性激素结合球蛋白修改在前列腺癌细胞中睾酮作用和新陈代谢

文摘

性激素结合球蛋白(SHBG)是主要的血清性激素的载体。然而,越来越多的证据表明,SHBG性和调节细胞内的激素行动中扮演了重要的角色。本研究旨在确定SHBG睾丸激素发挥作用,吸收,代谢,和行动LNCaP前列腺癌雄激素敏感细胞株。掩饰的睾酮,SHBG SHBG在睾丸素吸收的影响,新陈代谢,调节雄激素反应基因,细胞生长进行了评估。LNCaP细胞内化SHBG睾酮的独立过程。睾酮被迅速吸收和射流为睾酮葡糖苷;然而这种效应降低了SHBG的存在。SHBG增加,而不是减少睾丸激素的生物利用度,进一步增加testosterone-induced前列腺特异抗原的表达和增强testosterone-induced减少雄激素受体信使rna表达。38小时后睾酮治疗细胞形态的改变,经济增长下降;然而,cotreatment SHBG与废除这些抑制性效应。 These findings clearly demonstrate that internalised SHBG plays an important regulatory and intracellular role in modifying testosterone action and this has important implications for the role of SHBG in health and disease.

1。介绍

性激素结合球蛋白(SHBG)是主要的血清中性激素载体蛋白。在生理条件下,大约70%的睾酮(Te)绑定到SHBG与高亲和力,大约20 - 30%白蛋白弱束缚,剩下的1 - 2%是免费的(1,2]。青春期的增加血清睾酮在男性在20岁的时候达到高峰,直到第八十年保持稳定。童年后,SHBG下降20岁,然后保持稳定,直到第六十年渐进,逐步升高(3]。

多年来它已经被广泛接受,SHBG的主要功能是运输性类固醇激素靶组织,SHBG调节自由性激素的水平,可以进入靶细胞(4,5]。然而,近年来,已确定SHBG的额外角色。有强有力的证据表明,SHBG调节类固醇激素信号转导在质膜(6SHBG),越来越多的证据表明,可能是由细胞和细胞内生物功能(7]。一项研究表明,通过Megalin SHBG性受体鼠卵黄囊细胞和Megalin缺陷小鼠显示缺陷类似于动物雄性或雌性激素受体拮抗剂治疗(4]。SHBG掩饰也被描述在室周的神经元等其他细胞和成纤维细胞,表明它可能有一个细胞内的作用[8,9]。细胞内的表达SHBG老鼠近端小管细胞已被证实增加吸收³H-dihydrotestosterone (DHT)和延长雄激素反应基因的表达(10]。

本研究旨在确定LNCaP前列腺癌雄激素敏感细胞株(11SHBG)内在化;SHBG吸收是否会影响Te吸收;SHBG Te功能和代谢的影响;和和Te SHBG细胞生长的影响。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类前列腺癌雄激素敏感细胞株LNCaP克隆第五代计算机(美国弗吉尼亚州写明ATCC)被选为本研究。细胞培养在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)介质(Sigma-Aldrich,维多利亚,澳大利亚)补充10%胎牛血清的边后卫,500 U /毫升青霉素链霉素(Gibco,维多利亚,澳大利亚),和5μg / mL plasmocin (InvivoGen,维多利亚,澳大利亚)常规细胞培养孵化器。所有实验都是在无血清培养基进行消除和白蛋白污染SHBG的边后卫无酚红,可以绑定到类固醇受体(12]。

2.2。试剂

SHBG纯化本土人类蛋白质从菲茨杰拉德行业购买国际,美国马。SHBG从孕妇的血清纯化配体亲和色谱法纯度> 98%的剩余类固醇内容不详。睾酮是购自Sigma-Aldrich,维多利亚,澳大利亚,准备作为一个500毫米的股票乙醇。睾酮是稀释> 5×10⁶在无血清培养基(最后一次< 0.00002%乙醇)和100海里的最大最终浓度用于实验。乙醇对LNCaP细胞生长无明显影响,浓度在0.00001%和1%之间超过96小时(数据没有显示)。

除非指定的所有其他试剂从Sigma-Aldrich购买。

2.3。Alexa萤石®546 SHBG标签和掩饰

SHBG纯化本土人类蛋白质标记使用Alexa萤石546标签工具包(生活技术,维克,澳大利亚)。短暂,1毫升的2毫克/毫升SHBG纯化蛋白质与Alexa萤石孵化546活性染料在室温下2小时。然后Alexa萤石546 labeled-SHBG (Alexa546-SHBG)净化通过Bio-Gel P-6凝胶柱(BioRad、钙、美国)。确定标签SHBG的浓度和荧光标记的程度,共轭解为280 nm和540 nm Nanodrop 2000分光光度计(热科学、数控、美国)。

