文摘

冠状动脉疾病(CAD) 2型糖尿病是一种常见的并发症(T2D)。这个病例对照研究是为了确定代谢物之间的不同浓度T2D患者,没有计算机辅助设计CAD和描述涉及代谢机制有关。空腹血清样本的57 T2D主题,26(例)和31日没有CAD(控制),是针对163种代谢物的代谢产物分析。评估之间的联系代谢物水平和CAD、偏最小二乘法(PLS)分析和多元逻辑回归分析与调整CAD进行风险因素和药物。我们观察到分离的情况下,控制两类代谢物与CAD、显著相关,包括磷脂酰胆碱和丝氨酸。四个代谢物是独立于普通CAD风险因素显示最佳分离情况下和控制进一步选择。除了代谢物浓度的风险因素分析提出receiver-operating-characteristic曲线下的面积从0.72到0.88 (),为CAD分类提供改进的敏感性和特异性。血清磷脂和丝氨酸水平独立辨别T2D没有CAD患者。氧化应激和抗氧化能力降低导致较低的代谢物浓度可能由于膜磷脂成分和加速降解的变化。

1。介绍

2型糖尿病(T2DM)病人体内是一个复杂的代谢紊乱的特点是肝葡萄糖生产异常、胰岛素抵抗,和胰腺胰岛素分泌受损1,2]。慢性高血糖症2型糖尿病与微血管和macrovascular并发症(3),2型糖尿病是冠状macrovascular疾病的危险因素,自主功能障碍,心脏衰竭和冠状动脉微血管疾病(4]。

冠状动脉疾病(CAD)是最常见的心血管疾病,估计macrovascular并发症患病率6.9%的男性和6%的女性(5]。在2012年,估计有1750万人死于心血管病,占全球死亡人数的31%。这些,估计有740万人因冠心病死亡。糖尿病患者经历两到四倍的风险增加开发CAD或外周动脉疾病(PAD)与非糖尿病患者相比控制(6,7]。此外,相关并发症的糖尿病(CAD和高血压)和代谢紊乱(高血糖症,dyslipidaemia)可以导致舒张期和收缩期心肌功能的改变(8]。背后的潜在机制(s)更有可能发展冠状macrovascular并发症(例如,CAD和垫)还没有完全理解。为CAD有几个公认的危险因素,他们中的许多人被代谢性质的(9,10]。这些风险因素主要包括年龄、性别、体重指数、糖化血红蛋白,糖尿病持续时间,血压,血脂,脑利钠肽(BNP)和白蛋白。然而,机制(s)不能完全解释这些风险因素之间的相互作用(11]。除了这些众所周知的风险因素,glycerophospholipids和鞘脂类,主要是与脂蛋白颗粒导致动脉粥样化形成有关,因此预防占CAD的风险升高12,13]。与完整的机械理解,个人在心血管事件的风险最高可以识别和发展可能会阻止(9,10,14,15]。

寻找生物标记物或算法预测患心血管疾病(CVD)的风险,新技术应用和筛选工具,包括提供多方面的参数(10,16- - - - - -19]。代谢组学主要是“组学”研究的一部分相关的高通量鉴定和量化的内生和外生小分子代谢物(< 1.5 kDa)在生物系统20.]。这些代谢物的分析在血清和血浆等体液可以作为一个有前途的工具在疾病的诊断15,21]。因此,代谢物变化的概要文件是生物标志物的潜在来源的报告改变体内由于疾病或药物治疗(14,22,23]。例如,一些研究调查代谢物与CAD和概要文件的主题没有CAD,报告在acylcarnitines和氨基酸浓度显著差异这两组患者的9,10,17,24]。然而,这些研究没有分析其他类代谢物,如磷脂酰胆碱和鞘磷脂膜功能发挥重要作用[25),激活酶,与细胞信号转导(26]。只有少数研究报告的差异水平的磷脂酰胆碱和鞘磷脂27- - - - - -30.),虽然不是所有受试者T2D患者在这些研究。

此外,有几项研究提供证据表明,代谢物在小鼠遗传(31日]。国王和他的同事们加强这个事实通过展示代谢物的遗传资料在人类家庭CAD的早发性(32]。这可能给暗示CAD在某种程度上可以通过代谢物介导等作为监管信号的控制血压。这些代谢“标记”可以给信息有关的代谢途径的影响疾病和帮助识别疾病的高危个体,有助于优化筛选程序的疾病以及后期并发症(14]。

