卵泡闭锁的特征响应BPA在斑马鱼的形态学分析卵泡阶段发展

文摘

双酚A是一种工业化合物,普遍污染环境和饮食,分类作为一种内分泌干扰物),因为它干扰对内分泌系统的影响。在斑马鱼,BPA暴露诱导卵泡闭锁。获取知识在这个闭锁的效果,使用定性和定量histomorphological方法,我们研究了斑马鱼卵巢卵泡阶段发展应对BPA浓度较低。结果表明,双酚a干扰卵泡发展通过影响previtellogenic和卵黄的阶段。特别是,BPA接触(i)增加卵泡招聘通过作用于毛囊初级阶段,(2)迫使卵泡从第三阶段过渡到四期生产放大四期毛囊,和(3)诱发产生闭锁卵泡闭锁,特别大(即。,大卵泡闭锁的)。我们建议BPA诱发闭锁的主要影响招聘阶段我卵泡。这迫使卵泡发展和生产四期毛囊特别放大,进行闭锁的发展。

1。介绍

双酚A (BPA)体积化学品生产全世界最高的国家之一。它是用来制造塑料、环氧树脂、硬塑料瓶子和金属食品和饮料罐子。这是一个普遍的工业化合物,广泛存在于环境和饮食1];因此,毫不奇怪,超过90%的测试人类可检测水平的BPA在生物体液,婴儿和儿童的最高水平(2- - - - - -5]。相比毒性动力学研究人类BPA的新陈代谢,从生物监测的研究显示可用数据的存在可测的浓度BPA在个别成年人,青少年和儿童(5),以及在母体/胎儿血液循环,孕妇羊水、胎盘组织(6]证明人口暴露在BPA和胎盘不作为屏障。

双酚a是一种内分泌干扰物(edc)的(反)雌激素和antiandrogenic活动,广泛记录过去,施加了核和核外机制(7,8]。这个观察是越来越关注双酚a的基础,因为它会干扰激素信号通路即使在非常低的剂量。最近,其行动除了核受体信号通路报道主要是由于它能够促进氧化应激反应通路(9)和核转录因子激活B细胞(NF - kappa-light-chain-enhancerκB),在别人深深影响转录活动(10,11]。流行病学和实验研究揭示了BPA暴露和几种疾病之间的关系,包括生殖障碍。值得注意的是,BPA会损害生育能力,在男性和女性,通过激活或得罪性核受体在生殖组织目标1,12- - - - - -16),包括雌激素(即。,呃α,呃β和GPR30)和雄激素受体(17- - - - - -20.]。在这种背景下,BPA接触导致权力的危险因素不孕。

在哺乳动物中,edc卵巢对干扰很敏感,尤其是当接触发生在子宫内(21- - - - - -23)或早期产后生活(24]。特别是,有越来越多的证据表明,双酚a可能影响卵母细胞发育的不同阶段;事实上,在子宫内早期暴露于低剂量的BPA破坏卵子发生在老鼠和恒河猴(25,26),在新生小鼠卵巢,BPA促进原始卵泡的过渡初级卵泡和抑制卵母细胞的减数分裂成熟由于异常:在减数分裂中纺锤体组装我27,28]。有趣的是,这些BPA对越来越多的卵母细胞的影响是通过控制调节植物雌激素在饮食29日]。在老鼠身上,BPA暴露在产后早期减少原始卵泡储备(30.)和卵巢形态学改变导致大量的囊肿和不孕31日]。在协议中,新生儿暴露于低剂量的双酚a羊羔的比例降低原始卵泡卵泡招聘(加速度)和卵巢储备和闭锁卵泡的数量增加24]。