Alexa546-SHBG吸收实验,细胞serum-starved 1小时然后孵化125海里Alexa546-SHBG±25 nM Te血清RPMI的1小时在室温下。细胞用磷酸缓冲盐(PBS), 2%多聚甲醛固定,permeabilised在PBS 0.2% Triton x - 100。细胞被costained Alexa488-phalloidin突出了β肌动蛋白骨架和核与DAPI染色。盖玻片是安装延长®黄金不变色试剂。图像捕获使用DeltaVision反褶积显微镜(美国华盛顿特区应用精度)。证实了吸收Alexa546-SHBG costaining内化与单克隆抗体anti-SHBG Alexa546-SHBG(σ,维多利亚,澳大利亚)共轭Alexa488标记的第二抗体。的colocalisation Alexa546(红色)和Alexa488(绿色)歧视Alexa-SHBG从内生,SHBG沾Alexa488只。治疗用无血清培养基和Alexa546染料只被用作消极的控制。

SHBG LNCaP细胞分泌物没有检测到(数据未显示)通过免疫印迹或Unicel®免疫测定(降低检测极限< 2海里),尽管细胞培养基是集中12;因此内生SHBG水平上并不会有什么影响我们的实验使用SHBG 125海里。

2.4。串联质谱测量Te的吸收

细胞培养在6-well板块和serum-starved吸收实验前4个小时。采用无血清细胞培养技术吸收介质包含25 nM (30 pmoles /)的Te±125海里SHBG 1, 4, 24小时。控制细胞培养基。在每个时间点的培养基收集Te测量。细胞层仔细洗了2毫升PBS (pH值7.3)然后用皮尔斯m /哺乳动物细胞细胞溶解蛋白质提取试剂(热费希尔科学)中提取可溶性蛋白。与皮尔斯•瑞帕进一步裂解裂解和提取缓冲(热费希尔科学)被用来从细胞膜和细胞核提取剩余的蛋白质。Te测量原始吸收介质(25海里),细胞培养基,细胞溶解产物用串联质谱分析。Te以分数都表示为一个百分比的Te原始吸收介质。细胞Te包括所有Te以溶解产物包括细胞溶质,细胞膜和细胞核。总Te包括所有Te测量细胞分数和细胞培养基。

液相色谱串联质谱(LC msm)紧随其后是用来测量Te水域™超高液相色谱(UPLC) Acquity系统。简单、样品(2毫升96深孔板)沉淀了3卷相当于50 mM硫酸锌/ 40%甲醇包含一个内部标准(睾酮d2)。蛋白质沉淀后,样本离心机和板被转移到一个autosampler。一个整除的50μL是注入到水域在线样品经理(OSM)。提取集中到MassTrak XBridge C18 OSM 10μm墨盒,用30%甲醇洗净,然后转换成线,直接筛选了UPLC系统。分析物的分离Acquity本·C₁₈2.1×50 mm列。柱洗脱液是导演(没有流分裂)的离子源水Xevo TQ-D串联四极女士,在积极的应急服务国际公司的经营模式。下面的量词和限定符转换利用:睾酮(289.1 > 97.0,289.1 > 109.0)和睾酮d2 (291.1 > 111.0)。梯度是回到初始条件在准备下一个示例中,目前正在准备OSM并行。样品之间的周期时间是3分钟。空白的极限是0.04 nmol / L interrun不够精确的9.8%为睾酮0.9 nmol / L。

2.5。早期解离的Te-Glucuronide

测量Te-glucuronide形成和射流介质是由消化的细胞培养基大肠杆菌 葡萄糖醛酸酶(σ,维多利亚,澳大利亚),其次是测量LC Te的男男同性恋者。酶早期解离Te-glucuronide是利用两种不同浓度的优化β葡萄糖醛酸酶(200 U /毫升和400 U /毫升),两种不同稀释的样本(培养基整洁稀释1:10)培养时间为24小时。最大早期解离是实现整洁的孵化与200 U /毫升样品β葡萄糖醛酸酶24小时37°C。Te-glucuronide中没有检测到细胞溶解产物;因此只有流出Te-glucuronide在细胞培养基测定。