在这项研究中,我们描述163代谢物浓度(acylcarnitines,氨基酸、磷脂酰胆碱和鞘磷脂)57 T2D患者,包括与CAD并发症26例。我们的目标是双重的。首先,我们想确定循环代谢产物辨别个人有无CAD。第二,我们旨在描述潜在的分子机制相关的计算机辅助设计。

2。材料和方法

2.1。研究人群

这项研究的参与者选择从住院病人在赫兹-和Diabeteszentrum北威州(民北威州)在坏Oeynhausen书面知情同意。研究对象包括61名患者被诊断为2型糖尿病根据实际指导的美国糖尿病协会(ADA)和欧洲糖尿病研究协会(2)。所有患者在空腹状态下采样。四个患者被排除在外,他们三个被重新归类为有1型糖尿病在招聘和一个有糖尿病,因为全胰切除术。总的来说,57例2型糖尿病是可用的数据分析。

所有患者接受口服抗糖尿病的药物治疗,包括使用要么DPP-4抑制剂(sitagliptin vildagliptin)磺酰脲类药物(glimepirides、格列本脲)thiazolidinediones(吡格列酮),双胍类(二甲双胍)GLP-1-analogon (exenatide),快或者长时间胰岛素,或它们的组合。胰岛素是单独作为主要化合物分类治疗口腔摄入(口服抗糖尿病的代理)或口头+胰岛素和胰岛素(胰岛素治疗)。作为进一步的药物治疗,患者服用降压药妥协(β阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素ⅱ受体拮抗剂和抗凝血剂)和降脂药物(他汀类药物,一类)。选择一个病例对照研究设计比较的差异代谢物浓度和CAD。因此,参与者被分为两组根据CAD有过去。参与者资格CAD组如果他们临床血管疾病的诊断在至少一个容器定义为心肌梗死史,或历史的冠状动脉,颈动脉,或外周动脉血管,或心肌缺血的历史的运动压力测试,或与任何心肌缺血心脏成像的历史。标准化考试和测试应用于研究参与者包括临床生物化学和进一步的详细调查心脏病根据当前医学指南或其他并发症。

2.2。抽样

血了一夜后迅速在早上(至少8小时)。采样后20分钟内,血液是离心机(3000×g 4°C, 10分钟)血清收集,瞬间冷冻和储存在−80°C,直到分析。

2.3。有针对性的代谢组学测量

代谢物检测和量化的代谢组学平台进行基因组分析中心,利用流动注射分析亥姆霍兹慕尼黑中心的三重四极质谱(FIA-MS / MS)和绝对的容器™p150工具包(奥地利因斯布鲁克Biocrates生命科学AG))。10个μ血清L, 163种代谢物被量化,包括免费的肉碱,40 acylcarnitines, 14个氨基酸,己糖(总和),15 lysophosphatidylcholines, 15 77磷脂酰胆碱和鞘脂类。试验过程的详细描述和命名发表之前33,34]。

每个代谢物都必须满足以下三个条件,确保数据质量(35,36):(1)平均值的方差系数(CV)的代谢物三个质量控制,(2)90%的测量样品浓度对上述代谢物检测极限(LOD),和(3)两个重复测量的代谢物之间的相关系数在144年重新分析样品。163年测量的代谢物,131年终于通过了质量控制导致数据集包括己糖的总和(H1), 14个氨基酸(AA), 24 acylcarnitines (AC), 13个短信,34 diacyl个人电脑(PC AA), 37烷基酰基电脑(PC ae),和8个lysoPCs。

2.4。统计分析

统计分析使用统计软件包R(3.3.1版本,http://www.r-project.org)。

描述性特征给出平均值±标准偏差(SD)(表1)。临床特征研究的参与者使用非参数Mann-Whitney检测显著差异U测试。一个值小于0.05被认为是具有统计学意义。

