肪干细胞的分离和纯化,腹股沟脂肪组织的雄性sd大鼠中。脂肪形成的分化和成骨分化的细胞被油红O和茜素红染色,分别。脂肪干细胞被声波刺猬(嘘)和刺激激活素a .脂肪中提取干细胞的分化parathyroid-like细胞检测证实的甲状旁腺激素和甲状旁腺的相关标记。结果。脂肪干细胞被成功分离和纯化大鼠脂肪细胞。脂肪形成的和脂肪中提取干细胞的成骨分化能力测定。嘘,激活素刺激甲状旁腺素分泌的脂肪中提取干细胞,显著增加calcium-sensing受体的表达(CaSR)、甲状旁腺激素,神经胶质细胞缺失的同族体2 (GCM2)细胞时间和浓度的方式。结论。我们成功地鼠脂肪中提取干细胞分化成parathyroid-like细胞,从而治愈hypoparathyroidism铺平了一条新的途径。

1。介绍

甲状腺癌的发病率已成为流行在世界范围内,包括中国(1,2]。并发症手术切除甲状旁腺是罕见的,但可能偶尔发生甲状腺和甲状旁腺手术后。永久和临时postthyroidectomy低钙血症的发生率是0 - 3%和19 - 38%,分别为(3]。不管它是否无意或治疗,丢失或损坏的甲状旁腺血液运输导致永久或临时hypoparathyroidism和因此可能导致低钙血症。

Hypoparathyroidism结果从低甲状旁腺素的水平。甲状旁腺素的主要激素作为钙稳态,包含84个氨基酸,由甲状旁腺分泌。治疗术后hypoparathyroidism是具有挑战性的。虽然最近的研究已经证明的证据使用合成甲状旁腺素替代疗法的疗效,钙和维生素D制剂,限制依然存在,例如多次血液监测调整剂量,半衰期短,治疗后的并发症(4,5]。因此,更好的治疗策略应该重建帮助患者术后hypoparathyroidism和潜在的不利影响降到最低。长期的移植,生物相容性释放组织被认为是理想的hypoparathyroidism激素替代疗法。

干细胞是一类具有自我更新的细胞和分化潜能。最近,一直尝试向parathyroid-like细胞分化的干细胞。宾汉等人首次报道的成功分化胚胎间充质干细胞成parathyroid-like细胞激活素的影响下(6]。伍兹Ignatoski等人从胸腺细胞和胚胎分化parathyroid-like细胞间充质干细胞在儿童通过激活素A和声波刺猬(嘘)感应7,8]。格林等人用苯丙酸诺龙、小杯和sb - 431542分化胚胎间充质干细胞,诱导多能干细胞到内胚层,这可能进一步分化成parathyroid-like细胞嘘的作用下或FGF8(纤维母细胞生长因子8)(9]。公园等人成功地分化tonsil-derived间充质干细胞成PTH-releasing细胞激活素A和嘘的影响下(10]。相反,脂肪干细胞(ADSCs)是人类脂肪组织丰富,容易获得。被假定ADSCs细胞可以分化为甲状旁腺,可治疗hypoparathyroidism [11]。此外,我们已经成功地分离和纯化ADSCs。在此,我们打算探索差异化ADSCs成parathyroid-like细胞的协议。

2。材料和方法

2.1。鼠ADSCs隔离和净化

所有实验后程序制度审查委员会批准中国医科大学(没有。af - og - 03 - 1.1 - 02)。每个实验重复独立至少三次。总共18特定无菌(SPF)还是雄性sd大鼠中被戊巴比妥钠腹腔注射麻醉和牺牲。腹部是用75%的酒精消毒。通过低横向切口腹腔开放。收获的大鼠脂肪组织是由脂肪切除通常通过腹股沟脂肪垫的解剖。收获脂肪组织被反复使用磷酸盐(PBS)和血管等组织被移除。其余组织切成大约1毫米×1毫米×1毫米,在0.075%的I型胶原酶消化摇床在37°C为30分钟。同等体积的消化了high-glucose杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM; Hyclone, Logan, USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). After centrifugation at 309x 与200年10分钟,沉淀过滤网格屏幕,然后处理红细胞裂解缓冲为3分钟。的反应是停止high-glucose DMEM包含10%的边后卫。与PBS冲洗后,细胞数和播种密度的3×106细胞每道菜(75厘米2)。细胞培养在孵化器有限公司为5%2在37°C 48 h。80%的融合,细胞与0.25%胰蛋白酶消化为通道1分钟,用一个通道执行每48 h。第三段ADSCs收集干细胞的决心。

