文摘
异位甲状腺迁移结果缺陷发展中腺在胚胎发生导致先天性甲状腺功能减退。但它也被发现在无症状的个体。本研究旨在探讨组织病理学,人类异位甲状腺的功能和遗传特性。6个样本组织学检查,具体甲状腺蛋白质的表达被免疫组织化学评估。两个样本提交全外显子组测序。口咽样本显示不成熟的胎儿组织架构集群或椭圆形的绳索此外,我们小卵泡;一个样本表现出正常的甲状腺模式而四显示胶体甲状腺肿。具体表达的各种异位甲状腺甲状腺基因和T4在正常甲状腺所观察到的相似的地方。没有发现与异位甲状腺相关的体细胞突变。这是第一个不成熟的胎儿甲状腺组织中观察到一个异位甲状腺由于结构性分化的逮捕在胶体的早期发展阶段,证明能够合成甲状腺激素而不是回应TSH。 Despite the ability of all ectopic thyroids to synthetize specific thyroid proteins and T4, at some point in life, it may be insufficient to support body growth leading to hypothyroidism, as observed in some of the patients.
1。介绍
甲状腺是一个bilobar腺由两种内分泌细胞组成的,即甲状腺滤泡细胞(交通)生产甲状腺激素T3和T4 parafollicular细胞分泌降钙素。交通是来源于甲状腺原基,或甲状腺癖性,源于前肠胚上皮细胞增厚的底部的潜在的舌头。这个结构的发展遍布的甲状腺憩室,侵入周围的间质,并通过颈部中线的迁移。在迁移过程中,原始的甲状腺甲状舌管,获得二裂片的结构初始连接到原始咽地板,失去了腔,变成断开连接的片段。当发展中甲状腺达到其最终位置的底部颈部气管前,后鳃体发生的核聚变产生C细胞。最后,folliculogenesis发生与甲状腺祖细胞的分化为功能性甲状腺滤泡细胞,表达特定的甲状腺基因如TSH受体(TSHR)、Na /我同向转运(NIS)和甲状腺球蛋白(TG)[1- - - - - -3]。
在小鼠模型,甲状腺的正常胚胎发生是由一个完整的监管控制转录因子网络(4,5]。在甲状腺原基的形成(规范阶段),甲状腺转录因子的表达TITF1, PAX8, FOXE1, HEX1可以观察到。FOXE1被认为是需要移植后小鼠甲状腺原基的超然的芽6),和生存的甲状腺原基取决于FOXE1的表达和PAX8 [4]。
异位甲状腺是一种罕见的畸形所导致的迁移缺陷发展中腺在胚胎发生(1]。腺可以发现在任何时候迁移的路径,从孔纵隔盲肠,也在远端subdiaphragmatic地区。然而,最常见的网站底部的舌头或舌甲状腺7]。异位是最常见的甲状腺发育不全(TD)及先天性甲状腺功能减退8,9),但也被发现在无症状的个体或甲状腺功能减退的原因,言语障碍、吞咽困难、咳嗽、打鼾、睡眠呼吸暂停和共存,通常位于甲状腺(10- - - - - -12][13,14]。
异位甲状腺的发病机理,以及一些异位患者保持euthyroid一生中,尚未阐明。很少有研究特征重要甲状腺蛋白质的表达(10,14]。此外,突变基因FOXE1,PAX8,TSHR,NKX2.1,或NKX2.5与TD被确定在只有2 - 3%的道明情况下(15]。最近,全外显子组测序(韦斯),一个强大的工具为研究人类疾病的遗传原因,新基因被确定在TD情况下(16,17]。
因此,本研究的目的是探讨人类异位甲状腺组织的组织病理学和功能特征通过T4的表达,特定甲状腺蛋白质TG, NIS, TSHR,甲状腺转录因子NKX2.1 PAX8通过免疫组织化学和识别潜在的致病突变扩大全外显子组测序。
2。材料和方法
2.1。样品
石蜡块四个人类异位甲状腺样本回顾性收集病人甲状腺切除术,和两个瞬间冷冻组织样本删除由于症状(示例4)或可疑的细胞学为乳头状甲状腺病变患者(2)也包括在这项研究。控制样本来自存档石蜡块正常的甲状腺。研究当地的研究伦理委员会批准的协议(HC和CEP 1078/11 893/01)。
2.2。病人
