文摘

背景和目的。一项研究报道坟墓患者肠道菌群的变化之影响(去)。促甲状腺素受体自身抗体(TRAb)刺激轨道和眶周的组织和发展中起着举足轻重的作用。然而,肠道微生物群之间的联系和TRAb去病人仍仍然难以捉摸。在这项研究中,我们探讨了肠道微生物群和GO-related特征之间的关系,我们应用一个metabolic-network-driven分析确定去trait-related模块和提取重要操作分类单元(辣子鸡)。方法。在目前的研究中,我们使用16 s rRNA异形肠道微生物群的基因测序在31个病人。我们metabolic-network-driven进行分析探讨肠道微生物群和GO-related特征之间的关系(例如,TRAb TGAb, TPOAb)微生物组合的影响。结果。应用微生物共存的网络分析模式和拓扑性质的分析,我们发现s_Prevotella_copri和f_Prevotellaceae显示与TRAb显著相关。特别是,我们应用的类模型探讨肠道微生物群和GO-related特征之间的关系的结合微生物的影响。据透露,受试者参与的与更高的丰富的类模型s_Prevotella_copri和g_BacteroidesTRAb较高水平。结论。我们的研究结果揭示了潜在的肠道微生物群和GO-related特征之间的关系的结合微生物的影响。这项研究可能提供一个新的见解之间的交互肠道菌群与TRAb-associated去患者的免疫反应。

1。介绍

格雷夫斯氏之影响(去)是一种自身免疫性疾病,通常与坟墓有关的疾病(GD)。影响外观,视力,甚至患者的生活质量(1- - - - - -3]。到目前为止,走的发病机制尚未完全清楚。肠道微生物群影响各种自身免疫性疾病,如1型糖尿病(近年来)4)和系统性红斑狼疮(SLE) [5]。最近进行的一项研究表明,肠道微生物群与一些甲状腺疾病有关,包括桥本甲状腺炎(HT)和GD [6]。肠道通透性增加,上皮内淋巴细胞的渗透之前发现HT患者(7]。肠道共生微生物可能会影响extraintestinal免疫反应诱导自体抗原失去宽容,包括甲状腺球蛋白构成HT (8]。我们先前的研究显示患者肠道菌群的改变严重和活跃。例如,社区的多样性显著降低患者。在门层面,拟杆菌门的比例明显增加,同时属和种的水平,观察显著差异(9]。本研究强调了角色出现的微生物群。

据我们所知,评估病人进入不同阶段的自身免疫性炎症,活跃和一般形式,是非常重要的治疗。证据表明,促甲状腺素受体自身抗体(TRAb)刺激轨道和眶周的组织也扮演关键的角色去的发展;因此,检测TRAb可能的临床意义积极评估疾病(10,11]。高表达的促甲状腺激素(TSH)受体在轨道组织支持的实质性作用TRAb在去的发病机制10,12]。最近,Kahaly等人报道,高滴度的TRAb GD患者眼球运动相关之影响(13]。然而,到目前为止,数量有限的研究探索去患者的肠道微生物群的作用,虽然没有一个研究报告潜在的肠道微生物群之间的联系和TRAb在这样的病人。

在目前的研究中,探讨肠道微生物群和GO-related特征之间的关系,例如,TRAb TGAb,我们应用metabolic-network-driven分析识别trait-related模块和提取重要操作分类单元(辣子鸡)。我们发现一些新奇的肠道微生物群和GO-associated特征之间的联系。我们的研究提供了一个框架来更好的理解肠道微生物群的相互作用和提取重要的细菌与TRAb有关。

2。研究对象和方法

2.1。研究对象

在目前的研究中,16 s rRNA基因序列被用来重建肠道微生物群落的分类结构使用去病人的粪便样本。本研究进行的内分泌学、北京同仁医院、首都医科大学,北京,中国。2017年3月至2018年3月31日严重和主动与甲状腺亢进患者登记。所有的病人只收到了一个抗甲状腺药物(Thyrozol;默克公司& Co .公司,进军美国新泽西)。去的诊断是根据欧洲小组坟墓”之影响(EUGOGO)指南2]。登记的病人没有收到任何治疗眼部不适。由临床活动活动去定义分数(CAS)≥3/7,和严重NOSPECS评分≥4去定义。TRAb测量使用商用电化学发光分析工具包(罗氏诊断GmbH,曼海姆,德国)基于锰单克隆抗体,与正常范围< 1.75 U / L。去病人的排除标准病人的年龄< 18岁或> 65年,慢性腹泻或便秘,肠胃手术史,益生菌的治疗前4周或抗生素,使用激素药物(< 3个月),严重的疾病(急性感染、糖尿病、中风、肾脏或肝脏功能障碍,癌症,或自身免疫性疾病),纯素食者,等等。9]。总结了研究对象的特征表1。