然而,发表报告的发生和/或严重性BPA的卵泡的影响显示对比数据,可能反映了不同的实验方法(例如,使用不同物种或品种的动物或剂量、持续时间、路线,或暴露的时间)。

自从水生环境是一个重大的水槽edc与鱼特别容易受到接触edc,斑马鱼(d .鱼类)最近已成为一个重要的工具来监控水污染(32,33),为研究生态毒理学和生物效应,包括生殖的(34- - - - - -38]。在斑马鱼,BPA接触影响卵泡(15,39,40]。这种化学物质触发改变卵泡发育,造成闭锁的毛囊的百分比的增加,随着暴露浓度上升(39,40]。在这种情况下,我们选择了斑马鱼作为动物模型,以更好地评估BPA和生殖的影响,与Carnevali和同事合作,最近我们BPA在斑马鱼卵巢的影响特征的表型和分子水平。我们表明,暴露在BPA浓度低(5μg / L,类似于环境浓度)促进卵泡闭锁和停止排卵。这些影响没有观察到更高的BPA浓度(10和20μg / L)。在分子水平上,我们发现5μg / L BPA促进类固醇生成没有对基因转录作用(雌激素受体,esr2b;steroidogenic急性调控蛋白,明星;11亚科和细胞色素P450的家庭一员,cyp11a1)和卵母细胞增长(促卵泡激素受体,fshr),但明显会使卵巢发育相关基因的表达(雌激素受体,esr1和esr2a)[15),生产成熟激素(促黄体激素/ choriogonadotropin受体,lhcgr),收购成熟的能力(孕激素受体膜组件,pgrmc1和pgrmc2)和凋亡基因表达的增加(caspase3和肿瘤蛋白质53)。

在这种背景下,获取知识的5μg / L BPA影响诱导卵泡闭锁,使用定性和定量histomorphological方法,我们评估卵泡阶段应对BPA接触。特别是,使用收集到的卵巢和分子已经分析了Carnevali和同事(15),我们morphometrically闭锁的毛囊的面积,以及数量,发展和增长的卵泡阶段通过组织学分析。目的是描述BPA-induced闭锁(闭锁的效果)和解码卵泡阶段主要通过BPA暴露目标。

2。材料和方法

2.1。动物和BPA接触

成年雌性斑马鱼(d .鱼类AB应变,野生型背景)被Carnevali暴露于BPA和同事(见[15])。已经报道,48个女性分为八10 L水族馆受控条件下的含氧水(28.0±0.5°C),保持在14/10 h光/暗周期,和美联储每天4次,两次商业食品(Vipagran;血清、Loessnitz、德国)和两次卤虫盐沼。特别是,48岁女性被分成4个实验小组。每组分为两个坦克,每个都包含6鱼,为了获得生物复制。有1控制和3暴露组,接受5、10或20μg / L BPA(分析纯度98%,Sigma-Aldrich、米兰、意大利)为3周。每个实验组包含12个鱼。固定超过了这个数字权力分析使用动物权力3.1.9.2软件建议共40(10动物/组)0.82功率计算,值固定为0.05。

BPA是稀释在绝对乙醇(EtOH),用作车辆,并将其添加到水(最终稀释< 1:10000)。自从广泛的稀释,对照组只饲养在淡水没有EtOH,根据经济合作发展组织慢性化验(经合组织2012)。此外,由于试验研究表明,双酚a的生物利用度降低50% 4天后,治疗与双酚a是由更新的水箱稀释污染物(5μg / L BPA)每三天。

经过3周的治疗,动物是致命的麻醉和500 mg / L ms - 222 (3-aminobenzoic酸乙酯,Sigma-Aldrich)缓冲pH值7.4。组织学分析,卵巢( 一半卵巢/实验组)被固定在Bouin的解决方案。

所有程序符合意大利动物实验的法律和伦理委员会批准帕多瓦大学(Prot 112/2015-PR)。

2.2。组织的组织学处理

在以前的工作开展与Carnevali和同事合作,据报道,斑马鱼暴露于BPA浓度最低(5μ由闭锁g / L)显示阻止排卵。中间(10μg / L)和最高(20μg / L) BPA浓度没有引起重大变化对对照组。

从这些结果和使用相同的卵巢收集和分子在前面的研究分析15),这里我们进一步特征报道闭锁卵泡发展使用的形态学的分析方法。

卵巢CTRL和BPA-exposed (5μg / L)斑马鱼已经被加工为组织学检查报告(41]。生殖腺( 卵巢CTRL和10一半卵巢BPA)是嵌入在石蜡,切割(7μ米),切片机,加工hematoxylin-eosin染色(使用标准程序),并观察到100 x最终放大(×10个目标,×10眼)在光学显微镜下(徕卡微系统公司、米兰、意大利)。使用高分辨率的数码相机图像捕获(DC300F;徕卡微系统公司,意大利米兰),结合显微镜直接观察,这些都是用于分析卵泡阶段。特别是3串行部分每10部分(70μ米间隔分析部分,至少12总部分/实验组)被用来识别和计数毛囊,以及分析滤泡面积大小。BPA-exposed卵巢的卵泡似乎脆弱切片;因此,分析使用10 CTRL和9 BPA-exposed卵巢。