所有患者出生之前的建立强制性的新生儿筛查项目在巴西,除了病人5。异位患者临床病理的信息是来自医疗记录。患者1是一个34岁的女性与口咽异位甲状腺质量检测在7岁。患者从未接受左旋甲状腺素(LT4)和有两个剖腹产手术。术前甲状腺荷尔蒙的地位是TSH: 11.19个人/ L (ref。0.5 - -4.2个人/ L)和总T4: 2.48μ5.3 - -12.6 g / dL (refμg / dL)(改nmol / L,乘以12.87)。病人2是一个46岁的女性与异位甲状腺位于舌骨。病人已经接受LT4 (100μ克/天)为过去30年甲状腺功能减退。被诊断为甲状腺肿手术前4年。患者3是一个7岁的euthyroid女孩。舌甲状腺检测在5岁时调查吞咽和睡眠困难。病人从未LT4对待。患者4是一个38岁的男性舌甲状腺引起过度的打鼾。患者从未接受LT4,术前甲状腺激素状态FT4: 0.6毫微克/分升(ref。0.6 - -1.54 ng / dL)(把pmol / L,乘以12.87),TSH: 46.7个人/ L (ref。0.5 - -4.2个人/ L)和消极anti-TPO anti-Tg。患者5一个月大女孩是中线缺陷和舌甲状腺手术后诊断为疑似舌肿瘤。新生儿手术后测试表明TSH > 200个人/ L。病人6是一个13岁的女孩,出生时颈部结节指出,在儿童的发展。在11岁的时候,被诊断为舌甲状腺和甲状腺功能减退与血清TSH证实:11.42 / L、FT4: 0.73毫微克/分升(ref。0.897 - -1.794 ng / dL)和消极anti-TPO。左旋甲状腺素是规定,但病人依从性差。
2.3。免疫组织化学
三个μ米厚的部分formalin-fixed和石蜡包埋组织六名病人样本(样本1 - 6)首次与苏木精和伊红染色组织学观察,然后提交给免疫组织化学过程。抗原进行检索在10 mM柠檬酸缓冲/ pH值6.0压力锅三分钟,和内源性过氧化物酶灭活在6%双氧水在孵化的一步。本研究中使用的抗体单克隆抗甲状腺过氧化物酶(TPO) (DakoCytomation MoAb47, 1: 500年,斯特鲁普,丹麦),单克隆anti-sodium-iodide同向转运(NIS) (FP5A 1: 200年,梅奥诊所,美国),单克隆anti-TTF1 (NKX2.1) (8 g7g3/1 1: 500年,电池品牌,Rocklin,美国),单克隆anti-thyroid-stimulating激素受体(TSHR) (4 c1 / E1 /八国集团,1:200年,NeoMarkers,弗里蒙特,美国),多克隆anti-PAX8(兔子,1:500年,电池品牌),多克隆anti-thyroglobulin(兔子,1:400.000;DakoCytomation)和多克隆anti-thyroxine (T4)(兔子,1:1.000;Cloud-Clone Corp .)、美国休斯顿)。一夜之间,组织部分被孵化的主要抗体,和放大了peroxidase-conjugated聚合物(Ultravision TL015-HDS,热费希尔科学、弗里蒙特,美国),然后揭示了diaminobenzidine /过氧化氢基质色原体。使用徕卡TCS SP8显微镜图像获得的。由两个作者的样本检测。
2.4。全外显子组测序和分析
患者2和4的总DNA异位组织被用来准备与安捷伦SureSelectXT DNA库试剂盒(安捷伦科技®,圣克拉拉,美国),和整个500年Illumina公司NextSeq UTR区域和外显子组测序平台(美国圣地亚哥Illumina公司®Inc .)计算覆盖率平均每样140 x。对齐到一个参考基因组测序读(GRCh37 / hg19)使用burrows - wheeler对齐(BWA),并要求进行基因组分析工具包(GATK)。单一核酸变异和小insertions-deletions与ANNOVAR[注释18]。与12个样品数据过滤控制巴西家族性甲状腺癌组织,变异与低质量分数,和常见的变体(加器> 1%),中性变异被淘汰。有害影响的预测进行评估使用在线生物信息学工具:筛选,PolyPhen-2, mutationassessor, fathmm, Condel, MutationTaster, PROVEAN [19- - - - - -21]。
3所示。结果
3.1。组织病理学的异位甲状腺
观察胎儿甲状腺架构示例1中表现出孤立的上皮细胞椭圆形细胞未极化的或安排在集群和绳索和原始的小卵泡由立方形的细胞排列小腔,其中一些与胶体嵌入在基质(数字1和2)。小范围的部分正常毛囊也被观察到。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
组织病理学检查样品的2、3、4、6显示胶体甲状腺肿与高度放大毛囊由扁平上皮细胞(图2(A))。焦点区域(10 - 25%)组成的身材与立方形的毛囊细胞也在这些样本中发现。示例(图5显示正常甲状腺组织2(B))。