2.2。脂肪形成的分化和识别

细胞培养在低糖DMEM包含10%的边后卫,1μmol / L地塞米松(σ,圣路易斯,密苏里州),200年μmol / L消炎痛(σ,圣路易斯,密苏里州),0.5更易/ L 3-isobutyl-1-methylxanthine(σ,圣路易斯,密苏里州)和10μmol / L胰岛素(σ,圣路易斯,密苏里州)。媒介改变了每2天,去的时间是7日,14日,并为每组21天。脂肪形成的分化的变化观察使用油红O染色在倒置显微镜下。

2.3。成骨分化和识别

细胞培养在低糖DMEM包含10%的边后卫,0.1μmol / L地塞米松(σ,圣路易斯,密苏里州),50μmol / L抗坏血酸(σ,圣路易斯,密苏里州),10更易/ Lβ甘油磷酸酯(σ,圣路易斯,密苏里州)和0.01μmol / L维生素D3(σ,圣路易斯,密苏里州)。媒介改变了每3天,成骨分化的持续时间是7日,14日,并为每组21天。成骨分化的变化观察用茜素红S染色在倒置显微镜下。

2.4。协议区分ADSCs成Parathyroid-Like细胞

Fifth-passage细胞培养在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) -1640(美国洛根Hyclone)中含有5%的边后卫和100 ng / mL嘘或25 ng / mL, 50 ng / mL,或75 ng / mL激活素a以下指标7点检查、14和21天:甲状旁腺素水平在中calcium-sensing受体(CaSR)、胶质细胞缺失的同族体2 (GCM2),甲状旁腺素的细胞。

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

培养基上清液收集和甲状旁腺素浓度测定用甲状旁腺素检测酶联免疫试剂盒(Youersheng,武汉,中国,猫。不。CEA866Ra)根据制造商的协议。光密度(OD)值在450纳米检测使用一个微型板块读者(BioTek ELx800, BioTek, Winooski, VT,美国)。

2.6。实时聚合酶链反应

实时PCR用于量化Casr,Gcm2,甲状旁腺素信使rna水平。总RNA提取细胞收集和细胞溶解的试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。提取的RNA, OD260 / OD280吸光度比值在1.9和2.0之间,被用来准备互补DNA(互补)使用逆转录酶工具包(PrimeScript RT试剂盒;豆类、大连、中国)。互补脱氧核糖核酸合成协议遵循制造商的指令在37°C,持续15分钟,其次是85°C,持续5秒,ABI 9700 GeneAmp PCR系统(应用生物系统公司,生活技术,大岛,纽约,美国)。成绩单是量化LightCycler 480实时PCR系统(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)使用SYBR预混料交货Taq工具包(豆类)。

2.7。西方墨点法

西方墨点法进行量化CaSR, GCM2,甲状旁腺素蛋白质水平。培养细胞都用冰冷的PBS缓冲含有蛋白酶抑制剂和细胞溶解消散鸡尾酒(KGP 250工具包,凯基生物生物技术,南京,中国)30分钟在冰上。蛋白质水平量化使用bicinchoninic酸(BCA)方法。对于每个测试,30岁µ每克蛋白质样本用于免疫印迹。总蛋白质是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳分离。转移是由恒流100 mA 60分钟使用聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔,Billerica的)。非特异性结合被使用5%的脱脂牛奶在室温下2 h。然后,一夜之间,膜被在4°C的环境与主要抗体CaSR (bios 1: 500年,中国上海),GCM2 (bios 1: 500年,中国上海)、甲状旁腺素(1:500年,博士德,武汉,中国),和β肌动蛋白(Wanleibio 1: 1000年,沈阳、中国)。随后,膜被孵化与辣根过氧化物酶- 2 h(合)共轭山羊anti-rabbit二级抗体(1:5000年,Wanleibio)。乐队与化学发光检测方法使用ECL +免疫印迹检测系统(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)。乐队的相对密度测定使用ImageJ软件(美国马里兰州贝塞斯达)。