作为这些实验过程,通常需要进行统计分析使用3串行部分的平均值;此外,所有的分析都是由两个观察者使用双盲测试进行验证。

2.3。卵泡阶段识别

按照塞尔曼et al。42),我们识别和分类卵泡发展的五个阶段。特别是初级卵泡(初级发展阶段I)是由一些可识别的外围地坐落核仁以及强烈的胞浆嗜碱性。值得注意的是在这个阶段,卵泡开始形成和提高卵母细胞通过减数分裂的早期阶段进展我在前期将暂时停止。

识别了皮质肺泡II期皮质肺泡的出现(即。“蛋黄”囊泡含有透明带卵母细胞内的蛋白质)积累。细胞核出现结构规律和扩大,包含多个外围核仁。

在卵黄的阶段,毛囊的尺寸在增加由于蛋黄的积累,和放射带是显而易见的。细胞核的不规则结构伴随着核膜内陷。在卵黄颗粒的外观,毛囊被归类为早期卵黄的III期(即。,成熟无能)。毛囊被归类为卵黄的后期和成熟能干四期当卵黄颗粒变得丰富,开始合并和观察胚泡的外围迁移。在这个阶段中,胚泡破裂发生(即。最后,减数分裂成熟)。

成熟或产卵阶段V没有被确认的胚泡(即。,核膜)。

正如之前报道的(15),确定闭锁的毛囊(A)是基于闭锁的形态标记Ucuncu和Cakıcı[43)如颗粒细胞增生、变薄,内陷和放射带故障,基底膜解体,和卵黄吸收。

2.4。卵泡阶段计数

对于每一个卵巢,至少4个随机部分(包括每一个3串行部分至少每10个部分中)被用来识别和计数毛囊(即。、道达尔和特定的滤泡阶段)。

卵泡阶段我(主要增长),第二阶段(皮质肺泡),第三阶段(早期卵黄的),四期(卵黄的和成熟后期主管),和舞台V(成熟)被分类和计算实验组。使用形态学闭锁的标志,我们也算闭锁的毛囊(因此冒失地称为闭锁的)。

卵泡的数量相对于总毛囊(即每个阶段。,percentage of follicular stages) has been analyzed and graphed as mean values of 3 serial sections ± SEM.

第三阶段和第四阶段的数量相对于总卵黄的毛囊(即。,percentage of stages III-IV/total vitellogenic stages) has been analyzed and graphed. In particular, total vitellogenic follicles have been counted and classified in early (stage III) and late (stage IV) vitellogenic stages. The percentage of follicles at stages III and IV (number of stages III and IV/total vitellogenic follicles) has been graphed as mean values of 3 serial sections ± SEM.

2.5。分析滤泡大小

的滤泡大小卵黄的、成熟的和闭锁的毛囊从控制和BPA-exposed斑马鱼被评估分析滤泡面积使用ImageJ软件。对于每一个卵巢,至少4个随机部分进行评估和平均面积为每个卵泡是评估在3系列的部分。结果已经在广场表示像素(p²)和画平均值±SEM 3系列的部分。

闭锁卵泡的平均面积(1.9便士²)从控制卵巢被用作参考价值。在这两个实验小组,卵巢中卵泡闭锁的上下参考面积值,统计分析了图形绘制和费舍尔卡方( )测试。更大的闭锁的毛囊(即。p > 1.9²)已被称为大不通的毛囊。

2.6。统计分析

学生的 - - - - - -测试或方差分析之后,邓肯的多组对比试验进行评估的意义差异,适当的。数据表示为串行部分的均值±SEM。 和0.01被认为是具有统计学意义。

费雪的执行测试,1个自由度,使用Microsoft Excel测试两个变量之间的关系,即。、治疗和闭锁的毛囊。的临界值被认为是重要的,概率较低级别(例如, )。

3所示。结果与讨论

与Carnevali和同事合作,我们已经报道,暴露在低剂量双酚a (5μg / L BPA)促进卵泡闭锁干扰基因的表达参与斑马鱼的发育和成熟卵巢。从这些结果和使用相同的卵巢收集和分子在前面的研究分析15),我们为特征的闭锁卵泡发展使用的形态学方法的分析。

卵巢部分控制和5μg / L BPA-exposed斑马鱼(BPA-zebrafish)加工)染色和用于描述形态或morphometrically闭锁的毛囊的面积对BPA的回应。