本研究经伦理委员会批准的北京同仁医院,首都医科大学(登记号trecky2016 - 003)。书面知情同意了所有的病人。

2.2。粪便样本微生物群测序,OTU集群,物种注释

总之,大约2.5克的新鲜粪便样本收集每个参与者使用塑料管肾上腺素与粪便DNA稳定器包括样本收集的量匙(PSP自旋粪便DNA +设备;STRATEC分子,柏林,德国)。从粪便样本中提取细菌的DNA根据制造商的指示(PSP自旋粪便DNA +设备;STRATEC分子)。DNA浓度化验使用NanoDrop 2000生物分析仪在260海里(热费希尔科学Inc .)、沃尔瑟姆,妈,美国)。不同的地区16 s rRNA基因(16 s V4/16S 515 f: GTGCCAGCMGCCGCGGTAA;806 r: GGACTACHVGGGTWTCTAAT)放大使用特定引物(14]。

序列分析和≥97%相似性分为相同的辣子鸡。为每个OTU代表序列为进一步注释就会被筛选出来。辣子鸡的丰富信息规范化使用标准序列号,每个样本对应的组合数最少的(如前所述)(9]。

2.3。网络分析

2.3.1。共存的网络

细菌群体的构成可能是积极影响,除了负面影响微生物在人类疾病之间的关系。因此,intermicrobial关系可以推断出从共存的分类单元网络,这个网络可以用于研究生态微生物之间的相互作用(15]。在目前的研究中,我们确定了共存的肠道微生物群网络基于斯皮尔曼相关分析使用的相对丰度表、和使用Benjamini-Hochberg值调整为多个测试方法。这些网络保持这些相关性与调整值< 0.1,相关系数的绝对值是> 0.3。通过应用模块化的分数,我们试图找出一个稠密子图。我们应用igraph包R软件(http://www.r-project.org)来实现分析。

2.3.2。加权基因Coexpression网络分析(WGCNA)

在此,WGCNA用于生成网络和识别网络模块根据OTU相对丰度。WGCNA,我们保留那些被发现的辣子鸡至少30%的样本,以确保数据不太稀疏,以及更适合计算相关系数。此外,作为数据降维有限的样本大小是至关重要的,我们为预选细菌引用的一项研究。最终,51个辣子鸡的相对丰度申请WGCNA。模块保存评估使用Z-summary R WGCNA包的软件实现。在目前的研究中,我们选择三个拓扑属性(程度、中间性和亲密)的网络从网络中提取重要的辣子鸡。因此,那些学历辣子鸡,中间性,亲密相关的证明,这些都是潜在的辣子鸡。

2.3.3。GO-Related特征之间的相关性和肠道微生物群

我们执行模块和GO-related性状之间的相关分析,包括TRAb、TPOAb, TGAb和CAS。module-trait相关分析,模块eigenOTU被定义为一个模块的第一主成分,这是用来计算皮尔逊相关系数的一个模块和一个GO-related特征之间的关系。相关性是由一个渐近的重要性价值。对于那些与GO-related特征相关的模块,进行皮尔逊相关分析是确定每一个辣子鸡参与之间的关系模块和GO-related特征。

2.3.4。负二项回归模型的进一步调查GO-Related特点和肠道微生物群之间的关系

作为识别细菌表现出显著的联系GO-related特征根据皮尔逊相关分析,我们进一步研究了这些细菌和GO-related特征之间的关系在调整了年龄和性别。由于倾斜和overdispersed绝对丰富的细菌类群的分布,负二项回归模型用于分析。每个微生物群的绝对丰度作为因变量,而TRAb TPOAb, TGAb,和中科院作为独立变量,和年龄和性别调整因素。被认为是具有统计学意义。