2.8。统计分析

使用SPSS 22.0统计分析(美国芝加哥,IBM IL)。数据作为手段±标准差(SD),并使用学生的统计分析t以及和方差分析。时被认为是显著的不同 。

3所示。结果

3.1。鼠ADSCs鉴定脂肪形成的分化

孵化后脂质诱导物(图7天1(一)(图),14天1 (b)(图),21天1 (c)),河鼠ADSCs沾油红O,和脂滴一个倒置显微镜下观察。细胞中脂滴逐渐增加的数量随着时间的推移,证明脂诱导ADSCs是成功的。

(一)
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(c)
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图1
脂质在ADSCs诱导脂滴的形成。(a)为7 d,添加脂诱导物(b)增加脂质诱导物14 d,和(c)为21 d添加脂诱导物(比例尺200μ米)。ADSCs沾油红O,和脂滴倒置显微镜下观察。
3.2。老鼠ADSCs成骨分化的识别

ADSCs孵化在成骨诱导媒介(图7天2(一个)(图),14天2 (b)(图),21天2 (c))。茜素红染色和钙沉积在倒置显微镜下观察。细胞内钙沉积逐渐增加的数量随着时间的推移,指示ADSCs成功诱导骨生成。

(一)
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(b)
(b)
(c)
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图2
ADSCs诱导骨生成后钙盐的形成。(a)为7 d,添加成骨诱导液(b)增加成骨诱导液14 d,和(c)增加成骨诱导液21 d(规模50条μ米)。茜素红染色和钙沉积倒置显微镜下观察。
3.3。诱导大鼠ADSC分化成Parathyroid-Like细胞

诱导ADSCs被发现在介质包含嘘(100 ng / mL)或苯丙酸诺龙(25 ng / mL, 50 ng / mL,和75 ng / mL) 7、14、21天。嘘、苯丙酸诺龙有显著影响的甲状旁腺素分泌ADSCs,和分泌浓度-时间(图3)。21天中甲状旁腺素含量最高,和无数甲状旁腺细胞在显微镜下观察(图4)。


图3
甲状旁腺素含量的变化ADSCs 7 d,治疗后14 d, 21 d在不同浓度的嘘、苯丙酸诺龙。
(一)
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(b)
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(c)
(c)
(d)
(d)
图4
形态变化的细胞与不同浓度的治疗ADSCs 21 d后嘘和DMSO激活素a (a)刺激。(b)刺激100 ng / ml嘘+ 25 ng / ml激活素A (c)刺激100 ng / ml嘘+ 50 ng / ml激活素A (d)与100 ng / ml嘘刺激+ 75 ng / ml苯丙酸诺龙(比例尺100μ米)。
3.4。Parathyroid-Like细胞的鉴定

我们用聚合酶链反应和免疫印迹检测CaSR的表达,甲状旁腺素,GCM2 mRNA和蛋白,分别在21天的媒介。嘘,激活素增加了CaSR,甲状旁腺素和GCM2 mRNA和蛋白水平(数字5和6)。结果表明,ADSCs成功分化成parathyroid-like细胞。


图5
CaSR的mRNA表达、甲状旁腺素和Gcm2 ADSCs 21 d治疗后与不同浓度的嘘、苯丙酸诺龙。

图6
CaSR的蛋白表达,甲状旁腺素,治疗后Gcm2 ADSCs 21 d的不同浓度的嘘、苯丙酸诺龙。

4所示。讨论

相信人类ADSCs可以分化成parathyroid-like细胞,可作为小说的甲状旁腺来源细胞治疗hypoparathyroidism [11]。然而,这个假设需要证据。我们是第一个报告指出老鼠ADSCs体外可以分化为功能性parathyroid-like细胞,它提供了可靠的理论依据上述假说。此外,我们成功建立了一个详细的协议区分鼠ADSCs成parathyroid-like细胞。