我们观察到双酚a改性的形态和区域闭锁的毛囊。大多数这些毛囊出现放大和脆弱的切片和包含空的区域(即。,组织学上可识别的白色区域)的外围局部或随机分布(图1(一))。明显的形态学分析表明,双酚a ( )增加平均面积闭锁的毛囊(3.27±0.08便士²)比对照组(1.9±0.08便士²)(图1 (b))。具体地说,BPA接触产生闭锁的毛囊,明显大(大不通的毛囊)(图1 (c)),这表明卵泡闭锁特别与BPA接触有关。数值评估我们的观察,我们认为的平均面积控制闭锁的毛囊(1.9便士²)作为参考价值和闭锁的卵泡数(即参考面积更高价值。p > 1.9²对应于大不通的毛囊)(图1 (d))。只有少数大不通的卵泡数量(min-max面积值从1.92到3.49便士²)是存在于对照组。相反,显著增加大闭锁卵泡的数量(min-max面积值从1.91到5.41便士²)是存在于BPA-exposed动物。统计分析(= 0.00003)表明“大不通的毛囊”的发生率显著高于BPA-exposed卵巢(CTRL与BPA, )。结果表明,双酚a诱导卵泡闭锁的特点是“大型”毛囊。

为了研究卵泡肿胀描述BPA-induced闭锁(BPA-atresia),我们试图确定卵泡阶段主要由暴露目标。特别是,我们研究了双酚a的影响previtellogenic卵泡发展和卵黄的阶段。卵巢部分控制和BPA-zebrafish)染色处理,用于分析形态、数量、增长和发展的卵泡阶段使用定性和定量histomorphometrical方法。

同意我们的先前的研究15],histomorphological组织的分析表明,所有卵泡阶段,从初级到成熟的阶段,目前在这两个实验(图组2(一个))。显然,在BPA-exposed卵巢(BPA-ovaries),没有形态变化是观察对对照组除了闭锁,如上所述,存在许多II期毛囊形态标记的特征通常由于III期卵黄的毛囊。事实上,我们注意到皮质肺泡囊的存在的过早形成和透明带(ZP)信封和卵黄颗粒。两人都非常明显,嗜酸细胞(见CTRL与BPA在图2 (b))表明BPA过早迫使卵泡增长阶段。类似于我们的观察,卵巢从斑马鱼暴露于BPA高剂量(10μg / L)显示皮质肺泡卵泡早期形成的透明带39]。有趣的是,最重要的一个应对estradiol-17报道β和环境雌激素是卵黄的感应信封zp蛋白质(44,45),这表明,在我们的实验模型,BPA影响卵泡增长通过干扰雌激素信号。因此,分子数据之前报道利用同一种动物的卵巢组织分析(此15]表明BPA接触表达下调雌激素受体的表达(esr1和esr2a)而没有修改steroidogenic基因转录。

越来越多的证据表明BPA影响早期卵泡的生长和数值增加卵巢中卵泡闭锁的(24- - - - - -26,29日,39,46]。在斑马鱼39,46),以及在不同哺乳动物(24,30.),双酚a减少原始卵泡的数量和诱发闭锁。在这两个鼠标和羊肉24,25),这种影响已经与卵泡招聘的加速度有关。同意这些发现,计数的卵泡阶段控制和BPA-zebrafish(图2 (c))透露,I期卵泡数量显著低于BPA-ovaries相比对照组( ),而第二阶段卵泡数量明显增加( )。令人惊讶的是,我们观察到的数量不会影响早期(第三阶段)和晚期(四期)卵黄的毛囊,还是成熟的。相反,早期和晚期之间的比率卵黄的毛囊明显减少BPA接触后,和卵巢中卵泡闭锁的数值更高(CTRL与BPA, )。这表明BPA能力促进闭锁,迫使卵黄的阶段。

来验证这个假设,我们调查了BPA影响过渡阶段III IV通过计算的第三和第四阶段卵泡数量相对总卵黄的国家。

报告的结果数据3(一个)和3 (b)指出,BPA暴露显著下降( )早期的百分比卵黄的III期与对照组(图3(一个))。相反,后期的百分比卵黄的四期显著增加( )在BPA-exposed动物(图3 (b)),证实假设BPA卵黄的加速发展的阶段。