3.2。免疫组织化学表达
TG表达强烈和漫射样本下的所有卵泡腔的调查,即使在microfollicles与胎儿组织架构(示例1)。细胞质TG染色弱或负面的正常毛囊和异位的macrofollicles样本,类似于正常甲状腺样本。然而,强劲的胞质染色观察孤立此外,microfollicles我们从胎儿甲状腺组织(示例1)(数据1(一),1 (b),2a - c)。
传真照片染色是强大和分散在细胞质中,此外,我们还观察到在所有卵泡的顶端膜异位的样品检查,类似于正常甲状腺组织。唯一的细胞质传真照片是在孤立此外从我们观察到胎儿甲状腺组织(示例1)(数据1 (c)和2d-f)。
TSHR表达强烈和分散在细胞质中,此外的异位我们样品,类似于一个正常的样本(数据1 (d)和2胃肠道)。
NKX2.1扩散疣状强劲的大部分核异位甲状腺样本,除了示例2的大约10%低积极核和分散细胞质表达。观察低表达在大多数正常甲状腺(核的数据1 (e)和2j-l)。
PAX8中等到高强度扩散所有异位表达观察样品在大约70 - 80%的滤泡细胞细胞核,除了示例2的低表达在细胞核和分散胞质表达的20%左右。正常甲状腺组织中表达在大多数核(数字很低1 (f)和2m-o)。
NIS是积极在高达10%的基底外侧膜细胞异位样品3、4和5。胞质染色观察样本。20%的正常甲状腺样本有一个类似的模式积极在基底外侧膜和胞质染色(数字1 (g)和2p-r)。
T4表达式在胶体分散和强烈的微观和正常的卵泡从胎儿甲状腺示例(图1 (h))。其他异位样本,胶体T4表达式是中度或严重,虽然有些毛囊显示低或负疣状,类似于正常的甲状腺(图2苏堤)。
3.3。全外显子组测序
过滤后的测序数据,3501年和3287年变异(indel或SNVs)被确定在样品2和4中,分别。方法选择有害突变(a)的识别常见的变体,(b)的调查纯合子的改变(161年和165年,resp)。由于可能的隐性遗传模式,(c)候选基因的方法以及相关的190个基因列表开发和甲状腺功能(表1)[22- - - - - -34因为没有家人,(d)识别5 'utrs基因变异的绑定图案FOXE1(表2)[35,36)和PAX8(表3)[37因为这些转录因子表达从甲状腺胚胎发生的早期阶段。没有选中的变异预测有害的具体程序。因此,这种分析不确定测序中的体细胞突变区域,这可能与疾病。
4所示。讨论
异位甲状腺的患病率1:4000 - 8000 100000 - 300000个人和1:患者甲状腺疾病(7),在女性中更频繁(65 - 80%)38)在诊断年龄范围从新生儿期到成年。在甲状腺功能方面,病人可有甲状腺,euthyroidism,,更很少,甲状腺机能亢进7,14,39]。
在目前的研究中,我们调查了六异位甲状腺样本:四人舌甲状腺功能,一个是位于口咽,另一个在舌骨。之前报道的组织学异位甲状腺的情况下显示正常甲状腺滤泡模式(10,40)和类似的观察到的异常倾向normal-positioned腺体,如滤泡腺瘤、胶体甲状腺肿等(14,41- - - - - -45]。在目前的研究中,异位甲状腺组织的组织病理学检查从一个成人患者(示例1)披露一个不成熟的胎儿架构模式的特点是集群的存在和声带的椭圆形非偏振的上皮细胞,原始卵泡,和小卵泡嵌入在基质正常毛囊的小范围(27,46]。甲状腺组织与fetal-like出现以前中确定一个明显影响先天性甲状腺孩子的母亲与杂合的关联PAX8突变(47]。尽管没有突变进行调查,免疫组织化学检测显示,大约80%的强劲核PAX8表达的细胞组织。还有待调查是否有功能的蛋白质。其他异位样本表现出正常的甲状腺功能(样本5)或胶体甲状腺肿模式(样品2、3、4、6)。
T4和特定甲状腺蛋白质表达的各种异位样本传真照片,TG, TSHR, PAX8, NKX2.1 NIS,虽然焦毛囊,组织区域,或此外毛囊内未能表达的几个我们这些蛋白质(数据没有显示)。异构表达式模式也观察到在正常甲状腺组织和形态学特征有关,此外和毛囊集中碘[我们的能力48,49]。示例2核的表达较低PAX8 NKX2.1和分散细胞质疣状;然而,没有检测到韦斯体细胞突变。两个基因与甲状腺发展(3)和表达在甲状腺原基迁移时启动(50),和突变与一些TD情况(51]。另一方面,在异位,高PAX8表达式相关的激活状态腺[22),和高表达NKX2.1有关异常胚胎发生(14]。因此,进一步的研究评估的意义的观测数据是必要的。