培养细胞后25 nM (30 pmoles /) Te±125 nM SHBG 4或24小时,培养基稀释在同等体积的0.25米磷酸钾缓冲,pH值6。单位/毫升大肠杆菌 葡萄糖醛酸酶(σ,维多利亚,澳大利亚)和孵化在37°C(24小时13]。量化Te-glucuronide,两套相同的样本有或没有准备β葡萄糖醛酸酶。Te的数量在每个样本以LC男男同性恋者,表示为一个百分比的Te原始吸收介质。非结合的Te之前检测到消化β葡萄糖醛酸酶。治疗后β葡萄糖醛酸酶和非结合的先前glucuronidated Te测量;因此非结合的Te的值减去从这个为了量化glucuronidated分数。

2.6。定量实时聚合酶链反应(rt - PCR)

总RNA分离使用RNeasy迷你包(试剂盒,维多利亚,澳大利亚)。RNA浓度和质量测定使用NanoDrop - 3000分光光度计(美国NC NanoDrop Technologies, Inc .)。4微克的总RNA reverse-transcribed提供200个单位的上标三世逆转录酶(生命表达载体技术、钙、美国)和0.5μ克的低聚糖(dT) 15个引物(罗氏诊断,曼海姆,德国)反应20卷μ使用3 l . rt - pcr进行μL (cDNA(代表6 ng RNA), 0.5μ每个引物(表的M1),由于“快速上手”项目SYBR绿色PCR大师(罗氏诊断,曼海姆,德国)转子基因rg - 6000 (Corbett研究、新南威尔士、澳大利亚)。量化每个样本的基因表达谱,每个标准曲线的效率取决于其斜率和比较阈值。数据提出了有针对性的mRNA的数量比(任意单元)与辅助β基因2-microglobulin正常化(β2米)

2.7。量化的Alexa546-SHBG吸收

LNCaP细胞(~ 80000细胞/)培养在24-well盘子48小时。血清饥饿后,细胞被孵化的组合Alexa546-SHBG±Te和使用一个IncuCyte变焦™活细胞成像系统成像(美国MI埃森生物科学)阶段和红色通道和扫描每隔3小时总共30小时。潜伏期结束时,细胞被洗的酸溶液(甘氨酸200毫米,150毫米氯化钠,pH值2.5)去除表面束缚Alexa546-SHBG [14]。IncuCyte放大软件被用来量化的红色的物体9不重叠的图像/。数据意味着每个图像的红色的物体数量。

2.8。细胞生长试验

LNCaP 24-well板上培养的细胞~ 35000细胞。血清饥饿细胞处理后的各种组合Te±SHBG和孵化IncuCyte缩放设置为扫描每3个小时到86小时。扩散的动态测量和数据分析进行使用IncuCyte放大软件根据制造商的指示。平均值的百分比计算融合使用9不重叠的图像/。提出了数据对象相融合的百分比。

2.9。统计分析

使用GraphPad棱镜执行统计分析软件(GraphPad软件有限公司、钙、美国)。对比组是由单向方差分析与图基的测试。≤0.05的值被认为是重要的。所有实验至少重复三次在不同的细胞培养和执行每个治疗组的一式三份。

3所示。结果

3.1。掩饰的Alexa546-SHBG

两种方法被用来量化Alexa546-SHBG吸收。首先,与Alexa546-SHBG孵化后,使用DeltaVision反褶积的细胞成像显微镜(图1(一))。证实了掩饰的Alexa546-SHBG生成正交视图和一系列的堆栈的图像。红色荧光信号代表Alex546 SHBG标记在细胞培养观察Alexa546-SHBG(图1(一)(3))。没有红色的信号中观察到负控制孵化与非结合的Alexa546染料(图1(一)(2)),确认Alexa - 546而不是SHBG Alexa染料本身是由细胞内化。此外,性Alexa546-SHBG(红色)和一个Alexa488 colocalised(绿色)标记anti-SHBG抗体(图1 (b)SHBG)进一步证明性同时还被共轭Alexa546染料。内源性SHBG与Alexa488彩色只有anti-SHBG抗体(绿色)。其次,量化性Alexa546-SHBG IncuCyte变焦技术使用。剂量依赖的Alexa546-SHBG观察(图1 (c))。添加Te Alexa-SHBG吸收(图上没有显著的影响1 (d))。很弱的信号中检测出Alexa546染料处理文化和酸洗液之后,没有检测到信号。

3.2。在Te SHBG吸收的影响

孵化与25 nM Te 1, 4,导致24小时快速吸收Te其次是细胞水平的下降(图2(一个))。细胞Te水平达到一个小时(17.84±0.31%),然后拒绝%,分别由4和24小时,%(图2(一个))。相比之下,在125 nM SHBG的存在,细胞在1小时(Te水平降低%)和稳步上升%,% 4和24小时。在24小时内,细胞Te与Te + SHBG水平细胞孵化大约一半的细胞治疗Te孤单。