2.3.5。潜在类别分析(LCA)分类的病人

确定细菌显示重要联系GO-related特征,我们进一步用于分类的病人通过应用LCA GO-related特征并指出他们的贡献。LCA是结构方程建模的一个子集,用于发现病例组或亚型在多元分类数据,这些亚型以前称为“潜在课程”16]。目前,潜在的类模型很少应用于微生物的分析数据,尽管进化,时间和计算结构,可以直接将通过这样的模型(17]。在目前的研究中,我们试图利用LCA分析微生物数据:发现细菌的绝对丰度分为三个层次(标准定为<定为,>和< 66,> 66),和这三个层次编码为1,2,3。LCA可以检测的组合模式识别潜在的细菌类。LCA的一般评价指标如下:似然比(LR) Akaike信息准则(AIC),贝叶斯信息准则(BIC),和熵。LR越小,模型与数据的吻合程度就越好。的较小值AIC和BIC表明更好的拟合数据。熵越大,模型与数据的吻合程度就越好。这里,我们应用多个评价指标也优于单一指数来确定潜在的类的数目。据我们所知,不同的指标有不同的模型评价结果;因此,模型的解释是非常重要的。 We also compared differences in CAS, TRAb, TPOAb, and TGAb among the latent classes. We attempted to indicate whether gut microbiota contribute to the GO-related traits. The flowchart of our study is shown in Figure1。

3所示。结果

3.1。共存的肠道微生物群的网络

在目前的研究中,皮尔森相关分析是用来量化共存的肠道微生物群的网络。高度的相关性反映了来源的细菌之间的相互作用和环境条件相似的反应。通过应用模块化的分数,我们发现图形密集的社区。在门级,正相关性的数量是9,而负相关性的数量是2,形式是3(图的数量2(一个))。如图2(一个)Fimicutes和拟杆菌门,去患者最主要的类群,参与相同的模块。在类级别,28岁的正向关系,而负相关性的数量是2,模式的数量是4(图2 (b))。

3.2。WGCNA

在WGCNA,我们设置deepSplit = 2和minModuleSize = 10作为参数的动态树切割算法。权力的软阈值可用于网络建设;因此,我们选择功率= 1,导致安装R²值和平均连通性是最高的(补充图1)。

四个模块,即MEgrey、MEturquoise MEblue, MEbrown,最终被选中。与此同时,MEgrey作为参考模块,其中包括9个辣子鸡,MEturquoise的辣子鸡,MEblue, MEbrown 17岁,13日,分别和12。MEgrey、MEturquoise MEblue, MEbrown彩色灰色,青绿色,蓝色,分别和棕色。集群系统树图的四个识别模块显示在图3(一个)。图3 (b)描绘了热图eigenOTU邻接矩阵,这是定义为一个模块的第一主成分。网络热图的辣子鸡如图3 (c)。

边过滤后的根据r> 0.1,一个简化的网络获得。规模的网络,网络边缘的数量,平均学历,平均路径长度,和图形密度是38,94,4.947,2.891,和0.134,分别。因此,我们提取的十大辣子鸡与杰出的拓扑属性(表2)。这些辣子鸡程度较高、中间性和亲密证明这些辣子鸡与进一步的辣子鸡,相关联的,因此,潜在的辣子鸡。如表所示2这些辣子鸡,大多数(90%)中包含的绿松石模块(MEturquoise)。模块保存使用Z-summary评估,结果表明,保护一个蓝绿色的模块被确认。简化网络获得WGCNA如图4。在这个网络中,孤立的节点被移除。从表2和图4,我们可以看到,拟杆菌门的比例在十大辣子鸡是非常高的。

3.3。GO-Related特征之间的相关性和肠道微生物群

3.3.1。模块和GO-Related特征之间的相关性

之间的皮尔逊相关分析是进行识别模块和GO-related特征,特征是中科院,TRAb TPOAb, TGAb。第一主成分的一个模块是用来计算皮尔逊相关系数模块和GO-related特征。我们指出,绿松石模块(MEturquoise),包含大部分的辣子鸡和杰出的拓扑性质,是与TRAb负相关(r=−0.36, )(图5(一个))。如图5(一个),矩阵的每一个细胞都包含一个OTU模块之间的相关系数和GO-related特质。

3.3.2。相关性辣子鸡、参与MEturquoise GO-Related特征

我们进一步执行之间的皮尔逊相关分析辣子鸡参与绿松石模块(MEturquoise)和GO-related特征,特征包括CAS, TRAb TPOAb, TGAb。我们发现只有五个细菌:s_Prevotella_copri(OTU_2),s_Bacteroides_stercoris(OTU_5),g_Bacteroides(OTU_736),f_Prevotellaceae(OTU_1068),g_Bacteroides(OTU_1112)显示与GO-related特征显著相关,如中科院,TRAb, TGAb(图5 (b))。