特定甲状腺蛋白相似的位置,观察在正常甲状腺(22,52]。细胞质TSHR染色可能是由于使用这种蛋白质的抗体细胞外领域,如前所述[53]。同样,细胞质NIS定位在所有膜免疫染色的样品和他们四个是按照先前的报道27,46,54]。
以前的转录组分析显示没有区别在异位甲状腺特定基因的表达和正常甲状腺组织纠正TSH水平(22]。尽管蛋白质表达数据没有被纠正TSH水平,我们的研究结果证实这些蛋白质的表达和适当的本地化异位,包括T4。更有趣的是,他们确认原始卵泡示例1中能够综合T4,断言腺的功能状态,尽管它可能已经无法应对TSH。
患者的临床数据表明,异位甲状腺能够合成足够的甲状腺激素至少在病人的早期生活。然而,分泌甲状腺激素的数量可能不足以满足身体的需求在增长,促进甲状腺功能减退,因为荷尔蒙的要求是根据体重(55]。低激素生产可能是一个小尺寸的结果异位腺体,可能由于迁移缺陷,和TSH-induced限制的增长(14]。
人类甲状腺形态发生始于怀孕22天,主要是完成当达到其最终位置在气管前7点孕周(GW)(48天怀孕)。此时,甲状腺由未分化的此外,我们对此表示强烈PAX8和弱NKX2.1 FOXE1 [2,50]。随后,甲状腺接踵而来的结构和功能的分化,伴随着精确定时甲状腺的特定基因的表达,可以分为三个阶段。首先是precolloid阶段(7到10 GW),与大量的绳索或集群的未分化此外表达PAX8,我们FOXE1, NKX2.1细胞质TG和TSHR, NIS和传真照片不是观察到的表情。二是胶体的开始阶段(10到11千瓦)与发展同极化小卵泡此外表达我们传真照片在顶端膜,TSHR的基底膜,NIS在细胞质,TG在滤泡腔和T4合成达到高潮。第三个阶段是卵泡生长阶段(从12千瓦)NIS的基底外侧膜表达(27,46]。因此,我们的数据让我们假设至少三个不同的甲状腺发展障碍可能导致异位甲状腺。在病人1中,过早逮捕迁移(33-48天的妊娠)可能导致定位的腺口咽的水平(1]随后被逮捕的结构性分化早期胶体阶段(1,46),导致非齐次胎儿甲状腺组织模式能够合成T4。第二,在病人2中,移民发展中腺可能也停止之前达到其最终位置,导致甲状腺舌骨位置,以及完整的结构和功能分化。第三,甲状腺原基可能不能够脱离咽地板和迁移,促进舌与一个完整的结构和功能分化甲状腺患者中观察到3、4、5、6。因此,逮捕了这个过程可能发生之前,在怀孕26天,当迁移开始(1]。
评估潜在的TD的体细胞遗传原因编码蛋白质的区域和5 'utrs,扩大了外显子组分析样品2和4。不幸的是DNA的质量差不允许从其他石蜡组织样本进行遗传分析。尽管不同的外显子组测序分析方法,没有相关的体细胞突变确定测序地区。之前的研究中也得到了相似的结果,同卵双胞胎的研究的体细胞突变不和谐的TD (56]。另一方面,韦斯发现小说错义BOREALIN基因的突变与TD(血缘家庭16]和DUOX2 n端结构域突变可能发挥作用在甲状腺零星的TD发展情况(17),确认这个病理的遗传异质性。此外,其他遗传机制的参与可能也会考虑。小说拷贝数变异基因拷贝数异变,不健康人群中描述,确定了80年8.75% TD患者(54,56]。没有差异CpG岛之间观察到正常位置正常的启动子区域的甲基化和异位甲状腺组织(22,57]。因此,TD的原因可能与分子改变genoma或其他地区的多基因或其他表观遗传改变,也可以是完全随机的。
总之,没有测序地区的体细胞突变与异位甲状腺相关。这是第一个描述胎儿组织病理学架构在一个成年人的异位甲状腺的逮捕结构性分化发展中腺以及移民的逮捕证明能够合成甲状腺激素而不是回应TSH。我们显示异位甲状腺的能力来表达特定的基因和T4甲状腺,尽管迁徙和组织学分化缺陷,以及合成甲状腺激素的能力至少一段病人的生命。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,可以视为损害公正性的研究报道。
确认
作者欣然承认Janete m . Cerutti教授实验室的使用区域进行本研究的几个阶段。作者感谢阿德里亚娜·卡博士和教授Thaysa Paschoalin使用显微镜获得的资源从FAPESP格兰特2009/53840-0必须占州政府。这项研究是2010/12005-9赠款支持企业管理学院德帕罗尽管做基金会和2014/24549-4 Estado de圣保罗(FAPESP)必须占州政府,圣保罗,巴西,和部分授予Instituto da Tiroide非营利机构。