图2 (b)显示了总Te测量细胞溶解产物和细胞培养基。LNCaP细胞培养时仅在Te,%的Te原始吸收介质测量但下降到1小时%,然后分别为% 4和24小时。在Te SHBG +细胞培养时,Te测量在三个时间点(没有明显变化%,%,% 1,4,24小时,职责)。二氢睾酮中没有检测到任何的样品。

3.3。Te-Glucuronide形成

细胞暴露于25 nM Te±125海里SHBG 4和24小时;然后细胞培养基是收集和处理β葡萄糖醛酸酶。当LNCaP细胞培养在Te 4小时,%的Te glucuronidated和流出%的Te非结合的(图2 (c))。然而,当SHBG还补充说,%的Te glucuronidated,%的Te非结合的。在文化与Te 24小时之后,LNCaP细胞glucuronidated流出%的Te,只有%仍非结合的。再次,Te glucuronidated时细胞孵化SHBG与Te和24小时%的Te glucuronidated相比%非结合的。

3.4。Te和SHBG LNCaP细胞生长的影响

LNCaP细胞融合在最初被播种20%,38小时后培养细胞confluency达到35 - 40%无治疗组(图之间的区别3(一)(a))。细胞无血清培养基中生长良好,长达86小时。只接触SHBG没有改变细胞生长。然而38小时后在文化,这些细胞的增长以剂量依赖的方式拒绝接受1,25,100 nM Te。增加25或125海里SHBG取消Te的抑制效应以剂量依赖的方式(数字3(B)和3(C))。此外,细胞培养显示仅在Te形态的变化,细胞变得圆润,而不是分散和分离培养板(图3(b) (b))。控制这些SHBG与Te孵化+细胞和没有这些形态变化(数据3(A)和(b)3(b) (C))。

3.5。在Te-Sensitive SHBG基因表达的影响

图4(一)显示治疗的成对比较LNCaP细胞为0,1,10日和25 nM Te孤独和与SHBG的25 nM的24小时。令人惊讶的是,SHBG的,尽管以前减少Te吸收,显著增强Te upregulation PSA mRNA表达在10到25 nM (Te浓度)(图4(一))。当细胞被孵化与25 nM SHBG + 0, 1、5、10、25 nM Te(图4 (b)),PSA的表达增加了Te ()。当细胞被孵化与10 nM Te 0, 10日,25日,或50 nM, SHBG PSA mRNA表达增加与越来越多的SHBG最高25 nM SHBG ()(图4 (c))。

在相同的样本,雄激素受体(AR) mRNA表达下降了Te和表达是进一步减少了额外的25或50 nM SHBG(图4 (d))。SHBG mRNA表达显著减少了Te ()(图4 (e))。此外,SHBG SHBG表达的差别进一步减少Te对这些SHBG浓度;然而这并没有达到统计学意义。

4所示。讨论

SHBG hepatically产生的主要作用为血清性激素是有据可查的载体(5,15]。SHBG表达中也得到了证实性激素目标组织如人类前列腺癌(16,17],LNCaP细胞[18),睾丸,十二指肠、卵巢、胎盘、近端小管上皮细胞(PTEC),和大脑皮层以及几位癌症10,15,19- - - - - -21]。SHBG的高表达在前列腺癌组织与贫穷有关临床病理的特点表明前列腺癌的进展(22),或许是由于长期雄激素反应基因的表达(10]。它也提出,在本地监管和生产SHBG可能注定要参与在前列腺细胞膜信号(19]。使用各种技术方法我们已经证实LNCaP细胞占据SHBG以剂量依赖的但不是雄激素依赖的方式。

众所周知,SHBG Te的减少细胞吸收;但是我们已经证明,SHBG也保持稳定水平的摘要Te和生理相关的细胞内Te水平减少Te glucuronidation和流出。另一项研究也表明,在30 nM DHT LNCaP细胞孵化glucuronidated DHT的85% 5天。SHBG的140海里,95%的DHT不是被细胞和保持在中23]。这种快速失活的Te glucuronidation已经证明在人类临床研究中,一个单一的口服剂量的Te没有改变血清总Te水平水平但迅速和显著提高血清中共轭Te (24]。但我们承认自由Te健康男性的水平低得多(174 - 729年pmol / L (25]),在这项研究中,使用在活的有机体内SHBG是永远存在的。SHBG减弱或消失时,多余的自由Te可以进入细胞和oversaturate ARs,因为它已经被报道,基于“增大化现实”技术的饱和发生在前列腺癌(大约2 - 3海里26]。LNCaP细胞可能应对这种快速glucuronidating和流出多余的Te。SHBG的类固醇含量(菲茨杰拉德产业国际)没有指定;然而这是纯化从孕妇的血清含有显著降低Te比成年男性(3,27]。即使所有的血清Te进行,最大浓度使用SHBG的Te(125海里)将远低于1海里,显著小于用于我们的实验。重要的是,SHBG治疗没有显著影响基因表达相比,未经处理的控制。