对所有分析,来保证不同代谢物水平之间的可比性,代谢物的浓度是自然对数转换和标准化(意味着= 0和SD = 1)37]。

偏最小二乘判别分析(PLS-DA)应用于独立T2D T2D药物(即患者不同。,胰岛素治疗和口服抗糖尿病的药物)以及CAD的状态。

逻辑回归分析进行评估的差异代谢物概要文件识别独立主体之间没有CAD CAD和主题。调整基线特征的差异,变量是基于之前考虑的临床相关性对心血管事件的风险(CAD或冠心病)。每个代谢物单独评估。包括潜在的混杂因素,我们协变量的调整为两组:(1)年龄和性别的粗糙模型;(2)年龄、性别、体重指数、糖化血红蛋白,糖尿病持续时间、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白,高密度脂蛋白胆固醇比率,收缩压(SBP)、舒张压(菲律宾),白蛋白浓度、药物抗糖尿病的药物(即。、降压药、降脂剂)和表皮生长因子受体(38完整的模型。口服抗糖尿病药和胰岛素不在,因为治疗方案都是均匀分布在整个组织。吸烟、饮酒和心脏病家族史不能作为预测变量由于缺乏或虚弱的自我报告数据。

代谢物选择运用逻辑回归分析,随机森林,逐步逻辑回归方法的选择。首先,代谢物选择以下两个标准:如果他们会见了在逻辑回归(1)重要每代谢物与调整所有变量和(2)重大30随机森林方法中最重要的变量,所有131种代谢物作为协变量和变量。第二,选择代谢物再次选择与逐步逻辑回归的选择根据Akaike信息准则(AIC)。接受了手术治疗100次,选择至少40次代谢物都作为最后的标记。

评估物流模式分类情况和控制的一组不同的标记(临床标记、代谢物标记和两种标记),接受者操作特征(ROC)分析离开(厕所)进行了交叉验证。厕所在使用模型拟合方法忽略了一个观察其余观测计算的预测概率忽略观察。交叉验证,绘制ROC曲线,计算曲线下的面积(AUC)进行R使用包引导和ROCR [39),分别。不同的模型符合似然比检测方法进行了比较。

3所示。结果

3.1。研究人群的特点

CAD病例和对照组(表匹配1)。因此,CAD例之间的临床参数的特征和控制是相似的,因为他们没有显示显著差异在糖尿病持续时间、BMI、糖化血红蛋白、胰岛素原、c -肽、SBP TG、高密度脂蛋白胆固醇、白蛋白、肌酸激酶、CRP和Lp (a) ()。然而,CAD病例大约15岁女性,包括少于控制(表1)。值肌酐、尿素和法国都显著提高,和菲律宾开发水平,总胆固醇,低密度脂蛋白胆固醇,肾小球滤过率(GFR)显著降低在CAD病人与病人没有CAD ()。然而,CAD患者往往表现出长期患2型糖尿病和一个较小的BMI相比,患者没有CAD ()。口服制剂的使用类似的两组(6 CAD患者和11例没有CAD),经常和患者两组胰岛素治疗(20 CAD患者和20名患者没有CAD)。的CAD患者降压药和降脂药物往往规定相比,专注的病人。

3.2。差异代谢物资料揭示了偏最小二乘判别分析

偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示出受试者在两组(图的分离1):CAD患者代谢物水平较低而没有CAD患者。考虑患者的性别,男性和女性在这两种情况下并没有显示出明显的差异和控制。此外,关于药物摄入量,弱分离也可以观察到。在CAD和控制情况下,代谢物浓度较低,因此患者高胰岛素相比,患者口服抗糖尿病的药物。

3.3。识别与CAD代谢物显著相关

进一步研究代谢产物的独立协会和CAD、多元逻辑回归分析与调整为每个131种代谢物CAD的风险因素,包括年龄、性别、体重指数、糖化血红蛋白,糖尿病持续时间、TG、LDL:高密度脂蛋白比、降脂药物,SBP,类似降压药白蛋白和表皮生长因子受体。我们发现16从三个不同的类代谢物的代谢产物(1 AA, 11个人电脑,4 SMs)大大不同主题之间有或没有CAD ()原油logistic回归模型,例如,电脑aa C36:1 (38.95±9.40μM和50.84±12.23μ米,)和丝氨酸(99.92±20.37μM和86.05±18.89μ米,)(见表在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/7938216)。对于所有代谢物,CAD患者较低水平相比,那些没有CAD(表)。在完整的模型中,九个代谢物被发现与CAD显著相关(表)。模型符合信息系数、SEs和值9最后的完整模型显著相关代谢物提供表。此外,我们随后雇佣了两个额外的统计方法,参数的非参数随机森林逐步选择,识别最重要的生物标志物的候选人。代谢物选择显示四个代谢物(C0、丝氨酸、PC aa C36:1,和PC aa C38:3)显示最重要的(与CAD(表)联系2)。选择四个代谢物,箱线图被吸引到图形演示CAD之间的差异代谢物浓度情况下和控制(图2)。