3.4。负二项回归模型找出GO-Related特点和肠道微生物群之间的关系

与细菌显示标识的五个重要的协会GO-related特征,我们另外使用负二项回归模型来研究这些细菌之间的关系和GO-related特征(TRAb、中科院和TGAb)在调整了年龄和性别。如表所示3,s_Prevotella_copri,s_Bacteroides_stercoris,f_Prevotellaceae都与TRAb和TGAb,g_Bacteroides与中科院相关。

3.5。LCA分类的病人

在这个阶段,细菌(标识的五s_Prevotella_copri(日元)s_Bacteroides_stercoris(Y2),f_Prevotellaceae(Y3),g_Bacteroides(OTU_736 Y4)g_Bacteroides(日元,OTU_1112)),它显示了与GO-related特征显著相关,被选中。在LCA的绝对丰度五个细菌分为三个层次(标准定为<定为,>和< 66,> 66),然后被编码为1,2,3。我们应用LCA检测细菌的存在潜在的类。在应用LCA(补充表中的多个评价指标2和补充图2),四个潜在变量设置;此外,分析结果如表所示4和图6。

然后我们相比差异TRAb在四个潜在的类。结果表明,第四个潜类TRAb值高于其他三个潜在的类。第四个潜类包括高的患者s_Prevotella_copri和g_Bacteroides(OTU_736)(图7)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们应用metabolic-network-driven分析探讨肠道微生物群和GO-related特征之间的关系,确定了一系列新颖的肠道微生物群和血清TRAb之间的关联。在我们之前的研究中,线性判别分析效应大小(LEfSe)分析和随机森林分析表明,Prevotellaceae是区别的特性,可以区分从控制患者明显(9]。在目前的研究中,Prevotellaceae被确认为一个重要的家庭与TRAb相关的细菌。另外,我们应用LCA分类患者进入四个不同的子类基于他们的肠道微生物群的宪法和发现那些丰富的患者高s_Prevotella_copri和g_BacteroidesTRAb较高水平。

在人类身上,大约30 - 400万亿人类肠道微生物在,和他们组成取决于环境和免疫遗传的因素(18]。细菌功能和多样性的变化可能导致自身免疫性疾病和感染性疾病的发展19]。许多学者表明,肠道树突状细胞和巨噬细胞反应中病原体相关分子模式应承担的平衡。上皮屏障崩溃发生时,模式识别受体,它们存在于先天免疫细胞,检测肠道微生物群通过人数的类受体,可溶性维甲酸诱导基因应承担的我,点头的类受体,或者黑色素瘤分化相关蛋白,诱导的炎性反应和激活适应性免疫反应(20.,21]。描述的肠道微生物群组成的变化已经患有自身免疫性疾病,包括GD和HT (22- - - - - -24]。一个先前的研究表明,肠道主要居住着两种人类细菌类群:厚壁菌门和拟杆菌门,后者主要是由拟杆菌和普氏菌属(25]。研究表明,拟杆菌细菌发挥重要作用消耗碳水化合物,而普氏菌物种支配纤维特别是[26,27]。许多学者报道普氏菌与慢性炎症性疾病有关,包括类风湿性关节炎(RA)和系统性的hiv - 1感染的t细胞激活28,29日]。此外,s_Prevotella_copri最丰富的物种普氏菌,被发现与类风湿性关节炎(RA)的发展。之前公布,风湿性关节炎患者免疫球蛋白G的微分反应(免疫球蛋白)或IgA免疫反应s_Prevotella_copri。要么是免疫球蛋白抗体的响应P。copri、暗示系统性免疫反应或IgA抗体反应,暗示的黏膜免疫反应(30.]。到目前为止,相关的s_Prevotella_copri眼球运动的疾病仍然难以捉摸。在目前的研究中,水平s_Prevotella_copri呈正相关,血清TRAb水平更高,这可能与活跃的轨道炎症。在当前的研究中,我们发现f_Prevotellaceae与水平的TRAb去病人。接下来,我们发现f_PrevotellaceaeDNA在肠道和血清中抗体的病人31日]。研究表明,炎症性肠病(IBD)患者可能出现增长伴随的拟杆菌(32]。在目前的研究中,患者血清水平较高TRAb丰度高s_Prevotella_copri和g_Bacteroides在LCA。正如前面表示的那样,TRAb去的是一个独立的风险因素可以预测疾病的严重程度和结果(33]。本研究揭示了细菌和TRAb之间的关系,和我们的发现可能有助于预测未来的肠道微生物的研究。之间的关系s_Prevotella_copri和g_Bacteroides在调节TRAb-associated免疫反应需要进一步探索和阐明。