完全,above-reported结果证明BPA接触引起双重效应,特别是在previtellogenic(卵泡招聘和增长)和卵黄的阶段,建议潜在的影响对卵巢储备功能的影响和闭锁。事实上,BPA的过渡阶段,我被迫II期和III期四期(即。早期到晚期)和“大闭锁卵泡的数量显著增加。”高发病率的II期毛囊建议进一步干扰卵泡发育。我们相信II期毛囊过早发展减缓他们的卵黄的条目通过干扰从previtellogenic过渡到卵黄的阶段。可能,这发生,因为雌激素受体(差别转录对这些esr1a和esr2a在我们的实验模型(之前报道15]。在协议中,几个转录的减少esr2a在卵巢的Gobiocypris rarus暴露于BPA (50μg / L 5周),并与独家previtellogenic和闭锁的毛囊(47]。更重要的是,雌激素受体的基因丢失esr2a / b在斑马鱼导致逮捕folliculogenesis previtellogenic II期(48)展示esr2卵泡增长的作用。因此,而esr1和esr2b在斑马鱼卵泡表达,只在体细胞,esr2a基因对BPA和表达在体细胞和生殖细胞,它是最丰富的表达形式在卵泡增长(49]。在斑马鱼,卵母细胞在早期阶段III,成熟无能。在卵黄的阶段,第三阶段毛囊进行卵黄形成导致增加滤泡大小。据报道,大晚四期卵母细胞显示膜孕激素受体表达增加(pgrmc),获得响应LHCGR-stimulated成熟因此发展成成熟的卵泡。之前报道的分子数据,利用同一种动物的卵巢收集组分析在此(15),表明BPA接触抑制基因的表达调节卵母细胞成熟(例如,lhcgr,pgrmc,esr1)。数据证明,BPA接触促进卵泡闭锁干扰的成熟阶段。

在这里,我们报告说,BPA卵泡招聘增加了表演舞台上i ii,迫使卵黄的过渡阶段,从早期第三到第四阶段后期,在不影响成熟卵泡的数量,这意味着双酚a生产“大卵泡闭锁的”独立于古典卵泡闭锁机制。

考虑到这些方面,我们假设BPA可能促进闭锁卵泡肿胀描述影响卵黄的增长超过了成熟的阶段。这个假设验证了评估的潜在“膨胀效应”对卵黄的BPA和成熟卵泡,卵泡的分析阶段III, IV, V在控制和BPA-ovaries。

在这两个实验小组,滤泡面积四期(图4)显著增加的面积相比,第三阶段( )。这种增加的效率明显高于BPA-ovaries比对照组( )证明BPA促进卵泡肿胀在卵黄的阶段。然而,滤泡面积第四阶段V相媲美,控制阶段表明发生了生理上的成熟。的确,没有观察到与异常成熟卵泡大小控制或暴露的卵巢。

虽然还需要进一步的研究来定义如果BPA的描述影响瞬态或永久性的,结果报道在此表明BPA接触主要影响卵泡早期阶段。我们表明BPA部队招募阶段我卵泡卵泡从第三阶段过渡到四期生产的四期毛囊异常放大和大不通的毛囊。我们建议BPA部队早期卵泡招聘和特别诱发闭锁促使卵泡增长机制与卵黄的阶段。有趣的是,据报道,BPA干扰卵黄蛋白原的转录表达和细胞间交叉的蛋白质(47,50)据报道是卵黄形成的关键蛋白质(51]。

4所示。结论

这里的形态学观察报道证明BPA干扰卵泡发展影响previtellogenic和卵黄的阶段。特别是,BPA接触(i)干扰的招聘阶段我卵泡按阶段II期过渡,(II)迫使卵泡从第三阶段过渡到第四阶段,(3)减缓卵泡发展从previtellogenic卵黄的阶段,后期(IV)加大卵黄的四期毛囊,并产生闭锁的(v)诱发闭锁卵泡特别大(即。,大卵泡闭锁的)。

我们建议BPA促进通过损害卵泡闭锁的招聘。我们提出一个潜在的卵泡闭锁模型特别对BPA(图5)中BPA促进早期招募阶段我卵泡闭锁的发展加快,迫使它们在previtellogenic(即进步。、快速I-to-II过渡阶段)和卵黄的(即。、快速III-to-IV过渡阶段;异常增大的阶段(四)阶段。我们相信II期毛囊过早发展(见过早出现的ZP和卵黄颗粒)减缓他们的卵黄的条目。这双酚a对卵泡发育的影响涉及BPA促进生产的大不通的毛囊独立于古典卵泡闭锁机制,对卵母细胞成熟的失败。这也许可以解释为什么,在我们的实验模型,BPA接触并不影响成熟卵泡的数量。

当然,进一步分析显然需要解码的分子机制促进闭锁对BPA,虽然我们的数据明确显示,卵巢斑马鱼足够敏感,来验证简单histomorphological浓度BPA环境的影响评价卵黄的晚期和闭锁的滤泡大小。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的意大利大学和研究(主要授予Cobellis 2010 - 2011), Regione坎帕尼亚(r . Pierantoni格兰特Legge 5/2007;5/2008 g·格兰特Legge Cobellis)和意大利德拉坎帕尼亚(2017年格兰特倾斜。药物Sperimentale g . Cobellis)。

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