3.4。评估模型和ROC曲线

为了评估选择模型的性能数据,ROC曲线计算(图3)。为此,两个不同的模型进行了比较:(1)协变量模型包括临床只有和(2)一个模型的结合四个选择的代谢物和临床变量。模型与临床变量显示中度歧视能力(AUC = 0.72)。真和假阳性率提高当添加四个代谢物的临床模型(AUC = 0.88),确认好选择模型的性能数据()。

4所示。讨论

我们对2型糖尿病患者的代谢有历史的CAD或不是。尽管57受试者的数量很小,我们可以证明,血清代谢是独立与CAD协变量调整后多个临床相关。维尔茨等人发表的结果一个核磁共振代谢组学方法在三个人群为基础的群组(全国FINRISK研究中,索思豪尔和布伦特重新审视(SABRE)研究中,和英国女性的心脏和健康研究)显示的苯丙氨酸浓度升高和单不饱和脂肪酸和低浓度的ω- 6脂肪酸和二十二碳六烯酸与未来心血管事件的风险更高(10]。我们的方法不是通过核磁共振,而是流动注射分析质谱;因此,我们确定了,而小部件与代谢中间体。最近,萨特等人分析了lipidome CAD患者相比,急性心肌梗死患者和健康对照组和确定一系列glycerophospholipids和鞘脂类作为低CAD和MI组与健康对照组相比。此外,他们可以证明,在一组,他汀类药物治疗不影响glycerophospholipid和鞘脂类的水平(30.]。然而,我们包括高密度脂蛋白,低密度脂蛋白比和降脂的任何形式的物质我们的回归模型。通过使用等离子lipidomics,多等人发现缩醛磷脂水平降低稳定和不稳定CAD患者包括30%的糖尿病患者在CAD组,确认这些代谢物的概念卷入CAD的临床40]。

我们发现9个代谢物在2型糖尿病患者明显不同CAD相比没有CAD协变量调整后多个临床,包括免费的肉碱,七个人电脑,丝氨酸。随后的代谢物选择使用随机森林逐步选择分析显示四个代谢物(C0、丝氨酸、PC aa C36:1,和电脑aa C38:3)之间最明显不同的情况下和控制。优化两类磷脂成分和内容,包括电脑、磷脂酰乙醇胺(PEs) lysoPCs,和PE-based缩醛磷脂,具有巨大的重要性对维持细胞完整性和最优膜功能(25]。他们在酶的激活,参与生物跨膜信号转导(41]。这方面,代谢产品的磷脂可以作为第二信使在调节细胞功能26]。此外,磷脂是高度相关的关键过程,如细胞生存,炎症,和氧气压力、血管疾病的关键因素(42,43]。变化的内容和组成磷脂膜的提出与心脏有关的疾病和心脏衰竭相关膜损伤(44]。心磷脂代谢,及其在T2D metabolisation更高。因此,CAD甚至降低了免费电脑内容。

有证据表明,循环磷脂水平变化可能与T2D的病理,dyslipidaemia,和心血管疾病30.,45,46]。出于这个原因,血清磷脂水平变化可能与心脏功能障碍类似改变其生物合成和降解由于膜缺陷。