肠道微生物组是一个复杂和新陈代谢活跃的社区,直接影响主机表型(34]。事实上,肠道微生物组的结构是受几个因素的影响,包括其成员之间的相互作用。因此,它是高度基本了解微生物的组合影响潜在的疾病[他们的贡献35]。一个通用方法来推断细菌在肠道微生物群之间的相互作用是量化辣子鸡的共存。为了解决这个问题,网络生物学是一个新兴领域,代表了生物学网络捕获之间的关系的一个复杂的生物系统,如分子、流程、器官,甚至不同的生物体。同时,WGCNA,用来识别基因coexpression网络模块,可以促进社区内微生物共存的识别网络34,36]。例如,一项研究表明,某些代谢物强烈与微生物群落结构,和这些相关性是特定前驱糖尿病的状态(34]。在目前的研究中,我们评估了肠道微生物群之间的联系和GO-related特征微生物组合的影响。

目前研究的局限性:首先,有限的样本大小影响实现的结果。为了解决这个问题,我们进行数据降维。WGCNA,我们保留那些辣子鸡发现至少30%的样品,以确保数据不太稀疏,以及更适合计算相关系数;此外,我们引用的一项研究对预选的细菌。此外,我们使用模块保存分析估计的鲁棒性识别模块和分析了拓扑属性来识别关键的细菌。特别,我们应用相关性分析,负二项回归,LCA进一步验证所确定的细菌。虽然这些逐层分析达到数据降维的目的,避免了确定细菌是假阳性,需要扩大样本量在未来研究来验证这些细菌之间的潜在关系。第二,是否粪便微生物群的变化可能是一个原因或发展应该更进一步探索的结果。16 s rRNA基因片段的分析没有提供相关数据的功能特征的细菌属存在于社区。此外,皮尔森和斯皮尔曼的关系仅限于检测细菌的共存; thus, further ensemble approaches, such as SparCC, Kullback–Leibler divergence, and Bray–Curtis dissimilarity, will be used in the next study. Third, our findings may be related to thyroid autoimmunity rather than GO; thus, further analyses about the gut bacteria between GO patients and patients with GD without GO should be performed. Finally, TRAbs were subdivided into thyroid-stimulating antibody (TSAb), thyroid-blocking antibody (TBAb), and neutral antibody (neutral Ab) according to their functional effects [10]。试验没有区分刺激,阻塞,没有对甲状腺功能的影响。

总之,我们的研究表明,潜在的肠道微生物群的构成之间的关系和TRAb病人。它可能提供一个新的见解之间的交互肠道菌群与TRAb-associated去患者的免疫反应。

缩写

走:	格雷夫斯氏之影响
GD:	甲状腺机能亢进
近年来:	1型糖尿病
系统性红斑狼疮:	系统性红斑狼疮
HT:	桥本氏甲状腺炎
TRAb:	促甲状腺素受体自身抗体
辣子鸡:	操作的分类单位
中科院:	临床活动得分
TPOAb:	Thyroperoxidase抗体
TGAb:	Antithyroglobulin抗体
WGCNA:	加权基因coexpression网络分析
LCA:	潜在类别分析
LR:	似然比
TSAb:	促甲状腺抗体
TBAb:	Thyroid-blocking抗体
炎症性肠病:	炎症性肠病。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

伦理批准

这个研究伦理委员会的批准北京同仁医院,首都医科大学。所有程序中执行本研究按照1964年赫尔辛基宣言及其后来的修正案。

同意

知情同意书是获得所有个体参与者包括在这项研究中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

婷婷史和磷化同样对本文亦有贡献。

确认

作者感谢所有的参与者和员工在这个研究。这项工作得到了北京市医院研究和发展项目(PX2016063),北京的专家推广计划卫生系统中新(2015-3-017),和北京同仁医院的基础(2015 - yjj zzl - 006)施婷婷。

补充材料

补充表1:从WGCNA获得相应的简化网络的辣子鸡。补充表2:LCA的多个评价指标。LCA的评价指标是cAIC、aBIC和熵,似然比(LR)。LR越小,越小AIC和BIC越小,这意味着更好的拟合数据。熵越大,模型与数据的吻合程度就越好。补充图1:软权力的阈值。在WGCNA,独立和规模意味着连接用于电源的选择。当功率= 1,安装R²值和均值的连接都是最高的。补充图2:LCA的多个评价指标。LCA的评价指标是cAIC、aBIC和熵,似然比(LR)。LR越小,越小AIC和BIC越小,这意味着更好的拟合数据。熵越大,模型与数据的吻合程度就越好。(补充材料)