进一步探索细胞内生物的行为SHBG SHBG Te响应基因的影响。如预期Te调节PSA mRNA的表达。然而,尽管显著降低细胞内Te SHBG的存在,除了结合Te SHBG进一步增加PSA mRNA的表达。Te AR mRNA表达的差别同样,对这些也进一步提高当细胞与SHBG和Te孵化。添加SHBG SHBG的差别还进一步降低了Te对这些基因的信使rna虽然在这些条件下,减少没有达到统计学意义。在这个实验中细胞Te SHBG水平较低的比Te单独添加;然而对基因表达的影响要大得多。此外,最大的影响基因表达时达到较低浓度的Te SHBG在场。细胞内的表达在SHBG老鼠近端小管细胞也已被证明能够延长雄激素反应基因的表达(10在LNCaP SHBG)和超表达的细胞已被证明影响雌激素和雄激素反应基因的表达(28]。这将表明,内生SHBG表达时和内化SHBG有类似的积极刺激对雄激素敏感基因表达的影响。

在我们的在体外研究中,Te SHBG基因表达下降。血清SHBG差别一个对这些也会发生在健康男性Te管理(29日]。我们推测,在病理条件下血清SHBG降低,例如,在超重和肥胖的男人(30.- - - - - -33glucuronidation], Te吸收,射流会增加可能加剧Te不足。

在目前的研究中Te治疗没有促进细胞生长,事实上的剂量依赖性抑制增长证明了38小时后在文化。Coincubation SHBG与预防Te抑制细胞生长。两相的影响细胞增殖曾被描述在扩散增加0.3 nM DHT然后逐步减少浓度提高时高于0.3 nM DHT (23,34]。了双氢睾酮的抑制作用被废除的人类血清(34SHBG]或[23]。合成雄激素的影响methyltrienolone (R1881), SHBG束缚不佳,不受添加(SHBG23]。其他合成雄激素显示类似LNCaP细胞抑制作用导致形态变化和集落形成的抑制;然而这些影响没有复制在前列腺癌雄激素受体阴性细胞行曲泽,DU145, MRC-5。此外,添加抗雄激素药物(6-chloro-6-dehydro-17x-acetoxy-hla、醋酸环丙孕酮和hydroxyflutamide)恢复LNCaP细胞生长(35]。所有这些研究表明,抑制是通过一个基于“增大化现实”技术的途径。在目前的研究中引人注目的细胞形态学的变化表明,细胞可能会强调,或许是由于glucuronidate高水平的细胞内Te的要求;然而先前的研究不包括细胞形态的描述来做个比较。Te的机制抑制细胞生长在LNCaP细胞38小时后是未知的。不管细胞融合的比例开始治疗,Te总是引起形态变化(数据未显示)。这也许表明,Te对细胞形态和附件产生影响,而不是直接在细胞增殖。然而,抑制细胞生长的Te需要进一步调查。

5。结论

在这项研究中,我们已经表明,在缺乏大量的Te SHBG迅速进入细胞,他们灭活结合葡萄糖醛酸和流出。SHBG的然而,虽然有减少Te吸收,glucuronidation Te的流出也减少和Te对雄激素敏感基因的影响增强。这在体外研究SHBG的作用可能有重要的临床意义,这样,雄激素缺乏的评估在活的有机体内应该不仅依赖于测量总Te的孤独而且血清SHBG水平的评价。

这些研究结果清楚地表明,SHBG中扮演一个重要的监管和胞内角色修改Te代谢和功能,促进细胞生长。这些观察需要确认在其他雄性激素敏感的组织。如果一致的效果了,它将极大地改变我们目前的理解SHBG在健康和疾病的作用。

相互竞争的利益

作者没有利益冲突声明。

确认

这项工作是支持由皇家布里斯班和妇女医院的研究基础和科学教育和研究信托基金。作者要感谢约翰·加里根和Sheree Bazelley化学病理学系的昆士兰健康,执行SHBG Unicel化验。

引用

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