4.1。磷脂酰胆碱

磷脂酰胆碱是磷脂行列式在哺乳动物的心脏。他们是通过胞二磷合成(CDP)途径需要胆碱,由三个酶步骤(47]。磷脂酰胆碱的生物合成受胆碱的吸收,能量状态的目标组织,和病原反应酶的调制48]。我们的研究表明,一些磷脂酰胆碱是降低2型糖尿病受试者CAD。这些发现表明,心肌膜受损导致改变磷脂含量和组成。来弥补这一缺陷,磷脂酰胆碱从循环实验,增加血清磷脂酰胆碱含量低。这是按照林和他的同事们报告的结果循环水平较低的个人电脑16:0和PC 18:2沉默患者由于冠心病心肌缺血与CAD密切相关。他们合理的降低磷脂酰胆碱水平由于供应不足的ATP和CTP相干T2D能源的生产。此外,他们观察到膜的变化,认为这些变化源于缺血导致心肌酶的变化导致细胞膜损伤(28]。伯帝等人也报告后脂肪酸降低缺血和一个表达下调的趋势提取脂肪酸后局部贫血(49]。低水平的电脑缩醛磷脂已被证明与氧化应激有关,常见的糖尿病和明显的糖尿病+ CAD (50]。此外,显著减少choline-containing化合物说发现了一种“缺血性记忆”(49]。这也许可以解释我们CAD的低水平的磷脂酰胆碱组。

以下4.4.1。丝氨酸

虽然是一个不重要的氨基酸,丝氨酸的重要性在不同的生物合成途径如甘氨酸、半胱氨酸、色氨酸生成,以及phosphoglyceride-synthesis。丝氨酸是必不可少的C1 tetrahydrofolate代谢片段。丝氨酸参与嘌呤和嘧啶代谢和免疫反应的免疫球蛋白和抗体合成生产。除了这些功能之外,丝氨酸和苏氨酸是O-linked热点β-N-acetylglucosamination [51]。Endo等人能够表明,增加氧化应激水平增加有关宽容的丝氨酸在老鼠模型中增加氧化应激通过操纵醛脱氢酶2的功能。丝氨酸浓度从而增加关系密切防止氧化应激增加,进而增强高葡萄糖浓度(52]。是否减少丝氨酸含量检测到在我们的CAD群组的关系减少储备抗氧化能力或降低磷脂合成需要在将来的研究中评估。

4.2。优势和局限性

目前的研究是有限的样本容量的限制;因此不可能充分证实并回顾性探讨子组;研究建立了作为探究的方法来确定代谢物在糖尿病与CAD相关联。进一步调查在较大的样品或cohorts-even prospectively-will提供更微妙的代谢变化的检测和足够的精度估计的每个标记的工具,允许适当的每个组件的相对权重。此外,我们不包括急性冠脉综合征患者。因为我们长期恢复的患者,其他代谢物的变化资料,如水平acylcarnitines或支链氨基酸作为国王和他的同事们最近与CAD相关的,可以中和(9]。

我们研究的优点如下:(1)我们非常注意评估临床CAD混杂因素通过使用一个健壮的临床与调整脂质模型,药物,和肾功能。(2)我们使用高通量分子技术,允许各种不同的代谢物的检测。尽管如此,这些代谢物的血清浓度的定量需要专门的中心和许多实验室可能没有这些功能(24]。除此之外,代谢物的概要文件显示个人间由种族和其他人口统计和生物多样性11例如,]。虽然这种可变性的决定因素的调查正在进行,多个测量随着时间的推移可能需要改善的准确性代谢物浓度的精确测量。此外,抽样特定组织将是一个优势,因为他们作为近端代谢物的来源,使代谢变化的本地化,并可能有助于评估签名的敏感性和特异性的血清代谢。然而,这将是很难进行,因为这是一种侵入性手术。

5。结束语

总之,我们的研究结果提供的证据表明,血清磷脂水平以及丝氨酸水平独立改变的CAD。T2D氧化应激,这是增加,导致内容的深刻变化和生物膜的组成和加速磷脂降解,导致代谢物水平较低的个人电脑和丝氨酸。这些发现可能有助于更好地了解疾病的潜在机制,改善分层高危的患者,优化筛选和诊断疾病和并发症。然而,这项工作为未来的研究被认为是一名飞行员。因此,更多和更大的规模的性能在未来的环境会帮助代谢组学的研究来证实我们的发现和确定新的心血管疾病生物标志物。

信息披露

托马斯·Illig汉诺威的当前地址统一的生物,30625汉诺威,德国汉诺威医学院。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

补充材料