虽然罕见,永久hypoparathyroidism偶尔会出现甲状腺切除术后,尤其是全甲状腺切除术。这种并发症取决于手术技巧,外科医生,患者基础疾病过程,等。自体移植的甲状旁腺腺被认为是一个重要的手段,减少永久hypoparathyroidism的发病率。自体移植的至少一个甲状旁腺与低风险的永久hypoparathyroidism [12,13]。甲状旁腺适合细胞移植,因为其独特的解剖和生理特征。原因如下:首先,每个甲状旁腺细胞包含完整的器官功能和可以独立发挥同样的功能器官,即。,他们没有器官移植和功能建设。第二,将少量的甲状旁腺细胞可以实现整个器官的正常功能。第三,术后hypoparathyroidism主要是医源性甲状旁腺损伤的结果。没有免疫功能异常,也不影响移植的结果。然而,由于术中情况的复杂性,外科医生不能检测损伤或及时甲状旁腺的切割木板。手术后hypoparathyroidism发生时,没有可移植的种子细胞。因此,临床治愈的唯一可能性hypoparathyroidism是找到足够的和安全的甲状旁腺自体移植的种子细胞。因此,研究人员试图区分各种细胞移植干细胞成甲状旁腺细胞,如胚胎间充质干细胞和tonsil-derived间充质干细胞(6,10]。在目前的研究中,我们选择ADSCs作为干细胞的来源,因为丰富的脂肪组织,容易获得材料,以最小的风险和相对成熟的隔离,扩张,和分化技术。更重要的是,ADSCs与脂肪形成的多功能和成骨的能力,可以成功地分化为多种组织和细胞的三个胚芽层(11]。

分离和净化老鼠ADSCs之后,我们首次发现他们的脂肪形成的和成骨分化能力。我们发现细胞内脂滴和细胞内钙沉积逐渐增加时间的方式。接下来,我们诱导的细胞。之前的研究使用不同的感应协议如苯丙酸诺龙,激活素A +‘诺金’+ sb - 431542 +嘘/ FGF8,或激活素A +嘘6- - - - - -10]。在这些协议中,最常用的是激活素A +嘘。苯丙酸诺龙是一种分泌蛋白的转化生长因子(TGF -β)总科,广泛用于干细胞研究。它可以调解多个干细胞的生长和分化。嘘也分泌蛋白质和胚胎发育中起着至关重要的作用。符合要求的激活素A和甲状旁腺发展嘘,我们也使用它们作为诱导试剂,发现激活素A和嘘了重大影响甲状旁腺素分泌和蛋白质的表达的甲状旁腺细胞标志蛋白(即。CaSR,甲状旁腺素,由ADSCs GCM2)。

甲状旁腺分泌甲状旁腺素(首席)细胞作为主要的人体激素的调节钙稳态。血清离子钙的水平是完全由甲状旁腺素。反过来,甲状旁腺素分泌调控通过CaSR血清钙含量,这是位于甲状旁腺细胞表面的。尽管多个基因(如BMP4,木钉,SIX1,PBX1)参与甲状旁腺分化GCM2一直被认为是甲状旁腺发展和发挥功能作用是一种特定甲状旁腺标记(6]。因此,CaSR、甲状旁腺素和GCM2被认为是甲状旁腺标记。在这里,我们可以诱导大鼠ADSCs分化成细胞表达了甲状旁腺标记CaSR甲状旁腺素,GCM2也分泌甲状旁腺素。

目前的研究也有一些局限性。首先,生物功能ADSCs应该进一步验证和自体移植的疗效评估。第二,目前的研究仅限于动物实验结果。仍有很长的路要走在临床应用。假设人类ADSCs可以分化成甲状旁腺细胞治疗hypoparathyroidism [11]。我们将努力为这一假说提供证据。在未来的研究中,我们将首先证明分化ADSCs可以调节甲状旁腺素在不同的Ca2 +浓度在媒体。然后,我们将建立一个动物模型hypoparathyroidism和自体移植物ADSCs分化成老鼠和测量血钙和甲状旁腺素在大鼠尾静脉血液评估自体移植的治疗效果。最后,我们将验证这个过程对人类脂肪组织。

5。结论

我们的研究结果证实了老鼠ADSCs可以分化成parathyroid-like细胞,为进一步的研究奠定了基础。我们研究的最终目标是利用细胞的个体患者hypoparathyroidism和分化成parathyroid-like细胞替代疗法。

数据可用性

目前我们的数据无法共享,因为进一步的研究正在进行中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢Elixigen公司(加州亨廷顿海滩)编辑我们的手稿。这项工作得到了辽宁省自然科学基金(批准号2015020536)。